专利名称：一种高产量的结冷胶发酵制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵领域，特别是一种微生物多糖--结冷胶的高产发酵制 备方法。
背景技术：
结冷胶是一种从水百合上分离所得的格兰氏阴性菌-少动鞘氨醇单胞菌
(5^/w>2gomcwas/7m/c^o6//&)-所产生的胞外多糖，有着用量低，透明度高， 香气释放能力强，耐酸，耐碱等优点。结冷胶可在各类食品中广泛使用，可以 说是目前性能最为优异的增稠剂、稳定剂之一，并具有优良的凝胶特性。它在 食品、日化、医药等行业有广泛的用途。结冷胶在1988年于日本被批准在食品 中的应用，1992年美国FDA批准其在食品中的运用，欧共体于1994年将其正 式列入食用安全代码(E-418)表中，我国则于1996年把结冷胶列入GB2760 — 1996中，批准其作为食品增稠剂、稳定剂，可在各类食品中按正常生产需要适 量使用。
结冷胶的单糖分子组成是葡萄糖，鼠李糖，葡萄糖酸，乙酸脂，L-甘油酸 脂基团，主链是一个线性四糖重复单位，由1，3-和1,4-连接的葡萄糖单位，1,3-连接的葡萄糖酸单位和1,4-连接的鼠李糖单位组成。分子量为0.5X1()S道尔顿。
目前国内有不少企业和科研机构在进行结冷胶产品的发酵研究，但效果不 是很理想，主要表现在发酵时间长、产品得率低、生产成本高等问题
发明内容
本发明在现行发酵生产工艺基础上，选用好氧格兰氏阴性菌-少动鞘氨醇单
胞菌(^/^gomomw; "w"'m(^Zto)，进行发酵工艺控制的方法。主要过程包括结 冷胶种子液的pH， OD值控制，并在发酵过程中补入无菌水，控制发酵培养过 程搅拌转速及进空气的温度，达到发酵周期由原来的50 60h縮短至40 45h，粗 多糖含量由1.5 1.6g/100ml提高至2.0 2.5g/100ml，真正实现了结冷胶低能高产 的目的，并且大大提高了设备的有效利用率。
本发明易于实现，耗能低，通过发酵后期补入无菌水的方法，解决了发酵 后期溶解氧低的矛盾，增大了放罐体积，提高了单罐产量；通过对发酵整个过 程进气温度的有效控制，三级发酵罐温控制在30-34。C培养，縮短了发酵周期。 使放罐粗多糖浓度达到2.0 2.5g/100ml。
本发酵工艺在实行过程中操作简单，耗用成本低，较传统的发酵方法可以 节约20%的发酵和动力电能，提高15%以上的单罐产量。
本发明的高产量结冷胶发酵制备方法分为三级发酵，具体工艺流程如下
斜面 一摇瓶-^一级种子罐-^二级种子罐- 三级发酵罐
该制备方法包括以下步骤
1) 斜面菌种经扩大培养成摇瓶种子液；
2) 将摇瓶种子液接入一级种子罐无菌培养基中扩大培养；
3) 将一级种子罐中的种子液接入二级种子罐无菌培养基中扩大培养；
4) 将二级种子罐中的种子液接入三级发酵罐无菌培养基中发酵培养；
5) 收集结冷胶发酵液；
其中所述菌种为少动鞘氨醇单胞菌，并且在三级发酵罐中的培养过程中添加 无菌水。
本发明所用的少动鞘氨醇单胞菌购自江南大学。 更具体地，该方法包括
l)斜面菌种经扩大培养成摇瓶种子液，摇瓶培养基组成为蛋白胨0.3 0.6，牛肉膏0.2-0.4，酵母膏0.05 0.15，其余为水。
摇瓶扩大培养的条件为温度28-34"，周期18 30h，摇床转速150r/min;
2) 将上述制备的摇瓶种子液按一级种子培养基体积的0.01 0.03%比例接入 一级种子罐中培养， 一级种子罐的培养基组成为；
酵母浸出汁0.2 0.5，牛肉膏0.3，鱼蛋白胨0.5， DDFS-303 (食品级 消泡剂)0.0003，其余为水；
一级种子罐中扩大培养的条件为培养温度28~34°C，通风比1: 0.5，
运行压力0.05 0.08Mpa;
一级种子罐扩大培养的终点为周期13 16h， PH值在8.2以上，氨基氮
在350mg/Kg以上，OD值0.1 ±0.02。 OD值检测为紫外可见分光光度计 H0605019，波长520nm。
3) 将上述制备的一级种子罐中的种子液按二级种子培养基体积的8~12%比 例接入二级种子罐中培养，二级种子罐中的培养基组成为；
白糖2.0~3.0，酵母浸出汁0.1~0.3，大豆蛋白粉0.2 0.4， KH2P04: 0.05， K2PH04: 0.05， MgS04: 0.06， DDFS-303: 0.0003，其余为水；
二级种子罐中的条件为培养温度28 34°C，通风比1: 0.5，运行压力
0.05 0.08Mpa;
二级种子罐扩大培养的终点为周期6 8h， pH值在6.0 6.6，氨基氮在 40 80mg/Kg之间，OD值0.4±0.02。 OD值检测为紫外可见分光光度计 H0605019,波长520nm。
4) 将上述制备的二级种子罐中的种子液按三级发酵培养基体积的5~9%比 例接入三级发酵罐中培养，三级发酵罐的培养基组成为；
白糖2.5~3.5，大豆蛋白粉0.5 0.8， KH2P04: 0.1， MnS04.H20: 0.025， K2HP04: 0.15， MgS04: 0.06， DDFS-303: 0.0003， H3B03: 0.003，其余为水；
三级发酵罐中的培养条件为发酵培养温度:30 34。C,运行压力0.05 0.08Mpa;
发酵搅拌使用变频调速搅拌，风量根据发酵时间分段控制进气量来控制；
发酵搅拌使用变频调速搅拌，具体控制的变频转速如下
Oh 160r(min 10h 18Qr/min 20h 2g0r/min 放罐
风量根据发酵时间分段控制进气量来控制，具体控制参数如下；
Oh 1000n^3/h 12h 150Qm3/h 3Oh IgOO m3/h 放罐
发酵黏度达4000cp以上时，按发酵液体积比例补入10%的无菌水，分3次
补入，频率每两小时一次。
三级发酵罐培养的终点为放罐黏度在7000~9000cp，残糖比例控制在
0.2~0.4。
从一级种子罐至发酵罐的整个发酵过程中，进气空气温度控制在25 30°C， 使发酵罐内培养发酵液的温度更精确地控制在工艺要求范围内，利于微生物多 糖的生长合成。
除非另外指出，本发明的培养基以重量(g) /体积(L)百分比计。例如，以 摇瓶培养基组成为例称取蛋白胨0.3 0.6g，牛肉膏0.2 0.4g，酵母膏0.05 0.15g，
溶解于适量水中后，用水补足体积至l升。
具体实施例方式
提出以下实施例来具体说明，以更好地理解本发明，但该实施例为非限制 性的。
以5L摇瓶，500L—级种子罐，5T二级种子罐，50T三级发酵罐为例。实 用体积为一级种子罐300L， 二级种子罐3T，三级发酵罐35T，即罐中添加的培 养基体积。
具体制备方法包括以下步骤
1)接种针在洁净操作台上划取少量斜面种子，接入摇瓶培养基培养。
7摇瓶培养基组成为
蛋白胨0.5，牛肉膏0.3，酵母膏0.1，其余为水。
摇瓶培养的条件为温度30。C，周期24h，摇床转速150r/min。
2) 将上述制备的摇瓶种子液按一级种子培养基体积的0.017%比例接入一级
种子罐中培养
一级种子罐的培养基组成为；
酵母浸出汁0.4，牛肉膏0.3，鱼蛋白胨0.5， DDFS-303: 0.0003，
其余为水；
一级种子罐中的培养条件为培养温度30°C，通风比1: 0.5，运行压力
0.06Mpa;
一级种子罐的培养终点为周期15h， pH值在8.32，氨基氮365mg/Kg， OD值0.086。 OD值检测为紫外可见分光光度计H0605019，波长520nm。
3) 将上述制备的一级种子罐中的种子液按二级种子培养基体积的10%比例 接入二级种子罐中培养
二级种子罐的培养基组成为；
白糖2.5，酵母浸出汁0.2，大豆蛋白粉0.3， KH2P04: 0.05， K2PH04: 0.05， MgS04: 0.06， DDFS國303: 0.0003，其余为水；
二级种子罐中的培养条件为培养温度30°C，通风比1: 0.5，运行压力
0.06Mpa;
二级种子罐的培养终点为周期7h， pH值在6.56，氨基氮在56mg/Kg， OD值0.410。 OD值检测为紫外可见分光光度计H0605019，波长520nm。
4)将上述制备的二级种子罐中的种子液按发酵培养基体积的8%比例接入三 级发酵罐中培养
发酵罐的培养基组成为
白糖3.0，大豆蛋白粉0.7， KH2P04: 0.1， MnS04.H20: 0.025，K2HP04: 0.15， MgS04: 0.06， DDFS-303: 0.0003， H3B03: 0.003，其余 为水；
三级发酵罐中的培养条件为
发酵培养温度32.5°C，运行压力0.06Mpa; 发酵搅拌使用变频调速搅拌，具体控制的变频转速如下 Oh 160r/min 10h 180r/min 20h 220r/min 放罐 风量根据k酵时间分段i制进气量来控fej，具体控制参数如下； Oh 1000m3/h 12h 1500 m3/h 30h 1800 m3/h 放罐 发酵黏度达4000cp以上，按罐中发酵液体积按10%的比例补入无菌水，即 3.5T。分3次补入，频率每两小时一次。
三级发酵罐中的培养终点为放罐黏度在8500cp，残糖比例控制在0.29。 从一级种子罐到发酵罐的整个发酵过程中，进气空气温度控制在25 30°C, 使发酵罐内培养发酵液的温度更精确地控制在工艺要求范围内，利于微生物多 糖的生长合成。
发酵结束后，收集发酵液，取定量的发酵液用水溶解摇匀，再离心，使用 离心后的上层溶液加入酒精浸泡，抽滤后烘干，得粗多糖浓度在2.05g/100ml。 较文献记载的单罐粗多糖浓度最高1.6g/100ml提高了 28%。
权利要求
1.一种高产量的结冷胶发酵制备方法，其包括以下步骤1)斜面菌种经扩大培养成摇瓶种子液；2)将摇瓶种子液接入一级种子罐无菌培养基中扩大培养；3)将一级种子罐中的种子液接入二级种子罐无菌培养基中扩大培养；4)将二级种子罐中的种子液接入三级发酵罐无菌培养基中发酵培养；5)收集结冷胶发酵液；其中所述菌种为少动鞘氨醇单胞菌，并且在三级发酵罐中的培养过程中添加无菌水。
2. 权利要求1的制备方法，其特征在于，摇瓶培养基的组成为蛋白胨0.3 0.6，牛肉膏0.2 0.4，酵母膏0.05~0.15，其余为水。
3. 权利要求1的制备方法，其特征在于，摇瓶扩大培养的条件为温度28-34 °C，周期18 30h，摇床转速150r/min。
4. 权利要求l的制备方法，其特征在于， 一级种子罐中的培养基组成为 酵母浸出汁0.2 0.5，牛肉膏0.3，鱼蛋白胨0.5， DDFS-303: 0.0003，其余为水；以重量/体积百分比计。
5. 权利要求l的制备方法，其特征在于， 一级种子罐中扩大培养的条件为培养温度28~34°C，通风比1: 0.5，运行压力0.05 0.08Mpa。
6. 权利要求l的制备方法，其特征在于， 一级种子罐扩大培养的终点为周期:13 16h， pH值在8.2以上，氨基氮在350mg/Kg以上，OD520nm值0.1 ± 0.02。
7. 权利要求l的制备方法，其特征在于，二级种子罐中的培养基组成为白糖2.0 3.0，酵母浸出汁0.1 0.3，大豆蛋白粉0.2 0.4, KH2P04: 0.05， K2PH04: 0.05， MgS04: 0.06， DDFS-303: 0.0003，其余为水。
8. 权利要求1的制备方法，其特征在于，二级种子罐的培养条件为培养温度:28 34。C，通风比h 0.5，运行压力0.05 0.08Mpa。
9. 权利要求l的制备方法，其特征在于，二级种子罐扩大培养的终点为周期:`6 8h， pH值在6.0 6.6，氨基氮在40 80mg/Kg之间，OD520nm值0.4±0.02。
10. 权利要求l的制备方法，其特征在于三级发酵罐中的培养基组成为白糖:`2.5~3.5，大豆蛋白粉0.5~0.8， KH2P04: 0.1， MnS04'H20: 0.025， K2HP04: 0.15， MgS04: 0.06， DDFS-303: 0.0003, H3B03: 0.003，其余为水。
全文摘要
一种高产量的结冷胶发酵制备方法，其包括以下步骤1)斜面菌种经扩大培养成摇瓶种子液；2)将摇瓶种子液接入一级种子罐无菌培养基中扩大培养；3)将一级种子罐中的种子液接入二级种子罐无菌培养基中扩大培养；4)将二级种子罐中的种子液接入三级发酵罐无菌培养基中发酵培养；5)收集结冷胶发酵液；其中所述菌种为少动鞘氨醇单胞菌，并且在三级发酵罐中的培养过程中添加无菌水。使用本发明的方法，可以将发酵周期由原来的50～60h缩短至40～45h，粗多糖含量由1.5～1.6g/100ml提高至2.0～2.5g/100ml，真正实现低能高产的目的。
文档编号C12R1/01GK101586135SQ20091014390
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月3日 优先权日2009年6月3日
发明者倪井广, 吴荣明, 杨宝毅, 潘小玉, 梅 陈 申请人:浙江中肯生物科技有限公司