专利名称：一种希瓦氏菌及其在微生物燃料电池中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种希瓦氏菌及其在微生物燃料电池中的应用。
背景技术：
能源是支撑现代文明社会发展的主要物质基础之一，同时能源也是一个世界性的 重要课题，20世纪下半叶，由于人口快速增长，经济迅猛发展，人类社会以空前的高速度消 耗着有限的资源。在50年内，世界人口从25亿增加到60亿以上，增长了近1. 5倍，同期石 油年消费量增长6. 3倍，煤的消费量增长2. 6倍，天然气消费量更是增长13. 5倍。随着这 些传统化石能源的日益耗尽，能源问题愈发成为人类社会普遍关注的焦点和必须解决的重 大课题。面临严峻的形势，我国高度重视能源问题，采取了立足国内、开源与节能的方针。 多年以来，国家大力建立有利于节能降耗的法制、体制和机制；推动技术进步，推动经济结 构调整和经济发展模式的转变的同时，鼓励发展清洁生产和可再生能源的应用。在美国，新 的经济刺激计划中首当其冲就是发展可再生能源，力图恢复美国在能源技术方面的国际领 先地位，并使可再生能源成为美国经济复苏的“发动机”。去年11月下旬，法国环境部也公 布了一揽子旨在发展可再生能源的计划，计划到2020年将可再生能源在能源消费总量中 的比重提高到23%，相当于每年为法国节省2000万吨石油消耗。随着不可再生的化石燃料供应的缩减以及对二氧化碳排放所造成的环境问题的 日益关注，迫切的需要开发出可再生性的具有最小环境负效应的新能源。储存在地表以下 的无氧环境中的有机物蕴含着巨大的能源，尽管作为其中一部分的石油以集聚的形式容易 被开采利用，然而更大部分的有机物散布在地层中不能够被当前的技术所利用。微生物燃料电池就是利用阳极室内微生物的催化把化合物里的化学能转化为电 能的装置。电池反应过程中，阳极室里的微生物氧化底物产生电子和质子，二氧化碳作为氧 化的产物被释放出来，然而，在此过程中并没有净二氧化碳的排放，因为在可再生生物质中 的碳是来自大气中光合作用过程。不同于直接燃烧，被阳极捕获的电子通过外电路传递给 阴极，质子则通过质子交换膜或是盐桥到达阴极，在阴极表面与氧和外电路传递过来的电 子结合生成水。早在20世纪初Potter就提出了利用微生物燃料电池能够把有机物转换为电能。 然而由于微生物燃料电池缺乏产电效率和长期稳定性，使得这方面的研究一直比较低迷。 直到几年前，由Tender等设计的利用水底沉积物产生电能的新的微生物燃料电池，又重新 唤起了人们对开发这种新能源的热情。此外，产电微生物由于具有独特的有机物降解能力 和对重金属离子的还原能力，在环境生物修复方面也具有重大的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的可替代能源产生方式，提供从自然界中分离具有高活产电能力的希瓦氏菌菌株及其在微生物燃料电池中的应用，该菌具有产电能力强， 耐受盐离子浓度宽广，可以在高盐离子浓度的培养基中生长，具有耐受性高，使得燃料电池 内阻更小的优点。本发明的希瓦氏菌(Shewanella marisflavi)新菌株EPl是该种内首次报道具有 产电特性的菌株，有较宽广的盐离子浓度耐受性以及较高的产电活性，具有广阔的工业应 用前景和理论研究价值。本发明的另一目的在于提供一种新型的可替代能源产生方式，提供从自然界中分 离具有高活产电能力的希瓦氏菌菌株及其在微生物燃料电池中的应用，该菌具有产电能力 强，耐受盐离子浓度宽广，可以在高盐离子浓度的培养基中生长，具有耐受性高，使得燃料 电池内阻更小的优点。本发明提供的希瓦氏菌，其特征在于该希瓦氏菌为Shewanella marisflavi EPl，2009年1月8日保藏于中国武汉大学的“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号为CCTCC M209016。菌株EPl菌体为杆状，直径为0. 3 1微米，长度为2. 5 6. 0微米，可单独存在 或以成对、短链状排列，菌体具有单生鞭毛，能移动，革兰氏染色阴性。本发明中该希瓦氏菌的16S rRNA基因序列见SEQ ID N01。本发明提供的希瓦氏菌在微生物燃料电池中的应用，尤其是在高盐离子浓度下的 产电应用。其特征在于该希瓦氏菌分离自海洋沉积物，具有宽广的盐离子浓度耐受活性， 能够在高达8%的NaCl浓度电极液内产电，从而有效的降低了微生物燃料电池的内电阻。下面详细介绍本发明本发明的希瓦氏菌是分离自我国厦门地区海洋沉积物样品，在微生物燃料电池中 以乳酸盐作为电子供体富集培养，并在含有无机硫的厌氧平板上选择性培养分离纯化而得 至IJ，其生物学特征如下A.形态学特征菌株EPl菌体为杆状，菌体直，两端圆形，直径为0. 3 1. 0微米，长度为2. 5 6.0微米，可单独存在或以成对、短链状排列，菌体具有单生鞭毛，能移动，革兰氏染色阴性。 见图1。B.培养特征本菌株EPl在葡萄糖天门冬素琼脂、营养琼脂、桑塔斯琼脂、土豆浸汁琼脂等五种 培养基中培养，形成的菌落呈桔红色，菌落圆形、湿润、边缘整齐、中央突起，无气生菌丝。C.生理生化特征《Bergey， s Manual of Systematic Bacteriology》vol. IV.的力夕去，胃tt LSSE-H2的生理生化特征如表1所示。表1菌株LSSE-H2的生理生化特征 D. 16S rRNA 基因序列本发明的菌株EPl的16S rRNA基因序列如下(SEQ ID N01)AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGGAAGAAAGCTTGCTTTCTTTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGGAACTGCCCAGTCGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAA
AAGAGGGGACCTTCGGGCCTTCTGCGATTGGATGTACCTAGGTGGGATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGTTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCT GATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAAGGTTAAGTGTTAATAGCACTTAGCTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTCGGAATTTGGTGTCTTGAACACTGGGTTCTCAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAATTCGCTAGAGATAGCTTAGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTACTTGCCAGCGGGTCATGCCGGGAACTTTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGAGTACAGAGGGTTGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCAGAAAGCTCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTAGATAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGTTTACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCCTAGGGGAACCTGGGGCTGGATCACCTCCTT通过检索GenBank，本发明的菌株EPl与其中相关菌株的16S rRNA基因的相似性 如表2所示。表2菌株EPl与相关菌株的16S rRNA的相似性 表2显示，本发明EPl新菌株的16S rRNA基因在GenBank中无完全相同的菌株，说 明本菌株是首次被分离。该菌属于希瓦氏菌属进化分枝。形态特征菌体为杆状，菌体直， 两端圆形，直径为0. 3 1. O微米，长度为2. 5 6. 0微米，可单独存在或以成对、短链状排 列；无气生菌丝体。本发明的EPl菌株既可以在营养培养基中培养，也可以在以乳酸盐作为唯一碳源 和能源的好氧培养基中生长，也可以在以乳酸盐作为唯一电子供体和三价铁作为电子受体 的厌氧培养基中培养。在微生物燃料电池的阳极中生长的菌体具有高活性的产电能力。菌 株在pH4-9均能良好地生长，生长温度25-40°C，兼性。本发明的菌株EPl的应用方法有(1)能以乳酸作为电子供体直接用于微生物燃 料电池中进行产电；(2)用冷冻干燥的菌体制成静息细胞进行产电；(3)能以废水或淤泥中 的营养成分进行产电；(4)该菌可用吸附或包埋在电极载体上的固定化细胞作微生物燃料 电池的阳极催化剂。本发明提供的希瓦氏菌是从自然界筛选分离得到的；该希瓦氏菌无论是生长状态 还是静止细胞，无论是游离细胞还是固定化细胞，无论是淡水培养基还是海水培养基甚至 是高盐浓度的培养基均能表现出高活性的产电能力，特别是在污水处理中既能够促进污染 物的降解又能够产生利用污染物产生再利用的电能。该菌具有许多作为工业应用菌株的优 良特性，耐高浓度盐离子的能力强，产电活性高，具有广阔的工业应用潜力。
附图1希瓦氏菌株EPl的细胞形态电子显微镜图；附图2EP1菌株静息细胞在微生物燃料电池中的产电示意图；附图3EP1菌株在不同盐离子浓度环境中产电能力示意具体实施例方式实施例1 :EP1菌株的筛选
从中国厦门附近海湾采集海洋沉积物作样品。取2克土壤样品悬浮于250毫 升的微生物燃料电池的阳极电极液中富集培养。阳极电极液培养基(MMl)的组成为 去离子水 1000 毫升，1.30g K2HP04,0 . 45g KH2PO4,0. 19g(NH4)2S04,0. 25g MgSO4, IOml Wolfe，sMinerals,0. 05g CaCl2,0. 02g L-精氨酸，0. 02g 谷氨酸，0. 02g 丝氨酸和 0. IOg 酵母粉，其中加入lOmmol/L的乳酸钠(DL-Iactate)作为电子供体。燃料电池阴极液的组 成除了未加氨基酸和酵母粉外，其它与阳极液相同，阴极液还要添加相应的氯化钠来平衡 与阳极液之间的渗透压。微生物燃料电池装置采样H型结构，由两个螺口旋盖玻璃瓶组 成，之间用连接在玻璃瓶上的玻璃管对接并固定，玻璃管通道之间采用杜邦公司的Nafion 117质子半透膜作为燃料电池的阳离子交换膜，电极采用高纯石墨块，通过包埋入石墨的 耐腐蚀导线连接到电池外，外电路连接一个1000欧姆的固定电阻，电阻两端的电势差采用 Keithley2000型高灵敏度万用表测量。电池阳极通入高纯氮气保证厌氧状态，阴极通入过 滤无菌的空气。整个电池装置置于恒温(26-28°C )房间内运行，电极室内用磁棒搅拌混合。 待外电路电压升高到稳定后，于厌氧工作站内用无菌刀片剐下附着在电极表面的微生物， 重新接种到新鲜的阳极液中再次运行电池进行富集，重复三次富集都能达到相同或更高的 电压的样品才能进入分离纯化。富集结束的样品经稀释后涂布于含无机硫的LB平板上， 置于厌氧工作站内生长，克隆周围产生透明圈的被认为是阳性克隆，经多次划线分离得到 一株纯化菌株，该菌株产电验证表明能达到最高200mV的外电路电压，具有较高的产电活 性。该菌株被命名为EP1，16S rDNA和DNA-DNA杂交等分子鉴定表明该菌属于Shewanella marisflavi,已于2009年1月保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号为CCTCC M 209016。实施例2 =EPl产电接种细胞的获得与诱导挑取LB平板培养的EPl菌株菌落，接种到20毫升的匪1培养基中，加入20mmol/ L的乳酸钠作为电子供体和碳源，300C，180转/分培养12小时后，再按0. 1 %接种量将其加 入到100毫升厌氧MMl培养基中，其中加入20mmol/L乳酸钠和20mmol/L富马酸钠分别作 为电子供体和电子受体，30°C下静置培养12小时后，再按0. 接种到以50mmol/L柠檬酸 铁和20mmol/L乳酸钠作为电子受体和供体的厌氧MMl培养基中，30°C培养12小时后，厌氧 环境下离心获得菌体。将菌体置于100毫升的厌氧匪1培养基中，混合振荡1 2小时，离 心再次取得菌体。实施例3 =EPl活性干细胞的获得挑取甘油保藏的EPl细胞，接种5毫升的LB培养基中，30°C ISOrpm摇床培养12小 时，0. 接种量接种到含有20mmol/L乳酸钠的20ml MMl培养基中，30°C 180rpm振荡培养 12小时，0. 接种到以富马酸钠和乳酸钠作为电子受体和供体的厌氧MMl培养基内，30°C 下静置培养12小时后，0. 接种量接种到5000ml的以柠檬酸铁和乳酸钠作为电子受体和 电子供体的厌氧MMl培养基中，30°C下静置培养12-16小时，厌氧环境下离心获得菌体。将 菌体置于100毫升的厌氧MMl培养基中，混合振荡后，离心再次收集细胞。冷冻真空干燥获 得具有活性的干细胞。实施例4 利用EPl菌株的静息细胞产电按照实施例3表述的培养和接种方法，从IOOOml的以柠檬酸铁和乳酸钠作为电子 受体和供体的厌氧MMl培养基中获得生长对数晚期的细胞，经厌氧条件下离心后用IOOml的厌氧磷酸缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液，pH= 7. 0)重悬离心清洗细胞两次，最后再重悬于 5ml的厌氧磷酸缓冲液中，以此作为接种体采用注射法接种到微生物燃料电池的阳极中。微 生物燃料电池的阳极液和阴极液均采用50mM的磷酸钠缓冲液(pH = 7. 0)，阳极通入高纯氮 气保证厌氧环境，阴极通入空气使得氧气作为最终电子受体。电池运行的其它设置和条件 见实施例1所述，外电阻采用500欧姆，电阻两端电压用Keithley 2000型高精度万用表记 录，每间隔5min取一采样点。该静息细胞产电情况见图2所示。实例5 菌株EPl生长细胞的产电按实施例2获得产电接种细胞后悬浮于5ml厌氧的MMl培养基中，注射接种到微 生物燃料电池的阳极内。阳极液为厌氧的MMl培养基，IOmM乳酸钠作为电子供体，阴极液 除了不加氨基酸外其它成分与匪1 一致，通入空气作为电子受体。微生物燃料电池置于 26-28°C的恒温房间内运行，磁力棒混勻电极液，外电阻采用1000欧姆，端电压每隔3小时 记录一次，产电数据见图3所示。序列表<110>国家海洋局第三海洋研究所<120> 一种希瓦氏菌及其在微生物燃料电池中的应用<160>1<210>1<211>1537<212>RNA<213> 希瓦氏菌(Shewanella marisflavi)AGAGTTTGAT CATGGCTCAG ATTGAACGCT GGCGGCAGGC CTAACACATGCAAGTCGAGC GGTAACAGGA AGAAAGCTTG CTTTCTTTGC TGACGAGCGGCGGACGGGTG AGTAATGCCT AGGGAACTGC CCAGTCGAGG GGGATAACAGTTGGAAACGA CTGCTAATAC CGCATACGCC CTACGGGGGA AAAGAGGGGACCTTCGGGCC TTCTGCGATT GGATGTACCT AGGTGGGATT AGCTAGTAGGTGAGGTAATG GCTCACCTAG GCGACGATCC CTAGCTGTTC TGAGAGGATGATCAGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC GGGAGGCAGCAGTGGGGAAT ATTGCACAAT GGGCGCAAGC CTGATGCAGC CATGCCGCGTGTGTGAAGAA GGCCTTCGGG TTGTAAAGCA CTTTCAGCGA GGAGGAAAGGTTAAGTGTTA ATAGCACTTA GCTGTGACGT TACTCGCAGA AGAAGCACCGGCTAACTTCG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA CGAGGGGTGC AAGCGTTAATCGGAATTACT GGGCGTAAAG CGTACGCAGG CGGTTTGTTA AGCGAGATGTGAAAGCCCCG GGCTCAACCT GGGAACTGCA TTTCGAACTG GCAAACTAGAGTCTTGTAGA GGGGGGTAGA ATTTCAGGTG TAGCGGTGAA ATGCGTAGAGATCTGAAGGA ATACCGGTGG CGAAGGCGGC CCCCTGGACA AAGACTGACGCTCAGGTACG AAAGCGTGGG GAGCAAACAG GATTAGATAC CCTGGTAGTCCACGCCGTAA ACGATGTCTA CTCGGAATTT GGTGTCTTGA ACACTGGGTTCTCAAGCTAA CGCATTAAGT AGACCGCCTG GGGAGTACGG CCGCAAGGTTAAAACTCAAA TGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG AGCATGTGGT
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950
TTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAA1000
TTCGCTAGAGATAGCTTAGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCA1050
TGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA1100
GCGCAACCCTTATCCTTACTTGCCAGCGGGTCATGCCGGGAACTTTAGGG1150
AGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCA1200
TGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGAGTACAGAGG1250
GTTGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCAGAAAGCTCGTCGTAGTCCG1300
GATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGT1350
GGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC1400
GTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTAGATAGCTTAACCTTCGG1450
GAGGGCGTTTACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAG1500
GTAGCCCTAGGGGAACCTGGGGCTGGATCACCTCCTT153权利要求
一种希瓦氏菌，其特征在于该希瓦氏菌(Shewanella marisflavi EP1)在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M 209016。
2.如权利要求1所述的一种希瓦氏菌，其特征在于该希瓦氏菌的革兰氏染色阴性，菌 体为杆状，菌体直，两端圆形，直径为0. 3 1. 0微米，长度为2. 5 6. 0微米，可单独存在 或以成对、短链状排列，菌体具有单生菌毛，能移动。
3.如权利要求1所述的一种希瓦氏菌，其特征在于该希瓦氏菌16SrRNA基因序列为 SEQ ID NO 1中所述的序列。
4.如权利要求1所述的一种希瓦氏菌，在微生物燃料电池中产电的应用。
5.如权利要求4所述的一种希瓦氏菌在微生物燃料电池中产电的应用，其特征在于 (1)以乳酸作为电子供体直接用于微生物燃料电池中进行产电；或(2)用冷冻干燥的菌体 制成静息细胞进行产电；或(3)以废水或淤泥中的营养成分进行产电；或(4)该菌吸附或 包埋在电极载体上的固定化细胞作微生物燃料电池的阳极催化剂。
全文摘要
一种希瓦氏菌及其在微生物燃料电池中的应用，涉及生物技术领域。本发明的希瓦氏菌为Shewanella marisflavi EP1，2009年1月保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号为CCTCC M 209016；其革兰氏染色阴性，菌体为杆状，菌体直，两端圆形，直径为0.3～1.0微米，长度为2.5～6.0微米，可单独存在或以成对、短链状排列，菌体具有单生鞭毛，能移动；从近海的海洋沉积物中分离得到，具有宽广的盐离子浓度耐受活性，能够在高达8％的NaCl浓度电极液内产电，从而有效的降低了微生物燃料电池的内电阻。
文档编号C12R1/01GK101880638SQ20091014094
公开日2010年11月10日 申请日期2009年5月6日 优先权日2009年5月6日
发明者吴穗洁, 章晓波, 黄杰勋 申请人:国家海洋局第三海洋研究所