专利名称：水稻抗稻瘟病基因Pi 25的特异性分子标记及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明属于鉴定水稻抗病基因的分子生物学领域，特别是检测水稻抗稻 瘟病基因的分子标记及其专用引物。
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国第一大粮食作物。稻瘟
病是由子囊菌尸j^icyZarj's grises (无性世代 synonymous 尸jric〃Jarj.3 oryzse Cav.; 有性世代teleomorph船卵3/ orz^7e 弓l起的广泛发生 在世界各稻区最主要的水稻病害之一。据统计，从1975年至1990年的16年 间，由稻瘟病引起的全球粮食损失高达1.57亿吨，平均每年近一千万吨；自 20世纪90年代以来，我国水稻稻瘟病年发病面积均在300万公顷以上，年损 失稻谷产量数十万吨。
目前，通常采用化学防治和种植抗病品种来控制这种病害。化学防治既 昂贵又缺乏长期有效的杀菌剂，还由于污染环境和农药残留而对人类健康构 成潜在的烕胁。抗稻瘟病品种的应用是最经济有效的防病措施，但由于稻瘟 病小种遗传的多样性和致病性的快速衍变，携带单抗性主基因的水稻新品种 往往于推广后一至数年后就丧失其抗病能力。 一般认为，多基因聚合有利于 选育具有持久抗瘟性的水稻品种。在国内外水稻品种资源的鉴定、评价和利 用研究中，也发现极少数水稻材料长期以来在人工接种和自然鉴定条件下都 表现出对稻瘟病的良好抗性，这种称之为持久抗瘟性水稻资源的发掘和利用越来越得到重视。经典遗传分析和基因定位研究结果表明，持久抗瘟性水稻 材料的稻瘟病抗性一般由多个主效基因控制，且微效基因对其抗性也具有一
定作用，但前人研究所应用的Moroberekan和Tet印等抗性资源因农艺性状 劣而难以直接应用于育种。
谷梅2号为对国内外稻瘟病小种有广谱和稳定抗性的水稻品种，是全国 稻瘟病研究协作网从38000份水稻资源中筛选出来的唯一一份半矮杆籼稻， 具有优良的农艺性状和广泛的抗性育种利用价值。利用谷梅2号和感病品种 中156配制杂交组合，采用单粒传法构建了 304个单株组成的重组自交系， 利用该重组自交系群体对谷梅2号的稻瘟病抗性遗传进行了深入的研究，鉴 定和定位了尸i ^《尸i /V I和尸i ZT四个稻瘟病抗性主基因和十多个 QTL。发现谷梅2号稳定和持久的抗瘟性是由多个主基因和微效基因共同作用 的结果，针对不同的稻瘟病小种由不同的主基因和微效基因起作用，特殊情 况下，微效基因之间存在互作。
尸2'25是一个苗叶瘟和穗瘟兼抗的基因，位于水稻第6染色体上。为精细 定位该主效基因，从中156/谷梅2号重组自交系群体中挑选两个株系G19(抗 病)和G153 (感病)构建了一个新的重组自交系(含1487个株系)对Wi^ 进行精细定位，利用图位法和生物信息学法，最终将& 25定位于A7和RG456 之间，并确定编码一个NB-ARC的基因为候选基因，利用农杆菌介导的方法， 将候选基因转入感病的粳稻品种日本晴，发现61%的转基因植株具有稻瘟病抗 性，说明该候选基因即为主效基因/V^乂由于谷梅2号是已经改良过的半矮 秆籼稻品种，具有广谱和稳定抗性，意义非常特殊，其克隆出的抗稻瘟病基 因A 25可直接在稻瘟病抗性育种中应用。常规的抗稻瘟病育种需要进行抗性鉴定，设计接种条件、季节安排等、 费时费力，且结果不是十分可靠，多数育种工作者不具备自己安排的能力。 而通过现代DNA分子标记辅助选择手段，大多数育种家的实验室都具备条件， 进行关键材料的基因型鉴定。因此开发Ai^基因特异性分子标记，成本低、 使用方法简单有效，可提高育种家把抗性基因转移到恢复系，保持系或常规 品种中的速度，可以降低育种成本、縮短品种培育周期、提高基因利用效率 和创造更高的社会经济效应。
发明内容
本发明的目的是提供检测水稻抗稻瘟病基因尸ii^的分子标记P25-l，以 提高分子标记辅助选择的效率和新品种培育的效率。
水稻抗稻瘟病基因尸i^ 的分子标记，它是用引物对SEQ IDN0:1和SEQ ID N0:2从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列。
获得权利要求1所述水稻抗稻瘟病基因A' i^的分子标记的引物对SEQ ID N0:1和SEQIDN0:2， SEQ ID N0:1核苷酸序列为GGACAGAGCAGGAACTTCAGATG， SEQ ID NO: 2的核苷酸序列为TTCTGGGTCTCAGGCGTACT。
本发明的特异性PCR引物对中，SEQ ID N(hl为上游端，自5'端至3， 端的核苷酸序列为GGACAGAGCAGGAACTTCAGATG, SEQ ID N0:2为下游端，自5， 端至3'端的核苷酸序列为TTCTGGGTCTCAGGCGTACT。该引物对能对水稻苗期 所提取的DNA进行标记鉴定，检测是否具有抗稻瘟病基因/^i^，检测的准确 性高，操作简单。由于上述引物对是基于基因内部抗感单核苷酸多态性(SNP) 差异设计的，理论上，准确率达到100%。因此，该分子标记可以作为水稻稻
5瘟病抗性育种中尸i i^基因分子标记辅助选择的应用。
图1是分子标记P25-1在等位基因间扩增产物凝胶电泳图； 其中，M: 100bp分子量标记(Toyobo，Lot No:53240A3)， 200ng;
l:谷梅2号；2:中156; 3: G19; 4: G153; 5:日本晴；6:中花ll;
R代表抗病，S代表感病。(扩增产物片段大小约为776bp。)
图2是分子标记P25-1在日本晴转基因植株的扩增产物凝胶电泳图； 其中，M: 100bp分子量标记(Toyobo, Lot No:53240A3), 200ng;
l:谷梅2号；2:中156; 3: G19; 4: G153; 5:日本晴；6:中花ll;
7-25分别表示19个以日本晴为背景的转基因单株。R代表抗病，S代表感病。 图3是分子标记P25-1在重组自交系单株里扩增产物凝胶电泳图； 其中，M: 100bp分子量标记(Toyobo，Lot No:53240A3)， 200ng;
1-21分别表示21个重组自交系群体的单株。
图4是分子标记P25-1在中花11转基因植株的扩增产物凝胶电泳图。 其中，M: 100bp分子量标记(Toyobo，Lot No:53240A3)， 200ng; l:谷梅2号；2:中花ll; 3-21分别表示19个转基因植株的单株。
具体实施例方式
本发明分子标记P25-l的具体应用包含纯实验室技术部分和对含有W 基因的转基因材料及育种群体水稻材料的检测。它的应用不限于以下实例。实施例1: P25-1检测时的DNA提取、PCR扩增和电泳分析
—、DNA提取:
1. 把2cm长的叶尖剪到1.5-ml离心管中，盖紧盖子，标上号码，置于冰上。
2. 把叶尖剪成0.5cm长的小段，放入研钵中。
3. 加入400W提取液(Tris-Hcl 50mM， pH 8. 0: EDTA 25mM， pH 8. 0; NaCl 300mM; SDS 1%)，研磨。
4. 再加入400W提取液，混匀，吸取400W到原来的1.5-ml离心管中。
5. 加入400W氯仿，混匀，12000rpm离心1分钟。
6. 小心吸取上清夜至一新的1. 5-ml离心管中，标上号码。
7. 加入800W无水乙醇，混匀，12000rpm离心3分钟，弃上清。
8. 沉淀用75%乙醇洗涤后，自然风千。
9. 用50^LTE (Tris-Hcl lOraM， pH 8.0; EDTA lmM， pH 8.0)溶解沉淀。 保存于-20° C。
10. 取IW用于PCR扩增反应。 二、 PCR扩增
PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。
1. 反应体系如下
1W10XPCR缓冲液(鼎国DH332-1) /10W; 0. 5幽SEQ ID NO : 1上游 引物/,l; 0. 5幽SEQ ID NO :2下游引物/10Pl; 0. 5单位Taq DNA聚合酶 (鼎国DH332—1)/10Pl; DNA/娜1。
2. 温度循环条件如下反应条件94°C 2分钟；94°C 30秒、57°C 30秒、72°C 45分钟，30个 循环；72°C 5分钟；4°C 10分钟。 三、PCR产物检测
接通电极，在100V恒定电压下电泳，当溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段 时(60min)，关闭电源。
取下凝胶，用2XGel redTM (Biotium， cat: 41003-0. 5ml)染色30分 钟后，应用凝胶图象分析系统Bio-red Universal Hood II (Bio-red, Cat: 76S/08184)记录结果，如图1所示。
实施例2:转W 25基因日本晴植株的P25-1标记检测
共对25个转基因日本晴植株提取DNA，进行如实施例1所述的检测过程。 结果显示25个材料里共16个扩增出谷梅2号等位基因带型；而稻瘟病接种 实验结果表明，在这16个材料里，15个个体表现对稻瘟病毒性小种抗性，只 有1个表现为感病(如图2所示)。标记和表型的吻合度为93. 7 %。
实施例3:来自中鉴100/谷梅2号的重组自交系W i"5基因的检测
对来自中鉴100/谷梅2号的重组自交系(F8)的195个株系提取DNA， 进行上述检测过程。在检测的195个植株里，有86个出现谷梅2号的带型， 与理论值97.5差异不显著(P<0.05)(如图3所示)。
实施例4:转"25基因中花11的基因型检测。
对中花11转W ^"基因82个单株提取DNA，进行上述检测过程。在检测的82个植株里，有56个出现谷梅2号的带型，(如图4所示)。序列表
〈110>中国水稻研究所
〈120〉水稻抗稻瘟病基因Pi25的特异性分子标记及其专用引物 〈130> 〈160〉 2
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 23
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 1
ggacagagca ggaacttcag atg 23
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212> DNA 〈213>人工序列
〈400〉 2
ttctgggtct caggcgtact 20
10
权利要求
1、水稻抗稻瘟病基因Pi 25的分子标记，其特征在于它是用引物对SEQID NO1和SEQ ID NO2从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列。
2、 权利要求1所述水稻抗稻瘟病基因A 25的分子标记在鉴定抗稻瘟病品种中的应用。
3、 获得权利要求1所述水稻抗稻瘟病基因尸ii^的分子标记的引物对SEQID N0:1和SEQ ID N0:2，其特征在于SEQ ID N0:1核苷酸序列为GGACAGAGCAGGAACTTCAGATG ， SEQ ID NO :2 的核苷酸序列为TTCTGGGTCTCAGGCGTACT 。
全文摘要
本发明公开了一种水稻抗稻瘟病基因Pi 25的分子标记P25-1，它是用引物对SEQ ID NO1和SEQ ID NO2从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列，可以应用于水稻稻瘟病抗性育种中Pi 25基因分子标记辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率和新品种培育的效率。本发明还公开了获得P25-1的引物对SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，SEQ ID NO1核苷酸序列为GGACAGAGCAGGAACTTCAGATG，SEQ ID NO2的核苷酸序列为TTCTGGGTCTCAGGCGTACT。该引物对能对水稻苗期所提取的DNA进行标记鉴定，检测是否具有抗稻瘟病基因Pi 25，检测的准确性高。
文档编号C12Q1/68GK101643790SQ20091015261
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月7日 优先权日2009年9月7日
发明者吴建利, 庄杰云, 施勇烽, 洁 陈 申请人:中国水稻研究所