专利名称：：一种快速检测长豇豆品种种子纯度的方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属于作物生物
技术领域：
，尤其属于利用诊断性SSR分子标记组合快速检测长豇豆主要品种种子纯度的方法及其试剂盒。
背景技术：
：长豇豆是我国重要的夏季豆类蔬菜，深受人民群众喜爱。我国从事长豇豆育种、种子生产和经营的科研院所、企业众多，每年育成一批长豇豆新品种。当前生产上应用的长豇豆品种众多，年用种量很大，商业品种间的遗传相似性愈来愈高，同种异名、同名异种现象日益严重，种子质量纠纷时有发生。因此，很有必要研究开发一种能早期、周年、快速、准确鉴定长豇豆品种真伪和纯度的检测方法，以服务于长豇豆育种、种子经营和生产的需要，并切实保护育种者的合法权利。目前我国蔬菜品种真伪与纯度鉴定大多依靠田间表现型鉴定，鉴定所需时间长(一般需50-60天时间)，并受季节的限制，而且作物的表现型易随环境条件的变化而变化，特别是对于一些形态差异较小的品种间鉴定难度更大。DNA分子标记技术在国内外已被用于鉴别不同品种之间在分子水平上的差异。由于在同一物种的各个品种间存在有大量的多态性标记，每一品种均存在有区别于其它品种的独特标记，即一些特异性DNA片段的组合就称为该品种的指纹，各品种独特的指纹片段构成该物种的DNA指纹图谱。与传统的依据表型性状鉴定相比，基于DNA水平差异的指纹图谱技术，具有可以在植株生长的任何阶段进行，鉴定快速，并不受基因表达和环境条件的影响等优点。SSR分子标记是利用真核生物基因组中存在的大量微卫星重复序列设计引物，通过PCR扩增串联的重复序列，依据微卫星的重复次数在同一物种不同基因型间的差异，揭示长度多态性。SSR由于分布广、稳定性和多态率高，操作简单、重复性好、对DNA质量要求较低等，被誉为第二代分子标记的明星。SSR分子标记技术克服了RAPD稳定性和重复性差，AFLP技术费用昂贵、操作复杂、对DNA的纯度和内切酶的质量要求很高等缺点。由于传统的SSR分子标记必须依赖测序设计引物，所以其前期开发成本较高、工作量很大，然而一旦SSR开发成功，对其后续研究将能提供极大的便利。当前数据库中已存储的以及仍在不断增加的大量普通豇豆DNA序列，为我们通过生物信息学方法开发适用于长豇豆研究的SSR引物提供了丰富的资源。本发明基于SSR分子标记技术的种子纯度快速检测方法，对规范长豇豆种子产业，保护长豇豆育种者的合法权益和农民的切身利益，促进农业增产、农民增收具有重要意义。
发明内容本发明目的是，针对目前长豇豆品种种子纯度鉴定大多依靠田间表现型观察方法所存在的鉴定时间长、受季节性限制及作物的表现型易随环境条件变化等缺陷，提供一种能早期、全年、快速、准确鉴定长豇豆品种真伪和纯度的检测方法；本发明的另一目的是提供一种便捷实施上述方法的试剂盒。本发明目的通过以下技术方案得以实现。一种快速检测长豇豆品种种子纯度的方法，该方法按以下步骤进行-(一)长豇豆DNA数据库的下载、序列处理和SSR引物设计(1)从CGKB数据库(http://cowpeagenomics.med.virginia.edu/CGKB/)下载豇豆基因组序列，从HarvEST数据库(http:〃harvest.ucr.edu/)下载长豇豆EST序列；运行VecScreen程序(http:〃丽.ncbi.nlm.nih.gov)去除下载序列上包含的载体和接头序列；(2)运行CAP3程序(http:〃ge隱e.cs.mtu.edu/sas.html)对所得序歹U进行序列拼接以去除重复，获得无冗余的DNA序列；运行Hornbill程序(http://hornbill.cspp.latrobe.edu.au/cgi-binpub/ssrprimer/indexssr.pi)鉴定DNA序列上所包含的SSR位点并设计出SSR引物100对；交由上海英骏生物技术公司合成引物；(二)SSR引物多态性信息含量计算和诊断性SSR引物筛选(1)提取44个有代表性的长豇豆品种DNA，用合成的100对引物分别扩增这些材料的DNA，PCR反应体积为12.5微升，退火温度为52。C;(2)统计每对引物的扩增情况，对扩增条带进行0或1赋值，计算各引物的多态性信息含量；(3)从扩增条带的稳定性、引物多态性指数和多态性条带的易分辨程度三方面进行综合评价，从中选取CPL031，CPL053，CPL078，CPL112，CPL114,CPL135,CPL333，CPL420，CPL840，CPL865共10对引物作为诊断性引物组合，具体是序号引物名正向序列(5'-3')反向序列(5'-3')1CPL031CGCTCTTCGTTGATGGTTGTGTTCTAGAGGGTGTGATGGTA2CPL053ACAGGTTCCTTGTGAAGCGCCATACGCAACTCAGCTATCTCGCCAATGATTCTGAGAT5CPL114AATGTTTGGACTGGTCAGGAGGACAAGTCAGGAAGCAA6CPL135GGTGGAAATCAGGTTGTTAGCCAATTGTCAAGTTCAGC7CPL333TCGATCAAATTTTCCTCTTGCCACCATCTTTCATTTCT8CPL420CGCGTACAACATCTCTTCGTGCCAATGGATCAGGTAAC9CPL840TAGCATAGAAGAAGCAATCTGGAATCTGGAAGGAGAA10CPL865CTCTCTCTCTCCACATCTCATCATCAATCACACAACTTC(三)长豇豆5个主栽品种标准指纹图谱的制备:用上述10对诊断性SSR引物分别扩增占当前长豇豆生产总用种量60%以上的之豇106、杨早豇1号、之豇特早30、宁豇3号及黑眉5个主栽品种标准样的DNA后，将扩增产物在浓度为8%，丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺=29:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，银染照相并记录结果，经Photoshop软件处理后获得主栽品种标准指纹图谱；(四)待测长豇豆样品的检测如待测样品要求鉴别目标品种为步骤(三)的五个主栽品种之一，则仅需将该待测样品进行基因组DNA提取、用IO对SSR引物进行PCR反应、同上凝胶电泳、银染、取得指纹图谱后，与主栽品种标准指纹图谱进行比对，以确定其真伪并进而计算其纯度；如要求鉴别目标为非上述五个主栽品种，则需将待测样品与要求鉴别目标品种的标准样品，分别制备出指纹图谱并进行比对，以确定待测样品种子的真伪并进而按以下公式计算其种子纯度；种子纯度=(检测所得真种子数/检测种子总数)X100%。一种快速检测长豇豆品种种子纯度的试剂盒，该试剂盒包括盒体和14支印pondrof管，在其中4支中分别装有25mMMgCl2，10mMdNTP，10XPCR缓冲液及5U/yLTaqDNA聚合酶，其特征在于在其余10支印pondrof管中，分别装有含有正反向引物、浓度为lmM的诊断性SSR检测引物CPL031，CP固，CP圆，CPL112，CPL114，CPL135，CPL333，CPL420，CPL840及CPL865;此外，盒体中还装有印有长豇豆5个主栽品种标准指纹图谱的图片。本发明的有益效果是(1)应用自主开发和筛选出的10对诊断性SSR引物组合，增强了鉴别近似品种的能力。经过理论计算、近似品种扩增比较(图1)及大量检测实践证明这套引物能有效区分长豇豆不同基因型，完全可以满足对当前生产上主要长豇豆品种进行真伪检测的需要。(2)直接鉴定遗传物质，大大提高了鉴定的准确性。本发明使种子纯度的鉴定在DNA水平上进行，避免了表型鉴定、生化鉴定等间接鉴定方法所可能带来的误差，有操作方便，重复性好的特点，具有高度的可靠性和权威性。(3)提高了检测的效率和标准化程度。本发明将检测用引物和检测试剂以试剂盒形式提供，检测结果稳定可靠，易于实现标准化，检测时间仅需4-5小时，一次可对多达上百份样品同时进行检测。一般种子质检室只需具备常规的分子生物学设备就可按提供的操作程序进行实际检测。PCR反应组份(MgCL、Buffer、dNTP、Taq酶)既可由本试剂盒提供，也可由用户自己单独购置，使用方便，且检测成本低廉，约为传统表型鉴定的六十分之一(见实施例3)。图1为长豇豆5个主栽品种的标准DNA指纹图谱。其中M:分子量标准；1:CPL112;2:CPL053;3:114;4:CPL031;5:CPL135;6:CPL840;7:CPL420;8:CPL865;9:CPL078;10:CPL333;箭头示各品种DNA指纹的主要差异之处。具体实施例方式本发明通过以下实施例并结合附图作进一步的详细说明，但应该理解本发明并不受以下内容所限止。实施例1:(应用试剂盒对要求鉴别目标品种为五个主栽品种之一待测样品的检领D按以下步骤进行(1)DNA提取将待检种子散播于装有基质(蛭石泥炭=1:2)的育苗穴盘中，置于25-3(TC下育苗，待第一对真叶平展时，单株取叶片O.l克，加液氮研磨成粉末，用常规CTAB法提取DNA;(2)SSR引物扩增和电泳检测用试剂盒提供的SSR10对诊断性引物进行PCR分析，反应体积为12.5iiL;PCR各组分为10Xbuffer1.25tiL，25mMMgCL0.75tiL，2.5mMd證s1uL,Taq酶(5U/uL)0.1uL,模板DNA10ng，加水至12.5uL;SSR反应程序为:94。C预变性3min，94。C变性30sec，52。C退火30sec，72。C延伸50sec，循环35次，最后72。C延伸5min;在PTC-225扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺=29:1)上进行电泳分离，然后进行银染显色，数码相机照相记录结果，获得待检材料的DNA指纹图谱；(3)DNA指纹图谱比对和种子纯度计算将待检材料的DNA指纹图谱与试剂盒提供的长豇豆5个主栽品种标准DNA指纹图谱进行比对，例如提供待检材料者要求鉴别的目标品种为5个主栽品种之一的之豇106，而指纹图谱比对结果两者完全相吻合，则该待检材料即为真正的之豇106，否则即为伪种子。检测完成后用公式种子纯度=(检测所得真种子数/检测种子总数)乂100%计算种子纯度。实施例2:(应用试剂盒对要求鉴别目标品种为非五个主栽品种之一待测样品的检测)按以下步骤进行(1)DNA提取将待检测种子和要求鉴别目标品种的标准种子，分别散播于装有基质(蛭石泥炭=1:2)的育苗穴盘中，置于25-3(TC下育苗，待第一对真叶平展时，单株取叶片O.l克，加液氮研磨成粉末，用CTAB法提取DNA;(2)SSR引物扩增和电泳检测同实施例l;(3)分别根据待检测种子和标准品种种子PCR扩增和电泳检测结果，构建待检测种子和标准品种种子的DNA指纹图谱；(4)DNA指纹图谱比对和种子纯度计算将两者的DNA指纹图谱进行比对，二者带型完全相同的为真种子，否则即为伪种子；检测完成后用公式种子纯度=(检测所得真种子数/检测种子总数)X100%计算种子纯度。实施例3:(本发明与传统方法鉴定种子纯度的对比试验)传统鉴定方法按以下步骤进行1、分别取待测品种和要求鉴别目标品种的标准种子播种于大田或大棚中，行距70cm，株距30cm，每穴播1粒，每品种100穴以上，环境最低温度要求高于15°C;112、日常田间管理参照常规栽培技术进行。3、一般在嫩荚盛采期仔细观察该标准品种的特征特性，逐个比较待测品种特征特性与标准品种的差异，确定种子真伪，检测全部完成后用公式种子纯度=(检测所得真种子数/检测种子总数)X100%计算种子纯度。表1本发明与传统方法鉴定种子纯度的对比试验<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>序列表〈110〉浙江省农业科学院〈120〉一种快速检测长豇豆品种种子纯度的方法及其试剂盒〈160>20<210>1〈211>21<212>DNA<213>人工序列〈220><223>根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL031分子标记的上游引物〈4。0>1CGCTCTTCGTTGATGGTTATG21<210>2<211>23〈212>DNA〈213>人工序列<220>〈223>根据巳知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL031分子标记的下游引物〈400>2GTGTTCTAGAGGGTGTGATGGTA23〈210>3<211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220><223>根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL053分子标记的上游引物〈■〉3ACAGGTTCCTTGTGAAGCAC20<210>4〈211>20<212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL053分子标记的下游引物〈400>4GCCATACGCAACTCAGCTAT20〈210>5<211〉20〈212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL078分子标记的上游引物<400〉5GAACAGCTTCCTGAACCTCA20〈210〉6〈211〉20〈212>腿〈213>人工序列〈220>〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL078分子标记的下游引物〈400〉6GCTTTCATCTGCTCCAGGTA20<210〉7<211〉20〈212〉DNA〈213>人丁序列〈220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL112分子标记的上游引物〈400>7AACCCAGCATACCTGCATAA20〈210>8〈211〉20〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL112分子标记的下游引物〈400〉8CTCGCCAATGATTCTGAGAT20<210>9<211〉20<212〉腿<213>人工序列〈220〉〈223〉根据己知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL114分子标记的上游引物〈400〉9AATGTTTGGACTGGTCAGGA20<210>10〈211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列〈220>〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL114分子标记的下游引物〈400〉10GAGGACAAGTCAGGAAGCAA20〈210〉11〈211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL135分子标记的上游引物<400〉11GGTGGAAATCAGGTTGTTTG20〈210〉12〈211〉20〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉根据己知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL135分子标记的下游引物<400〉12AGCCAATTGTCAAGTTCAGC20〈210〉13<211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL333分子标记的上游引物<400>13TCGATCAAATTTTCCTCTGC20〈210>14〈211〉20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL333分子标记的下游引物<400〉14TGCCACCATCTTTCATTTCT20〈210>15〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL420分子标记的上游引物〈400〉15CGCGTACAACATCTCTTCCT20〈210〉16〈211〉20〈212〉腿〈213〉人丁_序列〈220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL420分子标记的下游引物〈400〉16GTGCCAATGGATCAGGTAAC20〈210>17〈211〉21〈212〉腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL840分子标记的上游引物<400〉17TAGCATAGAAGAAGCAATCGT21〈210>18〈211>19<212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL840分子标记的下游引物〈400〉18CTGGAATCTGGAAGGAGAA19<210〉19<211〉21<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL865分子标记的上游引物〈400〉19CTCTCTCTCTCCACATCTCAA21<210>20<211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CPL865分子标记的下游引物〈400〉20CATCATCAATCACACAACTTC2权利要求1、一种快速检测长豇豆品种种子纯度的方法，其特征在于按以下步骤进行(一)长豇豆DNA数据库的下载、序列处理和SSR引物设计(1)从CGKB数据库(http://cowpeagenomics.med.virginia.edu/CGKB/)下载豇豆基因组序列，从HarvEST数据库(http://harvest.ucr.edu/)下载长豇豆EST序列；运行VecScreen程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)去除下载序列上包含的载体和接头序列；(2)运行CAP3程序(http://genome.cs.mtu.edu/sas.html)对所得序列进行序列拼接以去除重复，获得无冗余的DNA序列；运行Hornbill程序(http://hornbill.cspp.latrobe.edu.au/cgi-binpub/ssrprimer/indexssr.pl)鉴定DNA序列上所包含的SSR位点并设计出SSR引物100对；交由上海英骏生物技术公司合成引物；(二)SSR引物多态性信息含量计算和诊断性SSR引物筛选(1)提取44个有代表性的长豇豆品种DNA，用合成的100对引物分别扩增这些材料的DNA，PCR反应体积为12.5微升，退火温度为52℃；(2)统计每对引物的扩增情况，对扩增条带进行0或1赋值，计算各引物的多态性信息含量；(3)从扩增条带的稳定性、引物多态性指数和多态性条带的易分辨程度三方面进行综合评价，从中选取CPL031，CPL053，CPL078，CPL112，CPL114，CPL135，CPL333，CPL420，CPL840，CPL865共10对引物作为诊断性引物组合，具体是<tablesid="tabl0001"num="0001"wi="150"></tables>(三)长豇豆5个主栽品种标准指纹图谱的制备用上述10对诊断性SSR引物分别扩增之豇106、杨早豇1号、之豇特早30、宁豇3号及黑眉5个主栽品种标准样的DNA后，将扩增产物在浓度为8％，丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝29∶1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，银染照相并记录结果，经Photoshop软件处理后获得主栽品种标准指纹图谱；(四)待测长豇豆样品的检测如待测样品要求鉴别目标品种为步骤(三)的5个主栽品种之一，则仅需将该待测样品进行基因组DNA提取、用10对SSR引物进行同上PCR反应、凝胶电泳、银染、取得指纹图谱后，与主栽品种标准指纹图谱进行比对，以确定其真伪并进而计算其纯度；如要求鉴别目标品种为非上述5个主栽品种，则需将待测样品与要求鉴别目标品种的标准样品，分别制备出指纹图谱并进行比对，以确定待测样品种子的真伪并进而按以下公式计算其种子纯度；种子纯度＝(检测所得真种子数/检测种子总数)×100％。2、一种快速检测长豇豆品种种子纯度的试剂盒，该试剂盒包括盒体和14支印pondrof管，在其中4支中分别装有25mMMgCl2，lOmMdNTP，10XPCR缓冲液及5U/uLTaqDNA聚合酶，其特征在于在其余10支印pondrof管中，分别装有含有正反向引物、浓度为lmM的诊断性SSR检测引物CPL031,CPL053,CPL078,CPL112,CPL114,CPL135,CPL333,CPL420,CPL840及CPL865。此外，盒体中还装有印有长豇豆5个主栽品种标准指纹图谱的图片。全文摘要本发明公开了一种快速检测长豇豆品种种子纯度的方法及其试剂盒，属于作物生物
技术领域：
。该方法包括(一)豇豆DNA数据库的下载、序列处理和SSR引物设计；(二)SSR引物多态性信息含量计算和诊断性SSR引物筛选；(三)长豇豆5个主栽品种标准指纹图谱的制备；(四)待测长豇豆样品的检测等步骤。为方便推广应用本发明方法，同时提供了试剂盒，一次可对上百份样品同时进行检测，时间仅需4-5小时，检测成本低廉，约为传统表型鉴定的六十分之一，具有快速、准确、稳定等特点，可在豆类科研育种、种子经营等单位推广应用。文档编号C12Q1/68GK101671730SQ20091015273公开日2010年3月17日申请日期2009年9月28日优先权日2009年9月28日发明者刘永华,吴晓花,沛徐,李国景,汪宝根,胡婷婷,鲁忠富申请人:浙江省农业科学院