专利名称：湖羊雌激素受体基因型的荧光定量pcr检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种湖羊雌激素受体基因型的荧光定量PCR检测试剂盒 及才企测方法。
(二)
背景技术：
湖羊属短脂尾羊，为稀有白色羔皮羊品种，主要分布于浙江省、江苏 省和上海市的部分地区，具有性成熟早、四季发情、多胎高产及生长发育 快等优异经济性状，是世界稀有而珍贵的多胎品种资源。目前，因市场产 品结构的调整和传统的选留方式，使湖羊正面临近亲繁殖、种质退化、产 羔率下降的问题，并已直接影响了湖羊产业的经济效益和持续发展。通过
对湖羊的多胎标记及多胎功能基因的研究，可为应用分子育种技术，定向 培育湖羊多胎系提供理论依据和技术基础。
雌激素受体(estrogen receptor, ESR)基因是控制湖羊多胎性能的一 个主效基因。湖羊ESR基因存在野生纯合基因型(AA)、突变杂合基因 型(AB)和突变纯合基因型(BB)三种基因型。湖羊ESR基因的B等 位基因与其高繁殖力具有相关性，三种基因型的湖羊产羔数从高到低依次 为BB、 AB、 AA。因此，从群体中筛选出BB基因型的湖羊，组建核心 育种群，对培育湖羊多胎品系、提高湖羊产业的经济效益具有十分重要的 意义。文献记载的检测绵羊ESR基因基因型的主要方法是单链构象多态 法(single strand conformation polymorphism, PCR國SSCP )。 PCR-SSCP法 使用一对引物进行普通PCR扩增，然后将特异的PCR扩增产物变性，而 后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子，将适量的单
4200910152668.
链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后通过放射性自显影、银染 或溴化乙锭显色来判断基因型。该方法操作步骤多、过程复杂、耗时较长； 所检测的片段太大时，检出率较低；当某些位置的点突变对单链DNA分 子立体构象的改变不起作用或作用很小时，易导致聚丙烯酰胺凝胶电泳无 法分辨而造成漏检；此外，该方法需要制作凝胶，使操作人员接触有毒有 害试剂，电泳的电流强度与时间难以控制，容易电泳失败，导致条带无法 看清而影响基因型的判定。
发明内容
本发明目的提供一种湖羊ESR基因基因型的荧光定量PCR检测试剂 盒及检测方法，以解决现有技术中的检测湖羊ESR基因基因型的方法准 确率低、操作步骤多、过程复杂、时间长、检测试剂有毒的技术问题。
本发明采用的技术方案是
一种湖羊雌激素受体基因型的荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括
特异性扩增引物、PCR緩冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA染料和
DNA聚合酶，其特征在于所述特异性扩增引物如下上游引物5'-
GCACCAGATCCAAGCCAACGAG - 3 '，下游引物5'画GTACCTGTA
GAAGGCGGGAGGG - 3'。所述的湖羊ESR基因特异引物才艮才居GenBank
发表的羊ESR基因(登录号X98010)的第一外显子DNA序列设计。 具体的，所述DNA染料为SYBR Green I或与之有相似光谱特性的
EvaGreenTM。 SYBRGreenI是一种双链特异性的DNA染料，只有与双
链DNA结合后才能发射荧光。当双链DNA通过变性温度时产生的焚
光会快速衰减而形成特异的熔解曲线，如果在PCR扩增循环过程中对
SYBRGreenI发出的焚光进行持续监测，那么利用这一特征可对不同产
物的变性进行观测。产物的熔解曲线取决于GC含量、序列长度。如果扩 5增产物中存在突变型序列，那么在变性过程中它与野生型序列之间解链温
度即Tm就会产生差异。Tm相差2。C以上，就可通过它们各自的熔解曲线将其分离。在进行熔解曲线分析后突变杂合型会出现两个峰值，而突变纯合型和野生型只出现一个峰值，但是峰值的大小不同。
SYBRGreenI的使用浓度是影响实验成功与否的关键因素，如果SYBR Green I的浓度不饱和会使荧光信号不能反应产物量的变化。而过高浓度则会抑制PCR反应，降低PC版应效率。SYBRGreenI是Invitrogen公司旗下MolecularProbes的专利，通常试剂盒会有比较现成的方案，一般在使用SYBRGreenI时应根据实际情况优化使用浓度是反应中的终浓度为lx到0.2x之间。EvaGreenTM为Biotium公司产品，稳定性极强，在正常的储存、操作和PCR过程中不会被破坏，在緩沖溶液中的染料可以安全的储存在室温或冰箱里，也可以反复冻融。
本发明关键在于特异性引物的设计，试剂盒中的其他组分，比如DNA聚合酶、PCR緩沖液、脱氧三磷酸核苷混合物等，均可参照本领域常规试剂盒组成。
本发明还涉及一种湖羊雌激素受体基因型的荧光定量PCR检测方法，所述方法包括
(1)提取待测样品DNA;.(2)取特异性扩增引物、PCR缓冲液、脱.氧三磷酸核苷混合物、DNA染料和DNA聚合酶，加入待测样品DNA配成PCR反应液，进行PCR扩增反应，于每个循环结束时测定吸光值，扩增循环结束后对PCR产物做70。C 100。C (0.5°C/s)的熔解曲线分析，采用实时荧光PCR仪的分析软件获得待测样品DNA的熔解曲线；
所述特异性扩增引物如下
上游引物5'- GCACCAGATCCAAGCCAACGAG画3 '下游引物5'- GTACCTGTA GAAGGCGGGAGGG - 3';
(3)根据待测样品熔解曲线，判断待测样品雌激素受体基因型若待测样品DNA熔解曲线出.现两个峰值，则;f寺测样品为突变杂合型；若待测样品DNA熔解曲线只出现一个峰值，则待测样品为突变纯合型或野生型，熔解曲线的峰值在85 9(TC之间则为突变纯合型，熔解曲线的峰值在90 ~ 95。C之间则为野生型。
通常，所述脱氧三磷S吏核芬混合物(dNTP)为dATP、 dTTP、 dCTP、dGTP物质的量之比为1: 1: 1: 1的混合物。
具体的，所述？CR反应液终浓度组成如下
PCR緩冲液 终浓度为lx
特异性扩增引物 各0.1 0.3pM
dNTPs 0.1~0.3mM
待测样品DNA 10~100ng/pL
Taq DNA聚合酶 0.05~0.5U/VL
SYBR Green I 终浓度为lx
溶剂为ddH20。
SYBR Green I购自美国英杰生命技术有卩艮公司(Invitrogen),浓度为10000 x ,使用时稀释成20 x浓度的工作液，PCR扩增时加入每20 jaLPCR反应液中加入lpL 20 x SYBR Green I工作液，因此PCR反应液中SYBR Green I的终浓度为1 x 。PCR緩冲液终浓度为lx,是指PCR緩沖液中各组分在反应液中的终浓度与1 x PCR buffer相同，将10xPCR buffer稀释10倍，其组分浓度即与1 xpCR buffer相同。10xPCR buffer组成为100mmol/l Tris画HClpH8.3, 15mmol/LKCl, 15mmol/L MgCl2, 0.01% (W/V)明胶，溶剂为DEPC水。
所述PCR扩增反应条件如下首先95。C预变性5min,然^ 94。C变性lmin、 59。C复性lmin、 72。C延伸1 min,共39个循环，再72。C延伸10 min。
本发明的有益效果主要体现在
1. 步骤减少，灵每文度提高
本发明只需将样品DNA进行荧光定量PCR扩增，既可得到;f全测结果，减少了电泳、银染等步骤，避免了凝胶电泳无法分辨不改变单链DNA分子立体构象的点突变的缺陷，并避免了电泳电流不稳定等因素对检测的不良影响。由于在封闭的体系中完成扩增和实时测定，大大降低了污染的可能性，也降低了结果偏差的几率。
2. 反应快速，效率增加
本发明采用荧光定量PCR4企测方法，将扩增和;险测同步完成，自动化程度高，没有后处理，不用杂交、电泳、拍照，缩短了反应时间，3个小时内可得到检测结果，比釆用PCR-SSCP方法至少可节约5个小时。
3. 操作环保，人员安全
本发明采用荧光定量PCR检测方法，不需要凝胶电泳、银染等步骤，无需使用聚丙烯酰胺、溴化乙锭等致癌试剂，避免了试验过程中对环境的污染，排除了实验操作人员的健康隐患。(四)
图l是实施例1检测到的一种野生纯合型湖羊ESR基因的熔解曲线图；图2是实施例1检测到的一种突变纯合型湖羊ESR基因的熔解曲线图；图3是实施例1检测到的一种突变杂合型湖羊ESR基因的熔解曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围
并不仅限于此
实施例1:
随机从浙江华丽牧业有限公司(国家级湖羊原种场)采集56只湖羊血样，用ACD抗凝后-20。C冻存带回实验室，提取基因组DNA供以下的实验应用
1. 引物i殳计
根据GenBank发表的羊ESR基因(登录号X98010)的第一外显子DNA序列设计引物，产物长度为335 bp。引物序列为上游引物5'國GCACCAGATCCAAGCCAACGAG - 3 '下游引物5'- GTACCTGTAGAAGGCGGGAGGG - 3'
2. 荧光定量PCR检测
将样品DNA与湖羊ESR基因特异引物在含DNA染料(SYBRGreenI)的PCR^应体系中进行荧光定量PCR扩增。扩增反应体系终浓度组成为
Taq DNA聚合酶 (凯杰生物技术(上海)有限公司)0.1U 1
上下游引物 各0.2pMdNTP 0.2mM
9(dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP各0.05mM， Takala公司)样品DNA 50ng/pl20 x SYBR Green I染泮牛工作液(Invitrogen7>司)1 pi10 x PCR缓冲液(凯杰生物技术(上海)有限公司) 2pl力口ddH2O至20)il。扩增反应条件为
首先95。C预变性5min，然后94。C变性lmin、 59。C复性l min、 72。C延伸lmin,共39个循环，再72。C延伸10 min。
于每个循环结束时测定每孔SYBR Green吸光值，扩增循环结束后，对PCR产物以0.5。C/s做70。C到100°C的熔解曲线分析。根据实时焚光PCR仪的分析软件获得的Ct值和溶解曲线，分析结果，判定样品DNA的基因型。
3.检测结果
56只湖羊中，野生纯合型个体为13只(熔解曲线参见图1)、突变杂合型个体为24只(熔解曲线参见图3)、突变纯合型个体为19只(熔解曲线参见图2)。SEQUENCE LISTING
<110>浙江大学
<120>湖羊雌激素受体基因型的荧光定量PCR检测试剂盒及方法
<130〉
<160〉 2
<170> Patentln version 3.4
<210〉 1
<211〉 22
〈212〉 DNA
<213> Unknown
<220〉
<223> 人工序列 .
<400> 1
gcaccagatc caagccaacg ag 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Unknown
〈220〉
〈223〉人工序列
〈400〉 2
gt3CCtgt3g朋ggcgggag gg 2权利要求
1.一种湖羊雌激素受体基因型的荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性扩增引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA染料和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性扩增引物如下上游引物5′-GCACCAGATCCAAGCCAACGAG-3′，下游引物5′-GTACCTGTAGAAGGCGGGAGGG-3′。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述DNA染料为SYBR GreenI或EvaGreen TM。
3. —种湖羊雌激素受体基因型的荧光定量PCR检测方法，所述方法包括(1 )提取待测样品DNA;(2) 取特异性扩增引物、PCR緩沖液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA 染料和DNA聚合酶，加入待测样品DNA配成PCR反应液，进 行PCR扩增反应，于每个循环结束时测定吸光值，扩增循环结束 后对PCR产物做70。C 100。C的熔解曲线分析，获得待测样品 DNA的熔解曲线；所述特异性扩增引物如下上游引物5'- GCACCAGATCCAAGCCAACGAG - 3 ' 下游引物5'- GTACCTGTA GAAGGCGGGAGGG - 3';(3) 根据待测样品熔解曲线，判断待测样品雌激素受体基因型若待 测样品DNA熔解曲线出现两个峰值，则待测样品为突变杂合型； 若待测样品DNA熔解曲线只出现一个峰值，则待测样品为突变 纯合型或野生型，熔解曲线的峰值在85 ~ 90 °C之间则为突变纯合型，熔解曲线的峰值在卯 95。C之间则为野生型。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述脱氧三磷酸核苷混合物为 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP物质的量之比为1: 1: 1: 1的混合物。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR反应液终浓度组成如 下PCR緩冲液 特异性扩增引物 dNTPs待测样品DNA Taq DNA聚合酶 SYBR Green I终浓度为lx 各0.1 0.3fiM 0.1 0.3mM 10~100ng/)iL 0.05 0.5U/^iL 终浓度为lx溶剂为ddH2Q。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件如下 首先95。C预变性5min,然后94。C变性lmin、 59。C复性1 min、 72°C 延伸1 min,共39个循环，再72。C延伸10 min。
全文摘要
本发明提供了一种湖羊雌激素受体基因型的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒主要包括特异性扩增引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA染料和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性扩增引物如下上游引物5′-GCACCAGATCCAAGCCAACGAG-3′，下游引物5′-GTACCTGTA GAAGGCGGGAGGG-3′。本发明的有益效果主要体现在1.步骤减少，灵敏度提高；2.反应快速，效率增加；3.操作环保，人员安全。
文档编号C12Q1/68GK101654710SQ200910152668
公开日2010年2月24日 申请日期2009年9月17日 优先权日2009年9月17日
发明者俞颂东, 王争光, 董文艳 申请人:浙江大学