专利名称：固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞及d(-)-酒石酸或其盐的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工 程菌细胞的制备方法，以及使用固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞 制备D (-)-酒石酸或其盐的方法。
背景技术：
D(-)-酒石酸，又名(2S，3S)-2，3-二羟丁烷-1，4-二羧酸，是天然L(+)-酒石 酸的同型异构体，在自然界中极少存在，在制药行业中它主要作为手性合成的 手性源及拆分剂。目前D(-)-酒石酸的需求量正在逐年递增，迫切需要提高产量， 以满足国内外的需求。
当前生产D(-)-酒石酸的方法有化学拆分法、生物拆分法、生物转化法。 化学拆分法是指利用拆分剂实现DL-酒石酸分离得到D(-)-酒石酸和L(+)-酒石 酸，但这类手性拆分剂价格昂贵， 一次性拆分后对映体光学纯度和得率较低， 且后续分离纯化工艺复杂，生产成本居高不下；生物拆分法是指利用特殊的微 生物将DL-酒石酸中的L (+)-酒石酸耗竭而得到D (-)-酒石酸，但产物D (-)-酒 石酸的得率最高只有50%，制备成本高；生物转化法是指利用微生物分泌表达的 顺式环氧琥珀酸水解酶("r印oxysuccinate hydrolase, ESH)将顺式环氧琥 珀酸或其盐催化水解为D(-)-酒石酸或其盐，它具有酶立体专一性好、酶促反应 快、产品光学纯度和产品得率高、产品分离纯化简单易行，经济环保等特点， 已成为D(-)-酒石酸生产技术的发展方向。
中国专利文献CN101481681A公开了利用重组技术构建基因工程菌 pET22b-ESH-E. coli BL21 (DE3)的方法。其中ESH酶基因(GenBank登记号为 EU053208)来源于博得特氏菌BK-52 (Bo油tella sp. BK-52，保藏单位中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心；菌种保藏号为CGMCC No. 2075; 保藏日期2007年6月11日)，将该ESH酶基因插入pET22b载体中，在大肠杆 菌细胞中以胞内酶的形式实现了高效表达，这是生物转化法工业生产D (-)-酒石 酸的重大突破。但是用游离细胞转化生产D(-)-酒石酸存在以下几个问题(1) 基因工程菌细胞利用率低下。高顺式环氧琥珀酸水解酶活力的基因工 程菌细胞只能使用一次，成本高，污染大。
(2) 基因工程菌细胞的顺式环氧琥珀酸水解酶活力偏低， 一般为3278 U/g。
由于顺式环氧琥珀酸水解酶属于胞内酶，与底物接触的机会受制于细胞膜的通 透性，导致其催化活性的降低。
(3) 产物杂质多。在利用游离基因工程菌细胞催化顺式环氧琥珀酸或其盐 生成D(-)-酒石酸或其盐的反应体系中存留有大量的菌体、蛋白等杂质，增加了 后续产物分离纯化工艺的负担。
固定化微生物细胞是20世纪60年代酶学领域崛起的新技术，在化工、医 药、发酵、能源、食品等行业中实际运用效果显著。它是利用化学或物理的手 段将游离细胞定位于限定的空间区域，以利于细胞内的一种酶或多种酶进行生 物催化，并保持细胞活性,可反复使用的一种技术。与传统游离细胞相比，固定
化细胞有如下优点单位体积的菌体密度高、菌体易回收、酶活力高等。但目
前国内外还没有关于固定化细胞生产D(-)-酒石酸的报道。因此利用细胞固定化 技术生产D (-)-酒石酸具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的 方法，用以提高细胞内顺式环氧琥珀酸水解酶活力和细胞使用率。
本发明的另一个目的是提供一种使用上述固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基 因工程菌细胞生产D(-)-酒石酸或其盐的方法。
为实现上述发明目的，本发明提供了如下固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基
因工程菌细胞的方法在k -卡拉胶溶液中加入顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程 菌细胞充分混合均匀，将上述混合溶液冷却直至充分凝固后再在氯化钾溶液中 固定，然后将凝胶取出切成小块，依次用蒸馏水和生理盐水洗涤。
进一步地，本发明所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞为pET-ESH-￡ co/i，该基因工程菌细胞与所述k-卡拉胶溶液在42-45。C的条件下均匀混合， 冷却温度为4-10 。C ，所述氯化钾溶液的浓度为0.1-0.5 mol/L，所述固定的 温度为4-10。C，固定的时间为4-16 h。
进一步地，本发明所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞与k -卡拉胶 溶液在42 。C的条件下均匀混合，冷却温度为4 °C ，所述氯化钾溶液的浓度为0.3 mol/L，所述固定的温度为4 。C，固定的时间为10 h。
进一步地，本发明所述k -卡拉胶的浓度为20-60 g/L;相对于每升k -卡 拉胶溶液，所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的添加量为20-120 g。
进一歩地，本发明所述k -卡拉胶的浓度为30-50 g/L;相对于每升ic -卡 拉胶溶液，所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的添加量为40-100 g。
进一步地，本发明所述k -卡拉胶的浓度为40-50 g/L;相对于每升k -卡 拉胶溶液，所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的添加量为60-80 g。
本发明使用固定化基因工程菌细胞制备D(-)-酒石酸或其盐的方法是在顺 式环氧琥珀酸或其盐溶液中加入固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞 进行酶促反应，生成D(-)-酒石酸或其盐。
进一步地，本发明所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞为pET-ESH-E coh'，所述顺式环氧琥珀酸或其盐溶液的浓度为0.5-1.0mol/L，所述顺式环氧 琥珀酸或其盐溶液的pH值为6.0-8.0，所述酶促反应的反应温度为30-40 °C。
进一步地，本发明所述顺式环氧琥珀酸或其盐溶液的浓度为0.5mol/L，所 述顺式环氧琥珀酸或其盐溶液的pH值为7. O，所述酶促反应的反应温度为30°C。
本发明所涉及的顺式环氧琥珀酸盐为顺式环氧琥珀酸与各种阳离子形成的 盐，阳离子包括但不仅限于铵离子、钾离子、钠离子、镁离子和钙离子等。
本发明涉及顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞pET22b-ESH-￡ BL21(DE3)，其制备方法已在中国专利文献CN101481681A中公开，其中pET22b 为表达载体，ESH为顺式环氧琥珀酸水解酶，EcoJiBL21(DE3)为宿主细胞。该 专利文献同时公开了一种用于编码本发明所涉及的顺式环氧琥珀酸水解酶的核 苷酸序列，其来源于分离纯化的博德特氏菌(^^ofe"Jis sp.)，优选为在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心保藏的保藏号为CGMCC No. 2075 的微生物。
相对于现有技术，本发明所取得的有益效果在于
1. 本发明的固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的顺式环氧琥珀 酸水解酶活力为游离顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的4倍以上。
2. 填补了国内外关于利用固定化基因工程菌细胞生产D(-)-酒石酸或其盐技术 的空白。
3. 本发明利用固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞制备D(-)-酒石 酸或其盐的方法，与游离基因工程菌细胞相比，具有细胞利用率高、酶活力高的优点，具体体现在以下几个方面
(1) 固定化技术使基因工程菌细胞的顺式环氧琥珀酸水解酶活力有了大幅 度的提高；
(2) 固定化技术使基因工程菌细胞得以循环利用；
(3) 本发明所涉及的固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞重复使 用10批后，D(-)-酒石酸产品光学纯度和得率高。
生物材料样品的保藏信息
保藏的生物材料样品博德特氏菌(A rofe&Ws Sp.);
保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC); 保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所
(邮编100101); 保藏日期2007年6月11日；
保藏登记号CGMCC No. 2075
具体实施例方式
在本发明的以下实施例中，有关的检测方法如下
(1) 游离基因工程菌细胞顺式环氧琥珀酸水解酶活力检测方法0. 1 g经
4 。C高速离心(5000Xg， 10 min)收获的基因工程菌细胞用10 ml 0.5 mol/L 顺式环氧琥珀酸钠(pH7.0)悬浮后，30。C下震荡反应l h后，测定反应液中 酒石酸的含量。酶活力单位定义为在上述反应条件下，1 g经4 。C高速离心(5000 Xg， 10 min)收获的基因工程菌细胞l h催化生成l Mraol酒石酸所需的酶量， 单位用U/g表示。
(2) 固定化基因工程菌细胞顺式环氧琥珀酸水解酶活力检测方法取由0. 1 g经4 。C高速离心(5000Xg， 10 min)收获的基因工程菌细胞制备而成的固定 化基因工程菌细胞(3*3*3腿3凝胶方块)，用10 ml 0.5 mol/L顺式环氧琥珀 酸钠(pH7.0)悬浮后，3(TC下震荡反应lh后，测定反应液中酒石酸的含量。 酶活力单位定义为在上述反应条件下，由lg经4。C高速离心(5000Xg， 10min) 收获的基因工程菌细胞制备而成的固定化基因工程菌细胞1 h催化生成1 Mmol 酒石酸所需的酶量，单位用U/g表示。
(3) 酒石酸含量的检测方法取2.5 ml 10 g/L的偏钒酸铵于25 ml的容
7量瓶中，依次加入一定体积的酒石酸标准品溶液、1 ml 1 mol/L硫酸溶液，振 摇显色，并用蒸馏水定容至刻度，测定显色液在480 nm处的吸光度值，以酒石 酸加入量对显色液480 nm处的吸光度值作线性回归图，即得标准曲线。依上述 步骤，以一定体积的样品溶液替代一定体积的酒石酸标准品溶液，即可得样品 显色液在480 nm处的吸光度值，根据前述标准曲线，即可计算得到样品溶液中 酒石酸的含量。
(4)固定化基因工程菌细胞机械强度测定方法将固定化基因工程菌凝胶 切制成10*10*10 mm3的立方体，置于天平上，用适当重量的砝码对其正面逐渐 均匀加压直至压扁不再弹回或破裂时，用破裂时天平上的数值表征固定化基因 工程菌细胞的平均机械强度，单位用g/cm2表示。
实施例1:
根据中国发明专利申请CN101481681A所揭示的方法制备得到顺式环氧琥珀 酸水解酶基因工程菌细胞pET22b-ESH-￡ coh' BL21 (DE3)。将1 g经4 。C高速 离心(5000 Xg， 10 min)收获的游离基因工程菌细胞pET22b-ESH-￡ BL21(DE3)(游离基因工程菌细胞pET22b-ESH-A coh'BL21 (DE3)的顺式环氧琥 珀酸水解酶活力为3278 U/g)加入到10 ml 30 g/lk -卡拉胶溶液中，于42 。C 的条件下混合均匀，4。C的条件下冷却，凝固后用0.3mol/L氯化钾溶液于4。C 的条件下固定10h。取部分凝胶，将凝胶切成3*3*3 mm3的小块，依次分别用蒸 馏水和生理盐水洗涤。结果显示，上述固定化基因工程菌pET22b-ESH-￡ co7j' BL21 (DE3)的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为29047 U/g，机械强度达1107 g/cm2。
实施例2:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中基因工程菌细胞加入 量为l g， k-卡拉胶浓度为20 g/L，其余条件不变。结果显示，所制备得到的 固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为22935 U/g，机械强度达1664 g/cm2。
实施例3:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中基因工程菌细胞加入 量为l g， k-卡拉胶浓度为40 g/L，其余条件不变。结果显示，所制备得到的
8固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为31777 U/g，机械强度达1019
g/cm2。
实施例4:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中基因工程菌细胞加入 量为1 g， k -卡拉胶浓度为50 g/L，其余条件不变。结果显示，所制备得到的 固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为31126 U/g，机械强度达1402 g/cm2。
实施例5:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中基因工程菌细胞加入 量为l g， k -卡拉胶浓度为60 g/L，其余条件不变。结果显示，所制备得到的 固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为27094 U/g，机械强度达2255 g/cm 。
实施例6:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中基因工程菌细胞加入 量为0.2 g， k-卡拉胶浓度为30 g/L，其余条件不变。结果显示，所制备得到 的固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为13885 U/g，机械强度达 759 g/cm2。
实施例7:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中基因工程菌细胞加入 量为0.4g， k -卡拉胶浓度为30 g/L，其余条件不变。结果显示，所制备得到 的固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为23570 U/g，机械强度达 1183 g/cm2。
实施例8:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中基因工程菌细胞加入 量为0.6 g， k-卡拉胶浓度为30 g/L，其余条件不变。结果显示，所制备得到 的固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为29325 U/g，机械强度达1383 g/cm2。 实施例9:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中基因工程菌细胞加入 量为0.7g， k-卡拉胶浓度为30 g/L，其余条件不变。结果显示，所制备得到 的固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为30729 U/g，机械强度达 1398g/cm2。
实施例10:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中基因工程菌细胞加入 量为0.8g， k-卡拉胶浓度为30 g/L，其余条件不变。结果显示，所制备得到 的固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为31151 U/g，机械强度达 1357 g/cm2。
实施例11:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中基因工程菌细胞加入 量为1.2g， k -卡拉胶浓度为30 g/L，其余条件不变。结果显示，所制备得到 的固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为23013 U/g，机械强度达 631 g/cm2。
实施例12:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中基因工程菌细胞加入 量为0.7g， k -卡拉胶浓度为40 g/L，其余条件不变。结果显示，所制备得到
的固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为33545 U/g，机械强度达 1529 g/cm2。
实施例13:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中基因工程菌细胞与k -卡拉胶溶液的混匀温度为45。C，其余条件不变。结果显示，所制备得到的固定 化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为29000 U/g，机械强度达1107 g/cm2。实施例14:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中基因工程菌细胞与K -卡拉胶溶液混匀后，冷却温度为io。c，其余条件不变。结果显示，所制备得到 的固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为29007 U/g，机械强度达 1106 g/cm2。
实施例15:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中氯化钾溶液的浓度为 0.1mol/L，其余条件不变。结果显示，所制备得到的固定化基因工程菌的顺式 环氧琥珀酸水解酶活力为29017 U/g，机械强度达1100 g/cm2。
实施例16:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中氯化钾溶液的浓度为 0.5mol/L，其余条件不变。结果显示，所制备得到的固定化基因工程菌的顺式 环氧琥珀酸水解酶活力为29023 U/g，机械强度达1110 g/cm2。
实施例17:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中固定温度为10。C，其 余条件不变。结果显示，所制备得到的固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水 解酶活力为29013 U/g，机械强度达1106 g/cm2。
实施例18:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中固定时间为4h，其余 条件不变。结果显示，所制备得到的固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水解 酶活力为29021 U/g，机械强度达1105 g/cm2。
实施例19:
按实施例1的方法制备固定化基因工程菌细胞，其中固定时间为16 h，其 余条件不变。结果显示，所制备得到的固定化基因工程菌的顺式环氧琥珀酸水 解酶活力为29024 U/g，机械强度达1109 g/cm2。
ii对比例
用0. 1 g游离基因工程菌细胞pET22b-ESH-& BL21 (DE3)于200 ml 0. 5 mol/L顺式环氧琥珀酸钠(pH7.0)中，30。C恒温条件下，慢速搅拌转化20 h， 转化率达100%， D(-)-酒石酸对映体过量值(enantiomeric excess)为99. 9%。 反应结束后，4 。C高速离心(5000Xg， 10 min)回收游离基因工程菌细胞，将 其重新投入200 ml 0.5 mol/L顺式环氧琥珀酸钠(pH 7.0)中，30 。C转化20 h，转化率为35%, D(-)-酒石酸对映体过量值为99. 7%。继续重复以上步骤(过 滤回收游离基因工程菌细胞，于上述条件下转化)8次后，即游离基因工程菌细 胞重复使用了10次后，转化率基本为09L
实施例20:
按实施例12的方法制备固定化基因工程菌细胞pET22b-ESH-A BL21(DE3)，取相当于由0. 1 g游离基因工程菌细胞制备而成的固定化基因工 程菌细胞，将该固定化基因工程菌细胞加入到pH为7.0、浓度为0.5mol/L的 200 ml顺式环氧琥珀酸钠中，3(TC恒温条件下，慢速搅拌转化4 h，转化率达 100%， D(-)-酒石酸对映体过量值为99.9%。反应结束后，过滤回收固定化基因 工程菌细胞，将其重新投入200 ml 0. 5 mol/L顺式环氧琥珀酸钠(pH 7. 0)中， 30 。C转化4 h，转化率为99. 5%， D(-)-酒石酸对映体过量值为99. 8%。继续 重复以上步骤(过滤回收固定化基因工程菌细胞，于上述条件下转化)8次后， 即固定化基因工程菌细胞重复使用了 IO次后，转化率为93%， D(-)-酒石酸对映 体过量值为99.6%。与对比例相比，转化10批后，固定化基因工程菌细胞的底 物转化率(93%)远高于游离基因工程菌细胞(0%)。
实施例21:
按实施例12的方法制备固定化基因工程菌细胞pET22b-ESH-￡ BL21(DE3)，取相当于由O. 1 g游离基因工程菌细胞制备而成的固定化基因工程 菌细胞加入到200 ml 0.5 mol/L顺式环氧琥珀酸钠(pH 7.0)中，40 。C恒温 条件下，慢速搅拌转化4 h，转化率为100%， D(-)-酒石酸对映体过量值为99. 9%。
实施例22:
12按实施例21的方法生产D(-)-酒石酸，其中顺式环氧琥珀酸钠的浓度为1. 0mol/L，体积为100 ml，其余条件不变，转化率为95%， D(-)-酒石酸对映体过量值为99. 8%。
实施例23:
按实施例21的方法生产D(-)-酒石酸，其中顺式环氧琥珀酸钠的pH为6. 0，其余条件不变，转化率为96%， D(-)-酒石酸对映体过量值为99.8%。
实施例24:
按实施例21的方法生产D(-)-酒石酸，其中顺式环氧琥珀酸钠的pH为8. 0，其余条件不变，转化率为93%， D(-)-酒石酸对映体过量值为99.7%。
以上实施例所用的基因工程菌pET22b-ESH-《 乃'BL21(DE3)，其中，pET22b为表达载体，￡ coh'BL21(DE3)为宿主细胞。本发明还可采用其它表达载体，例如pET15b、 pET28a、 pET39b、 pPR。EX HTb或pGEX-4T-2等;宿主细胞还可以使用K DH5a、 ￡ JM109、 ￡ co/i TG1或f co7j' Top10
等。将构建的这些顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌进行固定化实验，实验结果与以上实施例基本一致。
权利要求
1.一种固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的制备方法，其特征是在κ-卡拉胶溶液中加入顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞充分混合均匀，将上述混合溶液冷却直至充分凝固后再在氯化钾溶液中固定，然后将凝胶取出切成小块，依次用蒸馏水和生理盐水洗涤。
2. 根据权利要求1所述的固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的制备方法，其特征是所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞为pET-ESH-￡ co力'，该基因工程菌细胞与所述k-卡拉胶溶液在42-45 。C的条件下均匀混合， 冷却温度为4-10 。C ，所述氯化钾溶液的浓度为0.1-0.5 mol/L，所述固定的 温度为4-10。C，固定的时间为4-16 h。
3. 根据权利要求2所述的固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的 制备方法，其特征是所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞与k -卡拉胶 溶液在42 0C的条件下均匀混合，冷却温度为4。C ，所述氯化钾溶液的浓度为 0.3 mol/L，所述固定的温度为4 。C，固定的时间为10 h。
4. 根据权利要求2或3所述的固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细 胞的制备方法，其特征是所述k -卡拉胶的浓度为20-60 g/L;相对于每升K -卡拉胶溶液，所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的添加量为20-120 g。
5. 根据权利要求4所述的固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的 制备方法，其特征是所述k -卡拉胶的浓度为30-50 g/L;相对于每升k -卡 拉胶溶液，所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的添加量为40-100 g。
6. 根据权利要求5所述的固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的 制备方法，其特征是所述k-卡拉胶的浓度为40-50 g/L;相对于每升k-卡 拉胶溶液，所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的添加量为60-80 g。
7. —种使用权利要求l的固定化基因工程菌细胞制备D(-)-酒石酸或其盐的 方法，其特征是在顺式环氧琥珀酸或其盐溶液中加入固定化顺式环氧琥珀酸 水解酶基因工程菌细胞进行酶促反应，生成D(-)-酒石酸或其盐。
8. 根据权利要求7所述的制备D(-)-酒石酸或其盐的方法，其特征是所述 固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞为pET-ESH-￡ h'，所述顺式环 氧琥珀酸或其盐溶液的浓度为0. 5-1. 0 mol/L，所述顺式环氧琥珀酸或其盐溶液 的pH值为6.0-8.0，所述酶促反应的反应温度为30-40 °C。
9. 根据权利要求8所述的制备D(-)-酒石酸或其盐的方法，其特征是所述顺式环氧琥珀酸或其盐溶液的浓度为0. 5 mol/L，所述顺式环氧琥珀酸或其盐 溶液的pH值为7. 0，所述酶促反应的反应温度为30 °C。
全文摘要
本发明公开了一种固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞及D(-)-酒石酸或其盐的制备方法。本发明固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的制备方法是在κ-卡拉胶溶液中加入顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞充分混合均匀，将上述混合溶液冷却至充分凝固后再在氯化钾溶液中固定，然后将凝胶取出切成小块，依次用蒸馏水和生理盐水洗涤。在顺式环氧琥珀酸或其盐溶液中加入上述固定化基因工程菌细胞进行酶促反应，则生成D(-)-酒石酸或其盐。本发明的固定化顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞pET-ESH-E.coli的顺式环氧琥珀酸水解酶活力为游离顺式环氧琥珀酸水解酶基因工程菌细胞的4倍以上，可循环利用，并使D(-)-酒石酸产品光学纯度和得率提高。
文档编号C12N11/00GK101649314SQ20091015248
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月14日 优先权日2009年9月14日
发明者张建国, 潘海峰, 谢志鹏, 鲍文娜 申请人:杭州宝晶生物化工有限公司