具高生长速率杜氏藻突变藻株及其复合诱变选育方法

专利名称：：具高生长速率杜氏藻突变藻株及其复合诱变选育方法
技术领域：
：本发明涉及微生物工程领域，具体而言，本发明涉及使用紫外线诱变与高温高光强处理选育杜氏藻的方法，以及由所述方法得到的一株具有高生长速率的杜氏藻诱变株ENN0001-1。
背景技术：
：由于化石能源的日趋减少以及使用化石能源造成的环境污染的加剧，使科研工作者把注意力集中到可再生能源的开发利用上。在各种可再生能源中，具有广泛实用价值的能源是生物质能。生物质是地球上最普遍的一种可再生能源资源，它包括林业生物质、能源作物、水生植物、农业废弃物、城市垃圾、有机废水和人畜粪便等。在生物质的循环利用中，生物质转化产生的碳与植物生长所吸收的碳的量几乎相等。因此生物质的利用不会造成大气中C02的增加。生物质燃料中硫含量极少，不会排放导致酸雨的二氧化硫；而且生物质燃烧产生的灰分较少，这些灰分还可用作农作物肥料。目前，在世界能源消耗中，生物质能占14%,在发展中国家占40%以上。1993年，世界粮农组织(FAO)预测，到2050年，以生物质能源为主的可再生能源将提供全世界60%的电力和40%的燃料，其价格低于化石燃料。藻类是最低等的、自养的放氧植物，它是低等植物中种类繁多、分布极其广泛的一个类群。无论是海洋、淡水湖泊等水域，或是潮湿的土壤、树干等处，几乎在有光和潮湿的任何地方都能生存。微藻是指一些微观的单细胞、群体或丝状的藻类，大多数是浮游藻类，生物量大、分布广。地球上的生物每年通过光合作用可固定8X10、碳，生产1.46X10"t的生物质，其中40%应归功于藻类的光合作用。科研人员已逐步认识到，微藻作为生物能源，具有多方面的开发价值:繁殖快且所需养分不多，主要是阳光、水和C02，不会与农牧业争地；相对于其他植物，藻类含有较高的脂类、可溶性多糖等，可以用来生产生物柴油或乙醇，还可望成为生产氢气的一条新途径；同木质纤维素材料相比，藻类的光合作用效率比树木高；易被粉碎和干燥，预处理成本较低；热解所得生物质燃油热值高，平均高达33MJ/kg，是木材或农作物秸秆的1.6倍；利用光合作用生长繁殖，捕获废气中的C02，可起到保护环境的作用。要生物质能源利用实现工程化、商业化，就必须保证藻类原料的充分供应。结合我国的实际情况，主要通过如下2条途径来获得藻类原料(1)回收利用富营养化水体中的浮游藻类；(2)大规模户外养殖微藻。前者在很大程度上受到地域和自然环境等很多的限制，而后者则依赖于具有快速生长、高效光合固碳和含油率高等优点的藻种的获得。目前，生物能源产业不断兴起，通过传统方法驯化筛选优良藻种周期较长，但辅以紫外诱变等技术改变生物本身的基因，通过多步筛选确定，有希望得到具有稳定优良性状的可用于产业化的种系。杜氏藻是世界范围内高盐环境的主要初级生产者，从发现至今己有百余年的历史。杜氏藻为单细胞的真核生物，双鞭毛，单核，没有细胞壁，新陈代谢旺盛。杜氏藻的研究价值主要体现在以下几个方面(l)由于杜氏藻是最耐盐的真核生物，是进行植物耐盐生理研究理想的模式生物；(2)杜氏藻富含胡萝卜素及高蛋白，可以直接作为食品，或作为精细化工生产胡萝卜素的原料；(3)是抗性基因的供体；(4)可以作为表达外源蛋白的新型生物反应器；(5)杜氏藻是高盐环境的主要初级生产者，具有重要的生态意义；(6)某些杜氏藻总脂含量较高。紫外线对高等植物具有较强的生物学效应，能够在农业上进行诱变育种，具有操作简单、经济等优点。紫外线育种技术在藻类中已有大量报道，已报道紫外线在小球藻、螺旋藻等诱变育种中都起到很大作用，但在杜氏藻中报道较少。此外，我国沿海地区是微藻生长的主要环境，但这些地区大都具有高温高光的特点，如何提高微藻在这些地区的生长速率和增加经济效益是微藻养殖的关键问题，对于微藻的高光和高温筛选已有一定报道，但对于杜氏藻的紫外诱变和高温高光处理联合的复合诱变，并针对生长速率进行筛选的方法还未见报道。本发明待解决的技术问题目前，基于杜氏藻在生产营养品、甘油、生物柴油以及食品和动物馎料方面的功用，其己成为世界重要的养殖藻类之一。但是微藻大规模养殖仍然面对成本高，生物量累计较为缓慢等一系列问题。因此，在自然选育之外，通过生物技术手段诱变藻株，针对生长速率筛选杜氏藻突变株就显得尤为重要。此外，目前用于藻类育种的诱变育种技术筛选时间较短，通常只经过一次筛选，得到的突变藻株遗传稳定性相对较差，容易出现回复突变。本发明正是面对这一技术难题，通过紫外线照射和高温高光处理复合诱变杜氏藻0"加//6//"^力0/￡""，并以OD75。值作为衡量生长速率的指标，具有快速便捷的特点，保证了在一定数量的筛选量；而通过多步逐级筛选的方法进一步保证了微藻优良性状的稳定性，即最终获得的优良藻株是在不同规模的培养体积和容器中均有较高的生长速率，为进一步开发利用生物质能源大规模生产奠定了基础。基于此，本发明的一个目的是提供通过紫外线照射和高温高光处理复合诱变杜氏藻D朋^W/"^"o/ecto的方法，及利用多步逐级筛选方法确保突变株优良性状的稳定表达，摒除在一次筛选得到突变株回复突变的可能性。本发明的另一个目的是提供具有高生长速率的杜氏藻er/o/ecto)突变株
发明内容-在本发明的一个方面中，本发明提供紫外线照射和高温高光处理复合诱变选育高生长速率杜氏藻的方法，所述方法包括下列步骤a)取杜氏藻野生藻株作为出发藻株；b)将所述出发藻株接种在培养基中，置于光照培养箱中进行培养；c)将上述得到的杜氏藻野生株培养物在紫外灯下照射进行诱变后，无6光暗培养，各取诱变藻株和原出发藻株，在强光下照射进行高温筛选，其间间断补充一定量的培养基；d)将高温筛选后存活的藻细胞涂布在平板上，挑取生长迅速的单藻落光照培养后分离保存；e)进行高生长速率的藻株的初筛f)进行高生长速率的藻株的复筛。在一个实施方案中，所述杜氏藻野生藻株为UTEXLB999。在一个实施方案中，所用的培养基为Erdschreiber'sMedium(简称EM)土首养基。在一个实施方案中，进行紫外诱变的杜氏藻培养物处于对数生长期。在一个实施方案中，所述正常培养条件为..25°C，40001ux，12hL/12hD。在一个实施方案中，所述紫外诱变采用避光操作，以2个20W紫外灯管作为紫外诱变的光源，距离30cm，照射75s。在一个实施方案中，所述无光暗培养为在25"C无光培养3天。在一个实施方案中，所述高温为37X:至45'C。在一个实施方案中，所述强光的光强为10000Lux-50000Lux。在一个实施方案中，所述初筛步骤为从原始保存平板上挑取上述单藻落经过一次固体培养基上的培养活化，分别接种到液体培养基中，在细胞培养板中培养，在传代中调整同样接种数量，再经过一代在细胞培养板和两代透光玻璃容器中的培养，逐级选育在正常培养条件下生长迅速的藻株。在一个实施方案中，所用的细胞培养板为12孔细胞培养板。在一个实施方案中，所述复筛步骤为初步筛选确定的高生长速率突变藻株作为复筛的对象，与野生株一起进行一轮复筛从而确定突变株优良性状稳定表达的藻株。从原始保存板上挑取初筛确定具有较高生长速度的藻株经过一次固体培养基上的培养活化，分别接种到液体培养基中，培养一段时间后调整同样接种数量传代于新的透光玻璃容器中，经过三代在透光玻璃容器中传代培养，逐级选育确定具有高生长速率的藻株。在一个实施方案中，所述透光玻璃容器是三角瓶。在一个方面，本发明提供高生长速率的杜氏藻突变藻株，其由上述诱变选育方法生产。在一个实施方案中，所述杜氏藻突变藻株为保藏编号为:CGMCCNo.2981的杜氏藻突变藻株ENN0001-1，所述突变藻株是杜氏藻野生藻株UTEXLB999由紫外线照射和高温高光处理复合诱变选育的，所述诱变藻株在相同条件下生物量(OD75Q)较野生株提高了17.6%，叶绿素含量(OD68。)较野生株提高了8%。在一个方面中，本发明提供上述杜氏藻突变藻株用于大规模培养杜氏藻以及用于生产类胡萝卜素、胡萝卜素、维生素E、维生素C、甘油、油脂和生物柴油的应用。在一个实施方案中，所述突变藻株是保藏编号为CGMCCNo.2981的杜氏藻突变藻株ENN0001-1。本发明所说的用紫外线照射和高温高光处理复合诱变选育高生长速率杜氏藻的优选方案如下1、配制培养杜氏藻的Erdschreiber，sMedium(简称EM)培养基；EM培养基的组成和配制如实施例1进行；2、将上述EM培养基分装封口；3、把封装好的上述培养基灭菌；4、取出灭过菌的培养基，冷却至室温后，取杜氏藻接种在无菌培养基中；5、将培养液置于光照培养箱中培养；将藻株从平板上接种至100ml三角瓶中，置于光照培养箱中于正常培养条件(25°C，欄lux，12hL/12hD，以下相同)培养至指数生长期。6、取处于对数生长期的杜氏藻，倾注于培养皿中，置超净工作台中紫外灯下照射进行诱变后，无光暗培养；取3mL藻液至直径3.5cm无菌培养皿中，加搅拌子搅拌，避光操作，以2个20W紫外灯管作为紫外诱变的光源，距离30cm，照射75s;关闭紫外灯，加入17ml培养液，盖上培养皿盖，用锡纸包好，在25。C无光培养3天；7、将暗培养后的藻液置于光照培养箱中培养暗培养后的藻液和新鲜培养基按i:i的比例在250ml三角瓶中混匀，在光照培养箱中培养10天。此藻液和新鲜培养基按1:50的比例重新接种于250ml三角瓶中，原藻液按l:3的比例重新接种于500ml三角瓶中；8、各取诱变藻株和原出发藻株，在夏季强光下照射进行高温筛选，其间间断补充一定量的培养基；重新接种的藻液和原藻液一起进行高温高光处理，选择5月晴天，每天从10时至16时将上述藻液置于室外花岗岩石板上，高温高光强暴晒进行处理(温度为37。C至45。C，光强为10000Lux-50000Lux);每天16时后取回藻液置室内光照培养箱中于正常培养条件下继续培养。每6天补充50ml新鲜培养基，18天后处理结束；9、将高温筛选后存活的藻细胞涂布在EM平板上，挑取生长迅速的单藻落光照培养后分离保存；测定藻液OD75Q，用培养液稀释至OD，为0.001，取100ul稀释藻液铺固体EM培养基平板，于正常培养条件下培养至生长出单藻落，将单藻落挑取并于平板上保存，得到90株诱变藻株。10、高生长速率的藻株的初筛从原始保存平板上挑取上述藻落经过一次固体培养基上的培养活化，分别接种到液体培养基中，在细胞培养板中培养，在传代中调整同样接种数量，再经过一代在细胞培养板和两代透光玻璃容器中的培养，逐级选育在正常培养条件下生长迅速的藻株。具体操作步骤为通过12孔细胞培养板培养可以进行大量藻株的筛选，同时经过多步逐级筛选以确保优良性状的稳定表达。上述经分离后平板保存的90株诱变藻株经转接一次固体培养基平板活化，接种于12孔细胞培养板中，每9孔添加4ml液体培养基EM，在正常培养条件下培养。在12孔细胞培养板中培养10天后，测量OD75o值，调整同样OD"o值传代接种至新的12孔板中，生长8天后，测量OD75o值，挑选OD75。值较大的调整相同OD75Q值传代接种入100mL三角瓶中，每瓶中添加40mLEM培养基。正常条件下培养10天后，测量OD"。值，选择OD75o值较大的藻株取20mL藻液添加180mLEM培养基接种于500mL三角瓶中。培养10天后，测量00750值，最终得到生长迅速的32株诱变藻株在固体EM培养基平板上保存。11、高生长速率的藻株的复筛初步筛选确定的高生长速率突变藻株作为复筛的对象，与野生株一起进行一轮复筛从而确定突变株优良性状稳定表达的藻株。从原始保存板上挑取初筛确定具有较高生长速度的藻株经过一次固体培养基上的培养活化，分别接种到透光玻璃容器中的液体培养基中，培养一段时间后调整同样接种数量传代于新的三角瓶中，培养末期l:IO扩培传代，经过在透光玻璃容器中三代培养，逐级选育确定具有高生长速率的藻株。具体操作步骤为经过初筛得到的生长迅速的32株诱变藻株经过复筛进一步筛选，并经过多步筛选步骤确定其优良性状的稳定表达。上述经分离后平板保存的32株诱变藻株经转接一次固体培养基平板活化，接种于添加20mlEM培养基的100ml三角瓶中。于正常培养条件下培养10天，测定OD75Q值，并调整相同OD7so值为0.1接种传代于新的添加20mlEM培养基的100ml三角瓶中，每株设三个平行样。正常培养条件下培养十天后，测量OD75Q值，并取10ml藻液添加90mlEM培养基(1:10接种)传代于500ml三角瓶中，每株设立三个平行样。正常培养条件下培养十天，测量OD75o值，经过前述三次传代培养，确定诱变株系中生长迅速的突变藻株ENN0001-1。通过上述方法，本发明得到较野生株生长速度更快的D柳WzW/afeW/o/ecto诱变藻株ENN0001-1，将其于2009年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCCNo.2981。由图1可见诱变株系在复筛培养结束后生物量(OD75Q)较野生株提高了17.6%，叶绿素含量(OD680)较野生株提高了8%。发明效果国内外有采用紫外线诱变技术选育微藻突变体，但尚未有研究针对杜氏藻"w""/zWto^r"'o/wto筛选耐受高温高光并具有高生长速率的藻株。国内有专利报道利用紫外线诱变选育耐高温巴氏杜氏藻，但并未涉及相关生长速度方面的研究。针对这一空白，本发明针对单细胞微藻D朋^W/afeWo/ecto进行复合诱变，诱变方式采用紫外线照射和高温强光处理联合，在回复正常培养条件后以微藻生长速度为指标进行筛选，最终获得较野生株生长速度更快的诱变藻株ENN0001-1。由图1可见诱变株系在复筛培养结束后生物量(OD75。)较野生株提高了17.6%，叶绿素含量(OD68())较野生株提高了8%。图1为诱变株ENN0001-1经复筛后在筛选、培养结束后的OD值变化(百分比)。横坐标为诱变藻株株系，纵坐标为培养藻株OD值变化，在单细胞绿藻中，OD咖代表叶绿素含量的变化，OD75Q代表生物量的变化。实施例实施例1高生长速率的杜氏藻诱变株的筛选以Z)M""//e//a^Wo/ecto野生株UTEXLB999(购自UniversityofTexas)为出发藻株，进行紫外诱变，随后于室外高温高光暴晒(温度为37。C至45。C，光强为10000Lux-50000Lux)，生长良好，分离并传代培养后保存。将上述诱变藻株活化后于人工气候箱中于正常培养条件(25r，40001ux，12hL/12hD)下经过多步筛选，使用WFZUV-2102PC型紫外可见分光光度计(购自尤尼柯仪器有限公司)测定藻液750nm处OD值为衡量指标，逐级筛选出具高生长速率的诱变藻株。培养液的组成及其含量如表1所示，在配制培养液时，将某些成分以ii固体形式加入蒸馏水中，某些成分会事先配成50-1000倍的母液，使用时再按需稀释配置成培养液。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>将藻株从平板上接种至100ml三角瓶中，置于光照培养箱中于正常培养条件(25°C，40001ux，12hL/12hD，以下相同)培养至指数生长期。取3mL藻液至直径3.5cm无菌培养皿中，加搅拌子搅拌，避光操作，以2个20W紫外灯管作为紫外诱变的光源，距离30cm，照射75s。关闭紫外灯，加入17ml培养液，盖上培养皿盖，用锡纸包好，在25。C无光培养3天。暗培养后的藻液和新鲜培养基按1:1的比例在250ml三角瓶中混匀，在光照培养箱中培养10天。此藻液和新鲜培养基按1:50的比例重新接种于250ml三角瓶中，原藻液按1:3的比例重新接种于500mi三角瓶中，重新接种的藻液和原藻液一起进行高温高光处理。选择5月晴天，每天从10时至16时将上述藻液置于室外花岗岩石板上，高温高光强暴晒进行处理(温度为37X:至45X:，光强为10000Lux-50000Lux);每天16时后取回藻液置室内光照培养箱中于正常培养条件下继续培养。每6天补充50ml新鲜培养基，18天后处理结束。测定藻液OD75Q，用培养液稀释至OD750为0.001，取100ul稀释藻液铺固体EM培养基平板，于正常培养条件下培养至生长出单藻落，将单藻落挑取并于平板上保存，得到90株诱变藻株。具高生长速率藻株的初步筛选通过12孔细胞培养板培养可以进行大量藻株的筛选，同时经过多步逐级筛选以确保优良性状的稳定表达。上述经分离后平板保存的90株诱变藻株经转接一次固体培养基平板活化，接种于12孔细胞培养板中，每孔添加4ml液体培养基EM，在正常培养条件下培养。在12孔细胞培养板中培养IO天后，领懂OD75Q值，调整同样OD75。值传代接种至新的12孔细胞培养板中，生长8天后，测量OD75o值，挑选OD75o值较大的调整相同OD，值传代接种入100mL三角瓶中，每瓶中添加40mLEM培养基。正常条件下培养10天后，测量OD，值，选择OD"o值较大的藻株取20mL藻液添加180mLEM培养基接种于500mL三角瓶中。培养10天后，测量OD75o值，最终得到生长迅速的32株诱变藻株在固体EM培养基平板上保存。具高生长速率藻株的复筛经过初筛得到的生长迅速的32株诱变藻株经过复筛进一步筛选，并经过多步筛选步骤确定其优良性状的稳定表达。上述经分离后平板保存的32株诱变藻株经转接一次固体培养基平板活化，接种于添加20mlEM培养基的100ml三角瓶中。于正常培养条件下培养10天，测定OD75o值，并调整相同OD"o值为0.1接种传代于新的添加20mlEM培养基的100ml三角瓶中，每株设三个平行样。正常培养条件下培养十天后，测量OD75o值，并取10ml藻液添加90mlEM培养基(1:10接种)传代于500ml三角瓶中，每株设立三个平行样。正常培养条件下培养十天，测量OD，值，经过前述三次传代培养，确定诱变株系中生长迅速的突变藻株ENN0001-1。将所述突变藻株ENN0001-1于2009年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏号为CGMCCNo.2981。本方法也适用于诱变其他单细胞生物，筛选方法经过初筛和复筛的多步筛选步骤可从大量诱变株系中筛选具有高生长速率性状稳定的单细胞藻类。实施例2筛选得到的突变藻株ENN0001-1的鉴定特征突变藻株ENN0001-1藻细胞呈梨形或椭圆形，长度约6-10jiM，具有2根等长的鞭毛，无纤维素质细胞壁，仅有一层糖蛋白和神经氨酸组成的外膜包裹。在EM、F/2等培养基中均能生长。藻体在液体培养基中分散均匀，可游动。在EM固体培养基上生长良好，5-7天即可形成明显的单藻落。藻落成规则的圆形，藻体呈黄绿色。实施例3筛选得到的突变藻株ENN0001-1与野生型藻株的生产速率比较由图1可见突变藻株ENN0001-1与野生型藻株UTEXLB999在复筛完成后的生物量(OD75())和叶绿素含量(OD68Q)。正常培养条件为25°C，40001ux，12hL/12hD。复筛步骤为经过初筛确定的诱变藻株经转接一次固体培养基平板活化，挑取单藻落接种于添加20mlEM培养基的100ml三角瓶中。于正常培养条件下培养10天，测定OD，值，并调整相同OD75()值为0.1接种传代于新的添加20mlEM培养基的100ml三角瓶中，每株设三个平行样。正常培养条件下培养十天后，测量OD75。值，并取10ml藻液添加90mlEM培养基(1:10接种)传代于500ml三角瓶中，每株设立三个平行样。正常培养条件下培养十天，使用WFZUV-2102PC型紫外可见分光光度计(购自尤尼柯仪器有限公司)分别测定藻液750nm和680nm处OD值为衡量指标。具体如下(1)ENNOOOl-l与野生株在复筛中以相同培养起始浓度接种生长10天后，1:10传代培养于新鲜EM培养基中生长十天后，生物量(OD，)较野生株提高17.6%。(2)ENN0001-1与野生株在复筛中以相同培养起始浓度接种生长10天后，1:10传代培养于新鲜EM培养基中生长十天后，叶绿素含量(OD680)较野生株提高8%。权利要求1.由杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)野生藻株UTEXLB999突变的，保藏编号为CGMCCNo.2981的杜氏藻突变藻株ENN0001-1，其特征在于，其是由紫外线照射和高温高光处理复合诱变选育的，并且所述诱变藻株在相同条件下生物量(OD750)较野生株提高了17.6％，叶绿素含量(OD680)较野生株提高了8％。2.—种紫外线照射和高温高光处理复合诱变选育高生长速率杜氏藻的方法，所述方法包括下列步骤a)取杜氏藻野生藻株作为出发藻株；b)将所述出发藻株接种在培养基中，置于光照培养箱中进行正常培养；c)将上述得到的杜氏藻野生株培养物在紫外灯下照射进行诱变后，无光暗培养，各取诱变藻株和原出发藻株，在强光下照射进行高温筛选，其间间断补充一定量的培养基；d)将高温筛选后存活的藻细胞涂布在平板上，光照正常培养后挑取生长迅速的单藻落分离保存；e)进行高生长速率的藻株的初筛；f)进行高生长速率的藻株的复筛。3.根据权利要求2所述的方法，所述紫外诱变采用避光操作，以2个20W紫外灯管作为紫外诱变的光源，距离30cm，照射75s。4.根据权利要求2所述的方法，所述高温为37'C至45。C。5.根据权利要求2所述的方法，所述强光的光强为10000Lux-50000Lux。6.根据权利要求2所述的方法，其中所述初筛步骤为从原始保存平板上挑取单藻落经过一次固体培养基上的培养活化，分别接种到液体培养基中，经过两代细胞培养板和两代透光玻璃容器中的培养，在传代中调整相同接种浓度，逐级选育在正常培养条件下生长迅速的藻株。7.根据权利要求6所述的方法，其中所用的细胞培养板为12孔细胞培养板。8.根据权利要求2所述的方法，其中所述复筛步骤为从原始保存板上挑初筛确定具有较高生长速度的藻株经过一次固体培养基上的培养活化，分别接种液体培养基中，经过三代在透光玻璃容器中传代培养，逐级选育确定具有高生长速率的藻株。9.权利要求1的杜氏藻突变藻株用于大规模培养杜氏藻、以及用于生产类胡萝卜素、(3-胡萝卜素、维生素C、维生素E、甘油、油脂和生物柴油的应用。全文摘要本发明采用紫外诱变和高温高光联合对Dunaliellatertiolecta进行复合诱变的方法，在正常培养条件下以微藻生长速度为指标进行筛选，最终获得较野生株生长速度更快的诱变藻株ENN0001-1。诱变株系在复筛培养结束后生物量(OD₇₅₀)较野生株提高了17.6％，叶绿素含量(OD₆₈₀)较野生株提高了8％。文档编号C12P17/06GK101597571SQ20091013664公开日2009年12月9日申请日期2009年5月11日优先权日2009年5月11日发明者洪吴,尹顺吉,王媛媛,蔡忠贞,袁普卫,平邓申请人:新奥科技发展有限公司