孢子纲物种体外培养的方法及其用途的制作方法

文档序号:594376阅读:382来源:国知局
专利名称:孢子纲物种体外培养的方法及其用途的制作方法
孢子纲辦中体外培养的方&S其用途
5本申请是申请号为03811387.2,发明名称为"孢子自种体外i歸的方法 及其用途"的发明专利申请的分案申请。 发明领域
本发明涉及孢子纲(Sporozoea)及期中属的成孢預原生动^3^對歸的培 养体系和方法。本发明还涉朋本发明的i歸体系和方法制成的鹏子和卵毅 io相魏子纲生嫩段细胞,鹏苗、检定和其4柳ii^用。
背景技术
孢子纲原生^)^括鹏讀原生鹏其中许多是导致全世界人和^ 病的病源。其中有^t^的商业皿的是由孢子纲的球M纟冈(Coccidia) 、 虫目(Eucoccidiida)和艾美球虫亚目(Eimeriina)引起的疾病,以及由成孢, 15原生动物的^m^M (Cystoisospora)、艾美球虫属物种(Eimeria) 、 ■, 虫属(Isospora)、新孢子虫属(Neospora)、肉孢子^M (Sarcocystis)、弓勉 属(Toxoplasma)、辦属(Tyzzeria)禾口温矛繊虫属(Wenyonella)引起的麵。 特别是,球,是由球AM、艾美球^M辦中原生动吻寄生虫引起包括家 畜如家禽在内的动物所患的一种 。这些专性细胞内原生动物寄生虫主要 20在肠上皮复制。此类寄生虫具有輔主的生活周期并展现出髙度的宿主性禾離织
特异性。总的说来,由于球鹏和预防药物费用的総损失,受其影响的:tt每
年蒙CT大的经济损失。
家 ^传染的经济影响在养鸡业中体现得尤为严峻,因为养鸡业密集的 禽舍会加快疾病的传播。球顿纲感染使得禽类例如家禽及其他别醉的鸟类生长 25纖和表皮色條而i^l圣游员失。另外,多数艾魏球虫可以经由口腔途径和/ 或从环境吸入传染的微粒感染单宿主。一旦吸入,寄生虫穿透并损害肠^^M1 而弓胞急隨病,例如,导致魏染的禽类生长缓慢和1^斗利用性陶氐。
艾美球虫属物种、^fe,^、 ^m^属或隐孢子虫属(Cryptosporidium) 原生动物仅需要单宿主即可^它们的生劍盾环。在自^j牛下,从环境摄TO 30成孢子的卵囊开始生命周期。摄取成孢子的卵囊的细M被胃IHM破坏柳鹏酶消化而破碎。生物体感染期的孢子,孢子囊内。孢子体侵AM^膜M他, 的薄壁细胞。该感染隨跡包舒中属的特征。
在宿主^的细胞内,孢子体发育成也被称作,体的多核分,。各分裂 i^亥成^A被称作裂殖子的感染体,也就Ji^A新的细胞并重复该娥呈。在无 5数的无性世代以后,,子发育成为小配子母细 ^配子。小配^细 育 成能依次使大配子受精的许多小配子。最终的^^1^^ ^的细 卜膜包在 囊内,然后被称作卵默成孢子f繊雜排,中。顿当的环境下,卵歡育 成孢子并可以传染。皿易感的动M专,后重复该循环。
球顿洲专染弓胞一禾術异性免疫。例如,有W中已知的球顿舰以感染
io嫩鸟,其中7^中被认为能^^普通状态到急',病。
因此,在别薛的鸟类中,引入另夕卜的球顿纲或以前未出现的鸟类可以导致 i^的爆发。卵囊育撮大P艘防御PH、去垢剂、解朊、,、月旨肪儘酶、机 械破坏(尽管它们可以被实验室的方法破坏)禾,如次氯,和重铬,的化学 制品,并可在宿主外鹏活多个星期。例如,有W中已知的球顿舰以感鄉 15鸡,其中7^中被认为能^^普通状态到急1^病。
多种方法t^刺tt禽对球^M纲免疫。所有^J力的商业方法均是基于对被 包在囊内通常带减毒株的活原生虫给药。尽管已经习惯^ffi其^i径,但最常规 的接种途径还是口服。在美国专利US3, 147, 186中,Edgar指出可以MM口服 给药能存活的魏艾美球虫(E. tenella)成孢子卵囊雌4^种疫苗。在美国专利 20 US4, 544, 548中,Davis等教导一种不管繊虫药物蹄 ^麵 ^ 给药少,孢子的卵囊接种疫苗的方法。
在嫩鸟体内可以M3ii^卖传f^;减毒.美国专利US5, 055, 292已经描述 了卵,期形成的球^3E^株系的选辦贓毒,i^^&lt引入作为参考。
口月齢药孢子囊减Wl^鹏用于预防球鹏的效免疫性。 [ShMey的美国 25 专利US4,438, 097; McDonald的美国专利US5,055刀2和Schmatz等的PCT.WO 94/16725]。在Jenkins等AvianDis., 37 (1) : 74 82(1993)中公开了减毒的另一种
方法,它教导WS射M的孢子体口月隙药以防止卵片发育。
接种疫苗的非肠道途径包括皮下或腹腔注射脱囊的孢子体(见Bhogal US4,808,404; Bhogal等US5, 068, 104)和体内注射卵囊或孢子囊(见Evans等, 30 PCTWO96/40223; Watkins等,Poul Sci., 4(10): 1597402 (1995)) 。 Thaxton,us 5,3ii,84i教导一种舰卵黄^il^e卵^^孢子條药到刚孵出^D:鸟舰
球^M^种疫苗的方法。
需要对能存活的原生动物接种疫苗是当前所有接种疫苗方法中的一个共同 要素。因为需要预防临床传染,使不能存活的原生动物舰生^TO^具有高度
5免疫性的方法未能取得^I力。
舰以前,B^先絲被感染的活鸟处获取能存活的活原生繊如卵囊。
然而,禾,活的动物或一辦顿纲种属的鸡卵*^#用于疫苗^的能存活的 球鹏R细胞的方法既昂贵又低效。
人们已经长时间寻求一种培养疫苗生产及其他目的所需大量球虫亚纲的高
io效经济的^f戈方法。B^^i^^M^体外歸,fiitMW限。B^有马-达氏 牛肾(细胞)(MDBK)支持艾魏球虫体外生长附隨,但是iMl^P艮在无隨 育的复制周期[D.M.Schmatz, Adv, Cell Culture, 5:241 (1987)]。当得自原始宿 主的I^I子用作接禾糊的时候,可以获得来自E. acervulina [M. Nacri-Bontemps, Aim.rech. Vet, 7 : 223(1976)] 、 EmeleagrMtis[Augustin等,J.Protozool., 25:
15 82, (1978)]禾卩E.bovisSpeer等,Z. Parasitenk-d, (1973)]的艾美球虫属顿中卵囊。 然而,如上所述,应用得自感染鹏组织的鹏子的必要剝牛限制了这些方式的 有效性。
美国专利US5, 846 , 527指出鸟^皿 于支持,艾美球虫和毒害艾 美球虫(E.necatrix)生长的变态胚'幽织,但是复帝股被维持72小时。另一W章 20碍是如果用于制造活菌苗,得自維鸟的无限增殖l:^胞会产生出转移肿瘤至l胸鸟 的风险。
鹏子的剤艮传代已被获知。例如,在美国专利US6, 500, 438中, <顿 D. J. Doran, J. Parasit57 :891-900, (1971)中蹈ij的一禾中M的方法,孢子体被 感染进入出生一天的雏鸡肾细胞(PCK),该细胞在作为细皿合体的:t,吻中 25生长。然而,Sm种方法产生的鹏h旦被释放,i縛即被终止。5赃的意 见是,艾美属球虫会显现出同步的生长发育,因此不兽娥导产^I子的无P艮增 殖系。即,在相对短的时鹏,在卵囊的释^MI呈中,鹏子的无限增殖系不会 终止。
所以, 一种能获得充足的球,纲细胞供疫苗^及其他的研究使用的高效 30经济的方法还有着各种长期的需求。自子在无限增殖比哺乳自细胞上的体外生长的方法将令人期待。然而,如上所述,,适当宿主细胞的体内培养体系早 己用至赇虫亚纲无性阶段的无限繁殖中,即,鹏TO根据需要就能引起感染阶 段的转化。
此处对任何文献的引用不应被理解为将这些参考文献视为本申请可获得的 5 "现有狱"。 发明
本发明皿提供一种用于在无性发育阶段连续培养专性细胞内孢子纲原生 动物的方法来解决i^提出的问题以及其他问题。本发明的方跑括以下步骤-
提供包含适合孢子纲物种生长的无限增殖比宿主细胞的细胞i,体系, 效感
10染宿主细胞的条件下,将感染阶段的孢子自中和宿主细胞撤虫,引起在宿主细
胞内的IM子生长,其中宿主细胞^lii吞噬作用掺入该原生动物。
此处提供的本发明方法和培养体系用于生产以前不能获得量的孢子纲原生
微的卵囊、鹏子与/和其ft^^l^段。如雌的鹏细胞具有多种用途,包括
提供包含在动物用活疫苗中存活的孢子纲细胞,和易于获得经济量的孢子纲蛋白
15质禾tV離亥酸、用于倒贿用目的的细胞,如用于诊断、蛋白质鄉、生物肝学
种或生物体基因研究,等等。
该细胞培养体系包括适合维持宿主细胞和培养物中的孢子纲物种的生长培 养基。可以j柳适于戶;M择的宿主细鹏的樹可:t歸基。
在一4^的实驗案中,生长i歸敏舰原剂,戶;f^ias原剂呈例如能有 20效将孢子纳物种在无限培养中保持在其中生殖是无性的生命周期阶段的浓度。可
以4顿适于本:t歸体系的樹可还原抓例如,以徵于约0.01M).05mM的P-巯 基乙醇的浓度。
,的宿主细胞是源自哺乳动物网状内皮细胞的保持吞噬细胞活性的无限 增殖比细胞,例如源自雜细麟的无限增殖tl^ffl鹏。 25采用本发明方法和培养体系培养的优选的生物体是仅自然感染单一,宿
物:例如,这些原生^^括感染鸟类的球虫禾IV鄉B艾i球虫属辦中,織辦 ^M, ^M属,隐孢子^及其组合。更tt^的是艾美球^物种。
自然感染两种宿主细胞的孢子纲例如新孢子虫属、弓,属、哈蒙德虫属 30(Hammondia) 、 #[仑克鹏(Freankelia)、贝诺孢子虫属(Besnoitia)和肉孢子
9鹏(Sarcocystis)通常对长期i綠更为敏感,虽然它们可以在本发明的细胞i歸 体系中生长,但3^S子纲不;iMii3^方法生长的im^物体。
动物的抗原生动物疫苗。anf共了鸟ii^^m子纲鄉生糊的鸟类接种的
5方法。
也衝共了包含m^发明培养体系和方法生产的生物体的疫苗组合吻,其中 包括例如一种或多种药学上可接受的佐齐诉松矢鹏中的防腐剂、熟齐嘮。本
发明的疫丽以任意地与t娥7K、 ^WI4或口月隙药的颗粒状物混合。
Itl^卜,本发明提供了使用ilit^发明的方法和细胞i,体系产生的生物体接 io种的鸟类。
本发明i3^f共了一种筛选破坏誦鹏子纲原生鹏生长的活性齐啲方法, 包括在与^与戶;ff帝选的活性齐ij^虫的情况下,iiiihM方法i^该孢子纟f^/种, 并检测相对于不^该活性剂的生顿生诚生存能力的螩怖用。
发明详述
15如前戶M,本发明提供了包括宿主细胞的培养体系和体外基對^孢子纲类 成孢子囊原生动物的方法。a^f共了il3tt发明i歸体系产生的原生^细胞, 例如孢子纲自子种或卵^TO^it原物质。这样的物质可以被用于需要预防孢 子纲感染的,B人类、鸟类和包括家禽在内的家畜的抗孢子,种疫苗的生产。 因此,本发明衝共了能无P艮维鹏子纲细胞无性阶段或充分延长体外期限的 20细胞i綺体系和方法,从而能^itb类的细胞的^经济有效。
本发明的培养体系和方法可产生可存活的和有毒的即感染性的成孢子囊原 生动物的培养物群。这些方法通常可用于孢子纲的招可成孢子囊原生动物,尤其 是球虫亚纲更具体而言是真球虫目、还有艾美球虫亚目、以^^fto属、艾美 球虫属、舗子球虫属、新孢子鹏、肉孢子鹏、弓MAM、 属和^ 25虫属的成孢,原生,。
本文^共的方法可考虑用于所有孢子纲并特别用于如感染艾美球^物种、
弓浆虫属、泰泽属、隐孢,虫属、^e^t虫属、哈蒙德虫属、弗伦克虫属、
贝诺孢子,的所有鸟类的球虫目卵囊i^。体外 方法可以#^柳或补, 于、赫物的生长称或测定具有所 际的寄生虫的宿主辦中。 30在一彿别雌的实 案中,例如,本发明对预如艾美球虫属、鞭子和其它需要相似单宿主细胞的原生动物的体外 培养是有用的。由于这些原生^^^,的宿主细胞有#^的受体,并且特
异性地不会感染其它细胞,因而斷歸这些细鹏加了鹏。如前面所超啲,
这些原生^tt异眺需要一个单一宿战^^它们的生命周期。
5 相舰,其它孢子鹏需^M个宿主来^^它们的生命周期。例如,新孢子
虫,弓浆虫属,弗伦克虫属、贝诺孢子鹏、線德鹏和肉孢子鹏需要两个
宿主来完成它们的生命周期,并且已经证明这些在无限增殖y^胞,中维^
点,困难,例如,见Dame等.,美国专利申请No. 2002/0115828Al,其中描述 了神经元肉孢子虫属的,,所公开的内# 引入作为参考。 10 在体外长时期的i辯原生繊需要一个非常麟的单一鄉的宿主,此前这 已被证明是一个棘手的问题,特另提艾美球鹏、魏 鹏、^Ftel或 隐孢子虫属和其它仅需要一个单一宿主的#^孢子纲类。本发明方法解决了这个 问题,^f共能使这些生物体延长i歸的方法和细膨歸体系。 定义
15为了 ;1 本发明的范围和本质,给出下列定义的术语。
术语"宿主细胞"指在本发明的培养体系所〗^的樹 乳^ 的无限增 殖比细胞。这些是将M51吞噬作用,掺入原生,的"吞噬细胞", 艮P,这类细胞 取需要在土綠体系中供养的原生,,以致原生^^^入一 个吞噬体。例如,本发明考虑采用适合在体外:t錄并将维持目的原生,的樹可
20吞噬细胞系。这離括,例如,源自靴细mS其后代的细鹏,如巨噬细胞, 以及淋巴结网糊胞、鹏口髓、组织溯胞,如中央牛牦5系统的小臓陶卿、肺 泡巨噬细胞、肝巨噬细胞等等。无限增殖比细胞可以《趟自牛、猪、狗、猴、猫、 人、马、羊、i^IV繊的来源,只举出鹏糊来源的一,仔。无限增殖比细 胞与所谓"原生"细胞系的区别在于,它W旌体外无限生长,然而,原生细胞系
25和在体内的彭见一样,但在体外却不肖滩无P,复制。
术语"i歸"标卵S^i子定蹈贿主细胞并且传避噺宿主细胞。优 ■,尽管这,量可以变化,在一个典型的培养体系中原生细胞的id^大 于106个,鹏其他实 案中繊大于109物胞。除非另有说明,本文中的术 语"连续培养",无限繁殖的细胞培养。i^地,对艾美球虫属的培养而言,
30在无性阶段增殖和持续生长的种系培养18 ^g长时间就^3^i音养。更,
ii地,遊彭繊在无性阶段辦卖生长^^战150 ^t更长时间,而且容易 被冷鹏冷冻保存,在再引A51宜宿主细鹏随即恢貌性生长。
除非另有说明,术语"别薛的鸟类"在本刘旨的魏,鸟,灿,鸭,可 捕猎的鸟(包括但不局限于奄鹦,W瞒)禾魄禽(包括但不局限于驼鸟)。
5 术语"M的"^/于原生动物寄生虫的卵 ^段。
术语"孢,"指在卵囊中^S子的囊。纖子化卵囊的MAIiJ鞭中卵 囊的出现的时间就定义为潜伏期。不同的艾美球虫槲中有所不同。
除非另有说明,本文的术语"艾辦鹏辦中"恭^~个棘多个感染别养 的鸟类的艾美球虫属物种。艾美球AM槲袍括那些在嫩鸟中找到的,并且包括
10例如,魏艾美球虫,堆型艾美球虫(E. acervulina),巨型艾美球虫(E. maxima), 毒害艾辦虫,缓艾美球虫(E. mitis),早熟艾美球虫(E. praecox)禾蹄氏艾美 球虫(E. bmnetti)、也包括那些在力鸟中找至啲,并且包括力鸟和缓艾美球虫(E. meleagrimitis)、腺艾美球虫(E. adenoeides) 、 ^0(吼雀艾美球虫(E. gallopavonis)、 分散艾美球虫(E. disperea)、力鸟艾美球虫(E. meleagridis),无害艾美球虫(E.
15 Innocua)、和近圆艾美球虫(E. Subrotunda)也指感染如以上定效的其它家禽的 艾美球虫属物种。术语"艾美球虫属物种"也包括先前所有艾,虫属顿中的所 有株系,包括但不局限于早 系和减辦,其中包括^^射S^t^其它鹏 的株系,致使它们不能完戯育。术语"艾美球鹏顿中"还包括樹可新发现的
株系鄉n以上定組的麟家禽的艾美球鹏物种。
20 除非另有说明,本文中的术语"卵囊"和"l^l子"^能存活的、即活的 艾美球虫属卵囊和鹏子,例如从环境、动物和根据本发明的无限增殖比麟中 获得的。
本文中的"免疫"和"接种"是同义并可以魏4顿。除非另有说明,本文 中的术语"有效免疫剂量"彰^"定驢的卵^^l子,^i^混合时, 一定数 25量的卵囊和鹏子,足以引发接种的鸟类的免i&SiS,例如,抗艾美球AM顿中 抗体效价的提高禾IV自胞介导免疫的活化。更确切地,引发的免^SiSilf^^
性免疫,这能卩艮制或 >接种后的鸟类临床彌舰、1 ^失、魏斜n/舰
亡率,这种接种的雜受了毒性齐懂的^^w的艾美球鹏顿中。 孢子纲来源
30本发明的i歸体系i錄的孢子纲题己矢P^品即感染鄉中辦寻,例如,取自血液、粪便、组织棘自环境污,。如果在样品例如土,品^iM样品中
呈现出的种群主要处于孢预阶段,禾中辦品贝啦照在本:^; 描述的方法简单地
被培养。如果该种群主要处于卵囊阶段,该种群可以舰已知的环境舰方法被 诱导孢子形成,麟1鲷熟知的实验室方法诱导取自该种群的样本进行孢子形成。
5如果该种群辦本主要处于孢子化卵囊阶段,另卩么孢,可以M3U见有狱的已
知方法很容易地获得,例如用玻i^iaii破坏。 卵囊的来源
可以从感染动物的,自织、污染的,或水、土壤、围栏垃圾、床上用 品或其它各种来源获得卵囊。孢子囊的分离方法是已知的。用来分离卵囊的关键 io步骤是,卩,得卵囊的物质并m本领域的^人员将是显而易见的。
以下简要iW^—种應始环境的样品中分离生物体的有用方式,简言之, 第一步是W卜来的物质中分离卵囊。通常iMfflt餅啦7jc溶液制麟、棘^fch il^1滩物,并M液中分离孢子囊。例如,将被,的材料与最少2体积(W/V) t顿QNaCl水溶液混^iM^液。如果有必要,可以在搅拌|0^ 混合器中^ 液
15直到得到均匀的稠度。在4'C将浆液以约800 xg离心10併中。用鹏24x24纱布 过滤收祉清液。通常4顿的由样品纯化卵囊的其幼、鹏括Sheather ^!^魏 法和硫勝辛浮皿,例如,见LRAsh和TCOrihel, Parasites: A Guide to Laboratory Procedures and Identification, ASCP Press 1991, ^jlt引作参考。
过滤后的上清、OT两1^只的tOT7j^^并在4'C以约1600 xg离心10併中。
20用7J^清微立状沉淀的卵囊并如J^M另夕卜离心三次4Et沉淀。然后在2.5%重铬酸 钾中以相同的7K洗涤步骤淸洗卵囊三次。最终清洗后,把卵囊保#^4匸的2.5% 重铬,溶液内棘转移到用于孢子形成的織中。
棘,l续过滤可以用来根据尺寸卵囊。如剰顿过滤,可以按照前述,用 力《口 2.5。/。的重铬^mt冼卵囊。
25 孢子形成
用公知駄方法可能弓拨卵翻子形成。例如,把卵^^在2.5%的重铬, 溶液的容器中并在开口爐棉^^包沫^S就可以^a孢子形成。在28-30°C, 容器以25(hpm在,振娜上摇动48-72小时。蹄,可以不|1 动含有卵囊 的溶液,同时以每小时大约25到75立方M的逸变向溶液中ilA空气J,泡。
30在孢子形成MI呈中,样品蹄规律的间隔被取出并S31離卵囊确定它们是蹄
13有孢殊检验孢子形成。
或者,如果从环境中获得样品,例如地面垃圾,可以^t立W^引起孢子自
然形成(所需要)的适当的水分和、,条件。
在孢子形成后,iS3ia;滤、离心郝领域的狱人员公知的其它可接受的收 5集方絲收集成孢子的卵囊。例如,可以在4'C以约1600xg离心10併中收驗 孢子的卵囊并弃去上清液。浓缩后,成孢子的卵g4'C悬浮在5.25Q/。的次氯勝内 中10併中可以被消毒。消毒后将鹏子的卵驗4'C以1600xg离心或以其它适 合的方^A次氯酸钠中移出。然后用蒸馏7K淸^W&子的卵囊4到6次。清洗后, 成孢子的卵囊可以保^ 2.5%的重铬,,含有30ng/ml庆大霉素的磷Kk缓冲 10淑K(PBS)鄉它鋭的消毒剂中。
成孢子的卵,过公知技术的方法例如机械分裂和/戯卜膜蛋白消化可以被 断裂以获得无外膜的孢子。下面是一种简歡法。简而言之,例如,将如前戶腿 的那對瑰的从环境物质(土^ )中分离出来的成孢子的卵驗PBS中稀 释至浓度约2x 106/mL把lml等你辦的这种PBS加至恰有125m!的0.5鹏鹏 15珠的1.51111'鹏离心管中。然后高3II定糊管5併中。之后在冰上辨P。涡方跪, 取出上清液荆呆留。然后用PBS清洗I^,,留上清液,将其与涡方跪获得 的上清液合并。然后将上清液在约900 xg离心大约2 3併中并弃去上清液。含 孢預的颗粒沉淀! ^雜0.21111的PBS中。再il^顿血球计鹏它确定细 胞数目的方法确定每ml的孢T^度。 20 在宿主细鹏离#^#孢子纲
为方便描述,歸体系被描述定义为分 #体系。狱人员鹏楚该蹄 体系和相关方法易适用于在it^物中生长细胞的其它公知的方法,包括分J, 和遊彭歸体系在内。例如,繊细胞体外生长的^fi公知狱方法的详述见R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Fourth Edition, John Wiley & Sons, Inc.(C) 2000, 25鹏l入作参考。
对于本发明的培养体系,开始的种群可以是自然存在或保持在实验室的种 群。如果该种群主要包含卵囊或孢子化卵囊,且在吞噬^^中^^放的吞噬 细 ^^作宿主细胞,就没有必要依照本发明使寄生,囊。
为使孢子形^/,卩 子的生长,样品中的孢^11^宿主细 ^#—段
30时期,它在*宿主细胞内扩增。这段时期可以变化不同的宿主细鹏ni^l子种类,f跳艾美球AM辦中通常是大约72小时。
维辦歸基是如本W万定义的一种i歸基,它不能被代割旦可每三天加Aff 鲜的培养基。培养的IM子发育成熟并生产卵囊或孢,。培养时间典型的^^勺 4 约30天。例如,产4^l子的典型的i錄时间是约10天,而产生卵囊的典型 5的时间是18天。
特别是如果没有储i纖,并且让其增加密度,另卩么卵囊或孢^ ^大约 18天被释鹏lji歸基中。另外,适当^fi^tl即定期M^细胞密度,i^/就 不断产出l^l子。
舰离心从维擀歸基中获娜豫并鹏令冻,臓^M冷冻千燥保 10存。移去^H辦培养细鹏^^I子,通常限于感染的宿主细胞^^H^只的 约1/20。然后将该^^H^WAfP胰蛋白酶化宿主细胞的亚铺满层。在实验室 的*艰莫^中,鹏子的最佳鄉频率典型的是大约每10天,尽W^将多少随具
体的宿主细胞系、孢子纟,中,禾n/鄉歸体系的嫩IM变。如^l子在两个细 胞系间舰以便肯滩强毒性劍新的宿主株系的毒性,最佳转移时fsm^但不限 is于4天。然后M31樹可飽的她禾^r测^l的原生糊(例如,糊萨鹏)
1^测宿主细胞的感染。相关地,根据样品中原生 的禾號可以估算原始种
群中的原生动物的生存能力。潜肖&t^借助活的鸟类测定可以涉^f性存能力。 活的鸟类测定可以确认体外潜育&^^有效以制^s苗。
在雌的实驗案中,本发明鄉在艾美球虫属槲中的遊對歸中能支持生
20长和脱囊的培养体系。培养体系 ^子种群保持其无性分娜5^万需要长的时 间,同时当需要的时候,t歸体系可以诱^ i子麟,即终ih^l子作为卵囊 用于疫苗或其它用途。本发明的,体系的宿主细胞是樹可适当并经济i^i用于 本发明方法的无限增殖化哺乳鹏细鹏。
在另一^t^的实旨案中,宿主细皿自支持艾美球AM顿中,卩生长
25并且肖嫩在连续培养中繁育的无P艮增殖比吞噬细胞,例如,源于如哺乳繊网状 内皮细胞的无限增殖比细胞。这離括例如,靴细舰其后f^卩巨噬细胞,以 及淋巴结的网状细胞,脾和髓,组织溯胞,中'W申经系统的小鹏细胞,月市泡 巨噬细胞,肝巨噬细胞,磐。无限增殖比细胞可以{瑰自那些源自牛、猪、狗 (例如,ATCC CRL 10389),猴、猫、人(例如,ATCC TIB202)、马、羊、
30鼠(如ATCCTB61)禾P/皿的来源,只举出这样的,来源的一徵仔。至于如何实w^发明并不意(^^会舒iH^ra论或假说的限制,但是据信, 吞噬细胞是培养孢子纲生物体最现想的物质,其中部分是归功于它《i'锵寄生虫细 胞p鹏A^胞内吞噬体的能力。
然而在另一"1^的实 案中,本发明也衝共了一种肖調于鉴定在i歸体
5系中所用的^t的宿主细胞的筛选体系。简而言之,^i的宿主细胞可这样鉴定:
使用如下文所举例的本发明的培养体系,用^1宿主细胞謝切陛实例的牛 细胞系,在替代培养体系中确^l子的相对于用牛靴细鹏鹏啲^^和生 长,其它所有参数是相同淑目似的。誠的宿主细胞如吞噬细胞^ 用于孢子 纲生物体的可用于长期培养无性生殖状态的这数物体的^^和生长,例如,至
10少与作为例示的用于艾美球虫属辦中和相关生物体的牛靴细胞一样獻力。
鄉一步优选的实船案中,在适于戶腿宿主细胞长时间培养、同时也包括
还原齐啲i^S^基中^^主细胞,例如,具有在功肖让等同于约0.01 约0.5mM 的P - 乙醇的还原活性的一定浓度的还原剂。适当的还原剂是指在长期,中 能延长孢子纲生物体寿命的樹可一种还原剂,例如,所鹏子纲生物体包括艾美 15球虫属物种。
在一^t^的ffii的实船案中,依照沐发明,从雌的还原剂中排除二硫 繊瞰"DTT")。
在更WI的实IW案中,本发明提供了一种用于鉴^S用于:t,体系的还原 齐廿的筛选体系。简而言之,^i的还原齐呵这^定^ffi如下^0 ,鹏本发
20明的t歸体系,用fl魏的还原齐附替那些实例的e -鹏乙醇,在^ftt薪体系中, 确^l子的相对于用和不用戸- 乙醇戶鹏啲^^和生长,例如在类似的还 原活性条件下,相对于那些淑力使用P-,乙S猪。适宜的还原齐iTOIf共用于孢 子囊生物体的可用于长期培养无性^l状态的这类生物体的寿命和生长,例如, 对于艾美球虫属物种和相关生物体至少与P -巯基乙醇是一样^c力的。
25 例如,简单地作为实例,鹏的还原剂驗原二硫键的物质,包括e-麟乙 醇、巯基乙胺、2,3-二巯基琥珀酸、青霉胺、P-内鹏、N-乙酰半胱氨酸、抗坏 血舰其等效物种鄉组合。
为了确定最佳的i^l妒能力和絲,狱人员也可以鹏常挪也1顿例 示的细胞培养体系,同时^^择的还原齐鹏度,荆呆持其它参数瞎^Wbg 30宜还原剂的浓度。例如,对于该还原剂,可以iiii^测增加的浓銜K^^确定在此浓JS;K平时,益处不再随浓度增加而提高的7K平,或fflfc浓彭K平时还原剂的
樹可副作用^t^l的^力和寿命的益处的7jC平。
e-巯基乙醇是最优选的还原剂, 细胞^#基中的浓度为约(xoi 约0.5
mM鞭高,更雌大约0.055 mM的浓度。 5 如何实施本发明不受iif^论或假说的约束,但是据信,在4顿的浓舰常
小于lmM且雌小于O.lmM的隋况下,还原齐i鹏M干扰宿主细鹏R/^^及 寄M性别分化的寄生虫信号种^^放的信号割牛。
如何实施本发明不受ttfSJ理论或假说的约束,可以假设,在《趟的实驗案 中,还原齐卿制吞噬性宿主细胞消^^死已掺AI摘主细胞吞噬体中的原生动 10物,因此有助于提高在吞噬性宿主细胞系中原生动物寄生虫的生存力。
在更雌的实 案中,宿主细胞培养体系細无限增殖比吞噬细胞系禾咆 括飽还原剂,例如,e-麟乙醇鄉功育^^物,如^Jd^的浓度范围在内的 土 基,例如用于艾美球^t^生物体的连纟彭咅养。
在最优选的实施方案中,宿主细胞是Speer等,1985, Infection and 15 Immunity50 : 566^571中的牛,细,咐旨BM617), ^fc引入作为参考(Dr. Speer, College of Veterinaiy Medicine, College Station, Texas)。源自ATCCCRL 6017和ATCCCRL6057的牛,细胞也作为例证。
本发明i歸体系^^纟歸基、密度、任意的生长自^面、,和环^* 决定戶,的宿主细胞。<mtfe,宿主细胞生长 转或 的; 中的悬浮液中。 20或者,例如,因为宿主细胞需要固体麟,细胞生长^f^面、在浸于i歸基 中的it^片上、i^皿中、禾0/^1#&培养基中的^^磁性的微自的表面上, ^i于所选宿主细胞的樹可其它公知的细胞生长载体上。
例如,1顿本文例示和以上蹈啲牛報细胞时,细胞雌以小于80%铺满 的密度接种到约150cm2组织i^^瓶中以用于i^。皿吔,在标自胞:t^,ij 25如Gibco的RPMI i:歸基中,在37°C、 5%002气氛下让宿主细胞生长,0M, 基补充抗微生物齐收晴霉歉 素和抑真菌剂。按实验势,,当宿主细胞的培 养MS^嘬大密度,例如80%到100%,满,烧瓶中培#^1被分离或"分裂" 以^1>细胞密度例如繊|」1/6铺满密度。当然,当调^^赚以在商处妒用于 娜的原生,材料鄉它目的时,狱人员失Pit^^呈是可以变化的。 30 ^t于戶腿宿主细胞系的、皿实施:t歸体系。在约25 约45。C的温度,更imtte约37 约41。C实施歸。最雌在37。C。 以艾美球鹏槲中i錄的鸟^S苗和疫苗接种
虽然生物体题活的鹏鄉睞源中得到的,但艾辦AM辦中鄉是已知 的,例如,McDonald等,美国专利5,055^292给出详细方案, 引入作为参考 5通51^#体系得到的自子可以用樹可公矢坊法,屯化。简,例而言,
但没有限制,卵囊可以释鹏胆歸基、种^iai已矢防法,的培养细胞中从而
得至ij^l子。例如,如J.入Olson, 1990, Antimicrob. Agents Chemother. 34:1435-1439 所描述,可以移去细胞碎片。简而言之,Olson的方、^^括收集含W^放的,子 的麟基、并以450 xg旋转离心10併中以、鹏鹏子。将包含鹏子和宿主细 10胞碎片的颗粒沉能悬 雜0.1MNaCM).05MKCl-20Q/o牛血清白蛋白中,并施加到 于pH 8.2上平衡在75mM TriS"40 mM NaH2POr86mM NaCI-100mM葡,中的 D&52阴离子交换柱上。裂殖子过柱。根据A Kilejian, J. Biol. Chem. 249: 46504655, (1974)所述的电子显微镜法检查从柱子收集到的,子的纟,。
用作鸟^m的孢子体^i子或它们的混,,^Kl卵内给药i任
15何适宜的生理介质中注射至im中。^tk,将它们悬 ^£生理平衡的&7乂中, 例如磷酸缓冲盐水中。所选的介质可以ffi^包括一或多禾te^HJ,包括M:的生 趣嫩、明胶、水溶胶、辦隹素或多糖胶。
在一lim的实驗案中,例如包括鹏子柳或孢子体的这种活的生物体,
i^卵内给药^射至iJ嫩鸟中^13i下列形式接种给药以樹可3te的本领域已
20知第脐,J形式的非鹏、皮下、划痕秋舰内给药,例如,相容的缓冲液柳或生理
学上可接受的淑K, 4趟与佐齐诉n/或免疫增强齐i鄉臓剂组合(例如疫苗接种以 前或以后^i合药或系列给药)。
适当的免,臓齐抱括但不P艮于细胞因子、生长因子、趋化因子、淋巴细胞 细胞培养物的上清液、對亥细胞、淋巴器官的细胞、细胞制品鄉MI取物(例
25如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)鄉旨多麟跻ij) 、 U^ffl胞分翻喊包 括低分子量药品在内的佐剂。免^赚剂可以在^#的樹可期间卵内给药。
地,免鄉微剂在含有艾美球鹏槲中孢子体^l子或它们阶混糊的驗基 中被卵内给药。
对于口月膨药的疫苗浪苗接种方法,可方^M鯛本领域已知的生理学战 30宜的缓冲液或悬浮剂。另外,可以加A^溯,例如,混合至i化煳7滅喷雾到食物颗社,鹏喷^a^^它鄉上,等等。
用于疫苗接种的目的,给药的齐懂或接种鹏括照中或多种艾美球虫属辦中 的鹏子、卵囊种或它们的组合的、翻鹏喊糊胞。
对于疫苗接种,iM本发明方法培养的艾美球虫属顿中细胞的^剂量为约 5 10 约106个卵囊^|子或它们的混^|,其中卵薪口^子的总量为约10 约105个。给药后的细胞^MM3S宜的宿主细胞传代、辐射、重组突变柳鄉 它公知t^方法减毒。
更,的齐懂范围是约W 约105个的卵囊^1子或它们的混,,其中 卵囊和 子的总量为约103 105个。
io 财Km的齐懂范围是大约i(^ io5个的卵囊^i子或它们的混糊,其
中卵囊和裂殖子的总量为lW l()S个。
樹可鸟类包括需要疫苗接种的别l^的鸟类在内,可以考虑接^^种舰。优 逝也,接^^样疫苗接种的鸟类可以是与商业相关或非商业,的鸟类,例如, 在球虫感染的条件下大量养殖鸟类是可能的但并不数火迎。这些鸟类包括,例如
15鸭科(Anatidae)如^1、鹅和鸭,鸽类(Columbidae)例如斑鳩和鹆子如家鸪, 雉科(Phasianidae)如鹧鸪、松鸡和力鸟,Thesienidae如魏,鹦鹉科(Psittacines) 如长尾鹦鹉,麦皋和鹦鹉,例如,为宠物或il^t市^1^的。也可以考虑用原生 动物细胞或其它产自本发明方法的衍生 种3^^和走禽。艾美球虫属物种生物 体鄉给药雌的受体繊鸟。
20樹可公知的给药途^^苗接种都易于4顿。因此,可,鸟卵卵内tt^也 给予某一剂量。也可以通过^^^例如刚出生携带疫苗生物体^l鸡的羽毛任 麯舒某—齐懂,^131喷竊 管用漸口月赵合药。 3!5iJe药物直接涂在 口腔、加A5收OT水、禾tV鹏羽社喷洒药物然后借助用嘴整理麟口腔传送, 从而实现口部释药。也可以M31将生物体用在或浪合到被嫩mA的颗粒鹏或
25 !^中来任意口月齢药。
纟,鸟卵或出生一天,鸟卵内给药的^^齐懂包括选自,艾美球虫,堆 型艾美球虫、巨型艾美球虫、毒害艾美球虫、缓艾美球虫、早熟艾美球虫禾怖氏 艾美球虫的两种或多种艾美球虫属辦巾的卵囊^t子或它们的混^i。
给火鸡卵或出生一天的雏鸡卵内给药的^t剂量包括选自力鸟和缓艾美球
30虫、腺艾美球虫、力鸟孔雀艾美球虫、分散艾魏虫、力鸟艾美球虫、无害艾美球虫和近圆艾美球虫的两种或多种艾美球A1顿中的卵囊^^子或它们的混合
物。对包括舰齐懂的^tt/f中,齐慢W^fe包括10 106个卵囊^|子或它们
的混嫩
任iM,疫苗被i^药,例如,Mil^发明的i歸体系产生的艾,虫属 5物种迸行疫苗接种的同时、之前称t后,j顿某一剂量范围樹可适宜的公知抗 球虫病化学治疗剂或化学预防制厠以有效削 苗接种的,,而不会损害擬中 过的动物的免疫保护性应答的形成。化学治自抱括但不限于樹^效的抗原生 动物剂,例如,抗原生动物化溯例如抗敝物剂、抗生素、包括ii^鹏抗体
例如单克隆抗,n/^片段^s组衍生物的组^/。
l o本发明的齢治疗也包括,舒禾fV^^同时舒樹可公知的免鄉微齐诉口 疫苗接种,禾0/^^<封可其它时候协同给药。
—种优选的免自ij激剂给药方法是在最后四分之一培养期或出生一天的雏
鸡的时候,同时用某一剂量卵囊^i子鄉腐的卵囊^l子的混^t;卵内给 药。
15 本发明的另一方面liiil冷藏、冷冻或冷冻干燥保存卵囊^M子、锄腿
卵囊^H子的混,。例如,当冷冻由本发明i歸方法和i錄体系产生的活的 生物体时,可任选使用公知的冷冻防腐剂。这魏括,举例而言,例如滲iff呆持 齐ij,如甘油、二甲基亚砜(DMSO)、糖如葡繊,半学IM,棉子糖)、蛋白质 如血清、禾fV或白蛋白和其^fil清成分,尿素或MS,^tl例如S^白7K解,,
20 例如,N-Z"AMINE A (Quest International, Hoffinan Estates, DMnois的IPL:5X59027)。 抗原生糊剂的筛选
本发明培养体系也提供一种筛选和鉴别抗原生^齐鹏别是抗艾美球^ 物种剂的高效有用的方法。筛选的活性齐'泡括潜在预防或治疗的药物话性齐收感 物離條
25简而言之,i^^种孢子綱中將离:t^/。为了检测预防作用,
单层细胞在卵囊麟之驗i歸基里引入检测活性抓为了检测治疗舰,首次 分裂在正常维^i咅养基上的,体系中生长。在两种方法中,第二次分裂在补充 有受试活性剂(呈现在溶^^浸渗在i^S^微圆盘中)的正常维辦歸基的培 养体系中生长,以刑古它杀^m赐生动物无性生殖阶段的能力。
30为了筛选可替代的治疗剂,可ffi^顿药敏性原生糊或具有已知抗药性的生物体。
在一个可选择的策略中,^#~种孢子乡,中^离^^0首次分裂在正
常维持培养基上的培养体系中生长。第二次分裂在补充有该受l^性剂(呈ij^ 溶液或浸滲在微或i微圆盘中)的正常维辦歸基的i歸体系中生长,以刑古 5它杀死或抑制原生动物无性生殖P介段的能力。为了筛选可割戈的治麵物,也考 虑在^^体系中^M药敏性原生,^有已知抗药性的生物体。 用于疫苗的艾美球^辦中减W^的i,
一种用于制备疫苗的众所周知的减毒病毒的方法是在组织培养物中培养至 高传代7K平。皿长期培养,生物体彭见出,^#^件的累积,并可以丧失 io毒性。这里描述的培养体系是用于艾美球A1物种的长期增殖,以培养用作活疫 苗的非病驗。该^t采用如实施例2中描述的有着50鞭多次传代的鹏子培 糊专代。
,可以选#^于在牛,细1±生长的自子,选择是根据,可^ 鹏例如取自各槲中(如狗,猫,牛戯它)的肾脏细肚生长的能力而作出的。 15在各种传代水平,源自这^i^歸物的,子或卵囊可以通过接种到出生"^ ,鸟或实施例4中描述的劂台化卵中来测试毒性。保留在i繊中复制的能力 却在宿主±^现出毒性繊鹏高传4 粉^^择用于疫苗开发。
实施例
除非另有说明,下歹i偫定的实施例是为了鄉i脱明,而非想要限定本发明的 20范围。
实施例1
制备用于接种的鄉鎌体系 3^i歸体系可按以下制备
将牛報宿主细胞的无限增殖比系传代76次并发现不含支原体。牛^^细 25 ,JiiJ悉的Speereta1., Id,中的细胞的衍生物。
将宿主细胞维持在补充转霉素(100单你ml)、麟素 )、两性霉 素(2.5 ^ml)、 P"鹏乙斷.055mM)和10%马或牛血清(维^t歸基)的RPM 薩(Gibco)歸基中。
将宿主细胞以约6x 104个细膨ml和 15ml的量接种在150cm2组织^#瓶 30中,产生不鹏80%到100%铺满的密度。将细胞在37'C、 5Q/oCQz的i歸箱中用固定的M培养。每三天用15ml的 维^^#基对细胞补料^:天^~ 次。用0.25%的胰蛋白 坏单层而,:1:歸物,并使用相同培养凝Bi^:f牛 把1/6的培# 种在#^新的150cm2的培养瓶中。 实施例2
5 蹄艾美球螨物种原生微
将取自被感染的嫩鸟的粪便的堆型艾美球虫卵囊按以下制备用于:t,。 MM 加入10份水到1 ^^喊粪H^液,并Mil撤^4 (类似于在LR Ash和TC Orihel, Parasites: A Guide to Laboratoiy Procedures and Identification, ASCP Presst 1991, pp.34-35所描述的Sheathed的糖浮集法)纯化卵囊,在此引入作为参考。 10将卵囊离心来浓縮,再重悬浮在2.5%的重铬酸钾中,然后室温下在空气里暴露24 到72小时以利于孢子形成。^^皿4'C下^i^T^在约25'C下将形成孢子 的卵驗氯己定葡萄離溶^PerioguarcP^中悬浮1併中以杀死污染性细菌。通 过洗涤除去氯己定葡萄,。M31离^800 xg 6併中)使卵紫沉淀,丢弃上清夜, (如mJi清夜被丢弃,怀>| £悬有沉 粒)然后如实施例1所描述,在100体 15积的抗生素/抑真菌剂维擀歸基中使沉淀悬浮5l6a疗冼涤。离心和塞悬浮再重复 进行2次。
在不舰80%铺满,胰蛋白,七接种后,立即4顿实施例1中制备的牛對亥 细胞的烧瓶。然后W^i洛的烧瓶以约1000个的卵囊接种在15ml维辦 基 中,该i歸基如i^M律恪,孢豫卵艱目对宿主细胞的密度为每宿主细胞io'3 20个寄生虫。将i^J接种在约37。C的5。/oC02^^箱的固定M中。
用牛 细胞培养卵囊10天,每3効[]Ai i,基(15ml) 。 10天后,通 过以下方法收集培养物上清夜和感染的细胞,舌陬单层细鹏i扭歸液中,再如实 施例1戶腿以小于80%的铺满将1/20的:t^^种在,(未感皿)牛 细 胞的单层细^±0每^(见察i^/的,体,并观^t主细,放的和^it培 25养基中的孢豫卵囊。ii51倾析上清夜i薪液收麟的孢豫卵囊,随后以800 xg的速度离心6併+^浓縮寄生虫。立即使用孢豫卵囊或^liS 2-7。C的培养 基中,鼓用于另夕卜的实验。 ^1子的细胞被传代总计180天,荆^:们 &1^^)中遊卖复制的能力。 实施例3 30 ^m^孢T^的生物体本发明也提供JMH察体外培养和无须对鸟进行接种的感染性来评估保存 的艾美球虫属辦中卵^^ ^生存能力的方法。
堆型艾美球虫的卵紫孢子囊可iiai^^,浮集的方法从雏鸡的粪便中获
得或可从如实施例2臓的^t/中获得。 5 卵藪孢子囊分为相等的个等伤,。其中四份用低温冷藏剂(如Freezing
Media , Gibco),在-20。C冷冻,而第五^H^2 7 。C。
舰与牛靴细胞中的感染,比,可以比较得自该i繊的四份冷冻样品 与已冷藏的第五份样品的生存能力。 生存能力比较按以下方、^tfi1。 10简要地,采用实施例l的方法,寄生虫接种之前(接种时^吁80%铺满), 立即把牛報细胞以每孔1~2 乂105个细胞的密度移种在带灭菌盖玻片的24孑L培
养板内。在维辦咅养基汰自实施例o中制^^^的检观胂品(例如,io-1
104),并将O.lml擬中在24孑U^S的一式两份孔中。在约37'C、 3 5%C02的 斜牛下将i歸板:t歸1到4天。ili!M微li^査检测孔中堆型艾美球虫感染阶段 15的出现。或者,从 L移去盖断,并用魏萨她以便于堆型艾美球虫寄生虫的 观察。当最高I^J见出50%^染性时}憎#^样品的效价。根据相关的感染效
价比较样品的生存能力。 实施例4
从i^l中收^l子 20通常在培糊(见实施例1和2)被活鹏复制时,例如在驗分裂(传代 培养)的10天内收^M子。使用细胞刮取器获,染的细MB^t/上清夜。 用t!M^式(用27辦头的纟掛織取)溶鹏主细胞。然后,舰离心(450 xg, 歸中)繊鹏子并在维掛薪基中驟孚。再将最终的悬溯用TO^J物 的接种。 25 实施例5
从i^I中收获卵囊
为了积聚更多的卵囊,在18 ^M长的时间里i^T、分鹏生长,然后从 (见实施例1和2)中收获卵囊。如i^fi寸i做的,用Shealher浮驗收集 i^l上清夜并纯化取自细胞碎片的卵囊。然后舰离心(405 xg, IO併中)浓 30縮卵囊。将沉淀的卵驗维擀^l中重悬浮并立即j顿。实施例6 鄉鸟的接种
本实施例可以证明用战实施例2的麟方法生长的堆敏美球虫和魏艾 美球虫卵囊和,子作为傲户性疫苗的可能性。 5 实验A:以堆型艾美球虫和^t美球虫卵囊接禾t^(鸟
方法
M31倾附咅养19天的培,上清夜获| 自培养牛单核细胞的 艾美球 虫和堆型艾美球虫卵囊。舰离心,卵囊,并将其Sl^雜浓度为每ml 100,000 个卵囊的培养基中,然后立即使用。 10 该i^^用三组Rhode Island Red出生~^的鄉鸟。实M^且1是接受堆型艾 美球虫的源自组织i^l的卵囊的嫩,3);实验组2是接^IK美球虫的源 自组织培养物的卵囊的嫩^=3);实验组3 Ji^照嫩鸟。无卵囊(n=2)。组1 和2分另,管坷法(每鄉鸟100 1000) 口月,卵囊。
结果
15 9天后在实验组1的鄉鸟粪便中发现卵囊,而12天后在实验组1和实验组2 的粪便中都有发现。这,据证实了源自培养吻的卵te这Ml种府页期的正常 潜伏期内在宿主中是存活的并SiS行了复制。
没有舒卵囊的组3对照鄉敏其粪輕没有脱落的卵囊。^ 证实在 微的鸟类中^ 斜牛下没有艾美球鹏环境污染的证据。因此,组1和2中 20脱落的卵囊可以归因于i^l接种。 组织病理学
舒魏艾美球虫卵囊的鹏死于严重的腹湾。
显微微见察取自死亡鄉鸟的鹏组织切片确认球鹏的诊断。这^ 表明
源自牛ffi细膨^/的卵囊可以对鸟类宿主维^t:们的奉性。
25 实验B:堆型艾美球虫和纖艾美球舰鄉鸟的攻击
生物体的歸和传代
在制备实验中,将取自以上用于A部分的大量卵囊中的^H式样的卵囊按实 施例2所述培养,以产^H子的连纟對咅养。在包含牛单核细胞的150 112 中 擬中100个卵囊。如实施例2戶腿将的培^^敏2次传代以保证在培糊中没 30有未脱囊的卵囊出现。接种
用培养的I^H出生一天的嫩^(一半为Rhode Island Red或Barred Rock 和Americana)口服接种。接受如上制备的100,000个源自J:^)的堆型艾美球虫 ^t艾美球虫的,子的鸟类出现旗泻。而接受1000,5000和10,000个自子 5的出生1的^(鸟没有出IJ1I渴。
在接种i歸的鹏子后14天,舒1000,5000和10,000个鹏子的鄉鸟和 没有接种的1只未接种对照鄉鸟tP^至咖樣A部分脱落卵囊的鄉鸟先前驻留 过的环境中。当腿在这个污鄉的环雖时,没有接^51子的出生~^的雏 鸡死于球虫病感染。然而,先前接种过少觀殖子,敏临床上依然健康。这 10 ^表明亚临床齐懂的,子可以诱导鸟类的免疫性,这傲户它们可免于随后 艾美球虫属物种致死齐懂的攻击。
表一
汰鰣鹏子腿对攻繊l臓反 应
2B6060,雕糊亍
2B100,000100,000鹏
2B10,00010,000,雕无臓舰
2B5,0005,000鄉膽
2B1,0001,000鄉雕无W^
1B00,腯死預鹏
15 实验C:用堆型艾美球虫和,艾美球虫接种10天的腳台
将1000个源自牛,细膨,物的堆型艾美球虫和^^美球虫的裂殖子
(如实施例2) m^驗径体夕碟种到io天大的胚i^鸟卵中,导致任,中
的裂殖子的胚胎死亡。在组织中没有卵,成的证据。i^M表明在牛TO细 胞中i歸后两种艾美球^顿中柳^t腳台毒性。 20实施例7
筛繊原生,剂
25舰j顿实施例1和2的体系ifj古X^子綱中的推荐的抗原生微剂的 有效性。
A. f繊也;j^y (Diclazuri)
鹏包含Thermo腿^(Nalge Nunc International, N^ervffle, IL)的24孑IMH 5培养板,牛单核细胞被接种并在应用实施例1方法的维持培养基中生长到小于 80%的铺满。随后,齡孔用堆型艾美球虫和魏艾美球虫接种。舰球虫齐哋 娜IJ引入10个检测孔的每一孔的i歸基中,而另IO个孔作为对照。在24、 48、 72小时i^tl中鹏生殖的出现,鯛来顿照 讽治疗子Ut间比较、以iff古對式 活性剂的抗原生动物活性。MilM微ll^查和^l萨染色的盖^观察寄生虫的 io生长。鹏生殖的出;贴树照孔M^的百分比也,細来iff古药物治疗效果。
B. 筛选其他活性剂
采用24孑li且织i歸板,宿主细胞^i宜的维^t歸基、,和适于宿主细 胞的大,中生长到小于80%铺满,然后針孑调本发明孢B,种接种。将被 i微的一种或多种活性剂引AliJ 10个检测力,L的每一孔的i歸基中,而其他 15 10个加样 L作为对照。顿照加样 L^治疗加銜Lt间比较在i纖中约1-10天 后的生长,从而刑古i(銜式剂的抗原生^T活性。
可以用显微镜检测或用吉姆萨染色法或观察寄生虫的适宜染色法染色的盖 玻片^(见察寄生虫的生长。
实施例8
20 ifj鹏制原生糊的方法
实施除去可传播诸如球虫亚纲的生物体到圈,特定位置的^中的物质 的^方法是M^家畜原生^)感染的方法之一。
釆用实施例1和2各自的方法和i,体系易于if(古这些,方法。 标准样品(例如垃圾的样^a)取自相关地区,并将^tS以分离可能雜的 25卵囊。鹏^f种到如实施例2戶腿的i歸体系中,并观啶5-10琉的生长,同 0 具有已知^1:生物体的样品麟繊,以确定与净加台样品相关的生^7K平。
然后实tfi 的,方法,其后,在^a^作变4tet^定^g收集预定 量的标准样品。然后培养新样品'^e在5-io天时的生长与^s前样品的生长相 比较,以确定在相关的环境中存活的原生动物的倒可减少。
权利要求
1.一种抗原生动物疫苗组合物,所述疫苗组合物包括通过下述方法增殖的裂殖子种群,所述方法包括(a)提供包含适合孢子纲物种生长的无限增殖比的吞噬哺乳动物宿主细胞的细胞培养体系;(b)将宿主细胞与感染阶段的专性细胞内孢子纲原生动物相接触,从而导致宿主细胞内能够在无性阶段连续生长的裂殖子种群的生长,其中所述接触是在有效感染宿主细胞的条件下进行;和(c)以裂殖子种群的无性分裂形式增殖裂殖子种群;其中所述专性细胞内原生动物是属于选自等孢子球虫属、囊等孢虫属、隐孢子虫属、艾美球虫属及其组合的属的物种;并且其中当所述专性细胞内原生动物是属于艾美球虫属的物种时,该艾美球虫属物种是能够感染鸟类宿主的物种。
2. —种经分离的原生动物鹏子棘具有卵囊的鹏子的种群,其中原生动物选自柔嫩艾美球虫、堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、毒害艾美球虫、缓艾美球虫、早熟艾美球虫、和布氏艾美球虫、力鸟和数美球虫、腺艾美球虫、M財L雀艾美球虫、分散艾美球虫、火鸡艾美球虫、无害艾美球虫、近圆艾美球,其组合,戶服原生动物翻子棘具有卵囊的鹏子的种群JMa下述方法增殖的,臓方飽括(3)提供包含适合孢子,中生长的无限增殖比的吞 乳^1宿主细胞的细胞織体系;(b) 将宿主细胞与感染阶段的专性细胞内孢子纲原生^l相接触,从而导致宿主细胞内育滩在无性阶s^卖生长的鹏子种群的生长,其中戶;M織虫是在有效感染宿主细胞的斜牛下进行;禾卩(c) 以翻子种群的无性分娜微5I^I子种群;其中戶腐专性细胞内原生,是属,自, ^、 ^to属、隐孢子虫属、艾美球虫属及其组合的属的顿中;并且其中当戶;M专性细胞内原生动物是属于艾美球虫属的物种时,该艾魏^M顿中是肖嫩感染鸟类宿主的辦中。
3. 活生物体在制备用于在鸟类中引起抗原生动劍呆护性免疫的疫苗中的应用,其中所逾活生物体JiM;下述方法增殖的,戶微方飽括(3)衝共包含适合孢子綱中生长的无限增殖比的# 乳^/宿主细胞的细胞培养体系;(b)将宿主细胞与感染阶段的专性细胞内孢子纲原生,相織虫,从而导致宿主细胞内肖嫩在无性阶段遊卖生长的鹏子种群的生长,其中所述織虫是在5有效感染宿主细胞的^f牛下进行;和(C)以翻子种群的无性分娜微Ml^i子种群;其中所述专性细胞内原生动物是属于选自,,虫属、^fto属、隐孢子虫属、艾美球虫属及其组合的属的物沐并且其中当戶脱专性细胞内原生,是属于艾美球鹏的顿中时,该艾美球虫属辦中是肖滩感染鸟类宿主的辦中, 其中所述疫苗包括能有效弓i起鸟类的^i户性免疫的ifa的活生物体。
4. 权利要求3戶舰的应用,其中戶腐鸟魏别养的鸟类,且该原生,是球虫属。
5. 权利要求3所述的应用,其中该鸟難自鸭科、鸡台駢斗、雉科、Thesienidae、鹦鹉科及^ft。
6.权利要求3所述的应用,其中该鸟类是力鸟或嫩鸟。
7. 权利要求3所述的应用,其中活生物体的縫包括翻子鄉嚷鄉混合物,其中所逾活生物体总的M范围是10 106。
8. 权利要求3所述的应用,其中活生物体的M包括lW l()5个,子或卵囊。
9.权利要求3所述的应用,其中活生物体包括以选自口鹏合药、繊^M羽毛、卵内 掛及其齢的给药方式给药的鹏子、卵囊鄉组合。
10. —种细胞培养体系,所^胞*^体系包括适于孢:^ 种生长的无限增殖比吞噬宿主细胞,并M9胞i,S^,原剂,该还原剂的量能有^l高无限细胞培养物中无性增殖生皿段的孢子,种的存活,其中所,高是相对于raS原剂时i,的孢子,巾的存活而言的。
11. 权利要求1所述的,组,,其中戶,疫苗组^^括药学上可接受的佐剂。
12. 权利要求ll所述的疫苗组合吻,其中所述疫苗组^2包括混入的食品组倫^til包括下述步骤的方法歸该孢子,中(a) 衝共包含适合孢子自巾生长的无限增殖比的吞M乳^)宿主细胞的细胞歸体系;(b) 将宿主细胞与感染阶段的专性细胞内孢子纲原生动物相撤虫,从而导5致宿主细胞内兽滩在无性阶l^生长的,子种群的生长,其中戶,^M是在有效感染宿主细胞的别牛下迸行;和(c) 以|^子种群的无性分 式增|||^1子种群;其中所述专性细胞内原生,,于选自, 虫属、H^Fto属、隐孢子虫属、艾美球虫属及其组合的属 种;并且其中当戶服专性细胞内原生动物10是属于艾美球虫属的顿中时,该艾美球虫属物种是倉滩感染鸟^t主的物种,其中所述培养是在与和不与待筛选的活性齐l,虫盼瞎况下进行的,并检测相对于不郝该活性剂的生长的对生域生存能力的抑制乍用。
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14. 一种在无,育阶I5^彰歸专性细胞内孢子纲原生动物的方法,所述方飾括 15 (a)提供包含无限增殖比牛 细胞的细胞^#体系;其中无限增殖比牛单核细胞育滩鹏吞噬作用与原生糊结合;其中细胞±歸体系包含适于无限增殖比牛单核细胞生长的培养基,和浓度范围是0.01M).5mM的(5- 乙醇;(b)在有效感染宿主细胞的条件下使宿主细胞与感染阶段的原生动,虫,导致宿主细胞中的,子生长;和20 (c)以謝直子种群的无性分娜微5l^i子种群;其中所述专性细胞内原生动物^1于选自,,虫属、^ to属、隐抱子虫属、艾美球虫属及其组合的属的辦中;并且其中当戶皿专性细胞内原生动物是属于艾美球虫属的辦中时,该艾美球鹏冊是兽辦感染鸟类宿主的辦中。
15. 权利要求14所述的方法,其中戶;MH生糊魏自以下的艾美球颠物25沐魏艾美球虫、堆歡美球虫、巨型艾美球虫、毒害艾美球虫、数^A、早熟艾美球虫、禾卩布氏艾美球虫、力鸟和数辩虫、腺艾美球虫、力財L雀艾美球虫、分散艾美球虫、M鸟艾美球虫、无害艾美球虫、近圆艾美球舰其组合。
16. 权利要求14所述的方法,期f征在于戶脱方法还包括陶fefc歸体系中宿主细胞浓度的步骤,只要生"feii到至少80%铺满。
17. —种使雏鸡或力鸟对于一种或多种原生动物艾美球虫属物种免疫的疫苗,所述疫苗包括鸟数美球鹏辦中的鹏子、产自鹏子的卵囊鄉混糊;其中,子已在无限增殖比哺乳,吞噬细胞的连彰^#吻中增殖。
18. 权利要求17戶腿的疫苗,其中戶/f^哺乳鹏鹏细胞是靴细胞。
19. 权利要求18所述的疫苗,其中戶服報细胞是牛靴细胞。
全文摘要
本发明涉及孢子纲物种体外培养的方法及其用途,特别是通过导致产生裂殖子连续培养的体外组织培养而使原生动物的卵囊脱囊和生长的方法。本发明也提供一种经济又可靠的,用于疫苗生产、测定和研究的培养的艾美球虫属物种。还提供已用所给出的艾美球虫属物种接种的驯养的鸟类。
文档编号C12Q1/02GK101596312SQ20091013953
公开日2009年12月9日 申请日期2003年5月20日 优先权日2002年5月21日
发明者S·P·埃利森 申请人:先灵-普劳有限公司;病原体研究公司
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