专利名称：一种活性氮致内皮细胞损伤的药物筛选方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学和药理学技术领域，涉及一种内皮细胞模型及其建立方法与应用，特别涉及一种活性氮致内皮细胞损伤的药物筛选方法，以及基于该模型进行相关药物筛选的应用。
背景技术：
药物筛选模型是寻找和发现好的有治疗作用药物的重要和必要条件。基于特异靶点的分子和细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少，快速灵敏，药物作用机制明确，可实现大规模筛选等特点，是目前药物初筛的主要模式。
过去的十几年中，关于活性氮(*NO)对于内皮细胞的作用观点很多，但普遍认为其是一个具有多种生物活性和多面性的小分子物质，对于维持内皮细胞及血管的功能作用巨大。在病理条件下，活性氮一方面可以舒张血管，增加血流量，加速致病因子的清除，同时也可以维持微环境的氧化还原态的稳定。但大量的活性氮对内皮细胞是有损伤作用的，表现在可能引起细胞供能系统线粒体的损伤和活性氧(ROS)的大量释放(Oxidative burst and NO generation asinitial response to ischemia in flow-adapted endothelial cells. Am J Physiol HeartCirc Physiol 280:H2126-2135; 2001.)。活性氮和活性氧可快速结合生成过氧亚硝酸阴离子(ONOCT)，其氧化能力是过氧化氢(H202)的约1000倍，可引起细胞不可逆的损伤，并最终走向凋亡(Walford， G. A.; Moussignac, R. L.; Scribner，A. W.; Loscalzo, J.; Leopold, J. A. Hypoxia potentiates nitric oxide-mediatedapoptosis in endothelial cells via peroxynitrite-induced activation ofmitochondria-dependent and -independent pathways. J Biol Chem 279:4425-4432;2004.)。建立一个活性氮损伤的内皮细胞模型，可以为深入研究病理状态下活性氮对血管内皮细胞的损伤机制提供实验室依据，也可以通过该模型筛选出一些对活性氮的损害有保护作用的药物。
但是由于活性氮是一个小分子不稳定的物质，其单独存在的时间极短，若要建立相关细胞模型，就必须选择适当的活性氮作为造模物质。而目前的研究中并没有关于某种活性氮诱导物可以作为明确的活性氮来源，作用内皮细胞产生损伤的文献报道，也没有在体外研究病理条件下建立活性氮对内皮细胞的损
伤模型，以及该模型在药理学上应用的相关报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种活性氮致内皮细胞损伤的药物筛选方法，是将外源性的活性氮诱导物质加入到内皮细胞生长的培养基中，活性氮自然产生，与活性氧结合并作用于内皮细胞，引起相应的包括线粒体损伤，凋亡早期
活性氧(ROS)的生成，蛋白酪氨酸硝基化(3-NT)及凋亡，得到活性氮损伤内皮细胞模型。以ROS， 3-NT产生，随时间增加，细胞存活率明显降低的确切特征性标志作为造模成功的评价标准。所述外源性的活性氮诱导物质为s-亚硝酰谷胱甘肽(GSNO)， s-亚硝酰半胱氨酸(CSNO)和3-吗啉-斯得酮亚胺(SIN隱1)。。
本发明提供的活性氮损伤内皮细胞模型，是经过活性氮作用的体外培养内皮细胞，所述的内皮细胞包括原代培养人脐静脉内皮细胞，大鼠脑血管内皮细胞，小鼠脑血管内皮细胞，牛冠状动脉内皮细胞，永生化人脐静脉来源的EA.hy926细胞系及HUVEC细胞系的内皮细胞。
本发明提供的活性氮损伤内皮细胞模型的构建方法
技术领域：
本发明的第二个目的是提供上述活性氮损伤内皮细胞模型在筛选具有抵抗活性氮损伤作用的心脑血管药物中的应用。
针对活性氮引起的内皮细胞损伤是ROS-3-NT-线粒体凋亡依赖性，可以作
为筛选具有保护内皮细胞不受活性氮损伤作用的药物靶点。具体方法是通过将待测样品加入活性氮损伤内皮细胞模型中，通过观察相应的ROS、 3-NT生成的情况，细胞的存活率筛选出对该损伤有保护作用的药物。
本发明提供了外源性的活性氮诱导物质来构建活性氮损伤内皮细胞的药物筛选方法，填补了这类药物筛选模型的空缺。针对这一内皮细胞损伤模型的特征作为靶点进行相关药物筛选开发，避免了细胞整体水平筛选的盲目性，减少了工作量且药物作用机制明确，具有直接，快速和简便的优点，适合大规模的心脑血管候选药物筛选。
图1为不同浓度的GSNO加入到EA.hy926细胞24、 48小时细胞存活率的MTT分析结果。
图2为0.5mM GSNO加入到EA.hy926细胞不同时间ROS的生成量。图3为0.5mM GSNO加入到EA.hy926细胞不同时间3-NT的生成量。图4为不同药物对于GSNO损伤的EA.hy926细胞模型中细胞存活率的 MTT分析结果。
图5为不同药物对于GSNO损伤的EA.hy926细胞模型中细胞3-NT生成 量的影响。
图6为不同药物对于SIN-1损伤的HUVEC细胞模型中细胞存活率的MTT 分析结果。
图7为不同药物对于SIN-1引起的HUVEC细胞模型中细胞3-NT生成量 的影响。
具体实施例方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。 药品与试剂
高糖DMEM培养基购于GIBICO公司，胎牛血清购于杭州四季青公司， 活性氧清除剂Trolox、活性氮清除剂Hemoglobin、 3-NT抗体购于sigma公司， 其它试剂均为国产和进口分析纯试剂。
细胞
试验所使用的原代培养内皮细胞EA.hy926细胞和HUVEC细胞均购于美 国ATCC细胞库。培养条件5%C02， 37°C，高糖DMEM培养基，培养基每 升含IOOU青霉素和100U链霉素；10°/。国产胎牛血清；37°C (5% C02， 95% 空气)，饱和湿度，待细胞生长至80%左右融合，用胰酶-EDTA液消化后进行 传代，传代密度5xl04/ml隔2天传代；冻存条件2ml冻存管，每管40万 细胞，含70。/。高糖DMEM， 20%国产胎牛血清，10%DMSO。
实施例1 GSNO作用于EA.hy926细胞制造活性氮损伤模型并用于药物筛选 取对数生长的EA.hy926细胞，加入适量胰蛋白酶-EDTA消化液，使贴壁 细胞脱落，收集细胞，计数，用含10%胎牛血清的培养液配成细胞悬液 (5xl04/mL)，于96孔板中每孔加入100 |iL，在37。C、 5%(302培养2411。取 GSNO溶于无菌生理盐水中配制成母液为100mmol/L的溶液，0.22pm滤膜过 滤除菌后，加入到细胞培养基中，使终浓度分别为0.1, 0.5， 1， 2mM。以溶 剂为阴性对照，放入培养箱于相同条件下继续培养24或48h。结束培养前4h 力口入MTT(5mg/mL， D-Hanks，溶解)10pL，试验结束时吸去上清，加入150pL DMSO，用酶联免疫检测仪于570 nm处测定各孔OD值，记录结果，取6孔 OD值求均值，计算抑制率抑制率(IR%) =(l-TOD/COD)xl00%。试验结果如图1所示，可见0.5mM-2mM浓度的GSNO作用24或48H都可以使EA.hy926 细胞存活率明显降低。经计算0.5mM的GSNO作用24h细胞存活率约为 72.33%; 0.5mM GSNO作用48h细胞存活率约为60.41%。为了简便快捷、节 省成本，选取GSNO0.5mM作用24小时作为造模条件。
考察GSNO作用下EA，hy926细胞ROS的生成情况，将细胞接种于96孔 板中，待细胞生长至指数阶段时加入终浓度为0.5mM的GSNO，同时设对照 组。培养l， 2， 4， 6， 8， 12h后，收集各组细胞，PBS离心洗涤1次，调整 细胞数至lxl06mL-l,加入ROS荧光染料H2-DCFDA染色30min， PBS清洗 2次后上流式细胞仪测定，然后分析荧光强度。检测荧光越强表明ROS含量越 高，细胞损伤即伴随ROS变化。检测结果如图2所示，0.5mM的GSNO作用 于内皮细胞可引起时间依赖性的ROS增力口，其中4hROS相对于0h升高约1.5 倍；12h ROS相对于0h升高约2.5倍。
GSNO作用于内皮细胞产生的特异性标志还包括使蛋白酪氨酸硝基化 (3-NT)增多，为检测3-NT生成情况，将0.5mM的GSNO作用1， 2， 4， 6， 8， 12h后的各组培养瓶中的细胞悬液转移至离心管，在1000 rpm下离心4 min。 去除培养液，用D-Hanks'液洗细胞两次，最后转移至effemdorf管中离心，弃 去D-Hanks'液。然后将离心后细胞团储存在-8(TC或直接进行裂解。细胞裂解 时，向细胞团中加入一定量的常规裂解液，立即吹打均匀。置于冰上，每隔IO min吹打20下。30 min后，在13000 rpm、 4。C下离心30 min，取上清液。蛋 白标定后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白， 一抗为特异性抗3-NT抗体。曝 光后所得蛋白条带定量分析，结果见图3，表明在活性氮GSNO的作用下，3-NT 的生成随着时间的延长而增多，于4h后达到一个较高水平，约相当于0h的4 倍。
为了使用所建立的细胞模型进行药物筛选，选取了 l-8号样品进行细胞试 验，其中3号为已知的活性氧清除剂Trolox作阳性对照，l号为不具有活性氧 和活性氮清除功能的物质，为阴性对照。应用了 0.5mM GSNO作用24小时的 EA.hy926细胞模型，结果参见图4和图5， 4#和5弁具有和3井类似的作用， 可使细胞存活率增加同时降低3-NT的生成，具有抗活性氮损伤的作用。而2 #， 6弁，7弁，8弁样品不具有此作用。在下一步实验中，可以只选取4弁和5 井样品深入研究。
实施例2 SIN-1作用于HUVEC细胞制造活性氮损伤模型并用于药物筛
选使用同实施例1类似的方法，得到SIN-1作用于HUVEC细胞的活性氮损 伤模型。具体方法如下SIN-1溶于无菌生理盐水中配制成母液为lmol/L的溶 液，0.22pm滤膜过滤除菌后，加入到HUVEC的细胞培养基中，使终浓度为 lmM。将细胞置于培养箱继续培养24小时得到活性氮损伤模型。
选取6个样品进行细胞试验，分别命名为9# 14#，待检样品均溶于培养 基中，其中9#样品为不具有活性氧和活性氮清除功能的物质，为阴性对照。 IO弁样品为Hemoglobin是目前公认的活性氮清除剂。结果如图6和图7所示， 可见阴性对照的9弁样品不能增加细胞存活率，且不能减少3-NT的生成，阳 性药物10弁可以明显增加细胞存活率，并减少3-NT的生成。11#和12#样品 与10弁有类似效应，而13#和14弁无此功能。
权利要求
1.一种活性氮致内皮细胞损伤的药物筛选方法，通过以下步骤实现将外源性的活性氮诱导物质加入到内皮细胞生长的培养基中，活性氮自然产生，与活性氧结合并作用于内皮细胞，引起线粒体损伤，凋亡早期活性氧的生成，蛋白酪氨酸硝基化及凋亡，得到活性氮损伤内皮细胞模型，以凋亡早期活性氧，蛋白酪氨酸硝基化产生，细胞存活率明显降低的确切特征性标志作为建模评价标准。
2. 根据权利要求1所述的内皮细胞模型，其特征在于所述外源性的活 性氮诱导物质选自s-亚硝酰谷胱甘肽、s-亚硝酰半胱氨酸或3-吗啉-斯得酮亚胺中的一种。
3. 根据权利要求1所述的内皮细胞模型，其特征在于所述的内皮细胞 选自原代培养人脐静脉内皮细胞、大鼠脑血管内皮细胞、小鼠脑血管内皮细胞、牛冠状动脉内皮细胞或永生化人脐静脉来源的EA.hy926细胞系及HUVEC细 胞系的内皮细胞。
4. 根据权利要求1所述的一种活性氮致内皮细胞损伤的药物筛选方法在 筛选具有抵抗活性氮损伤作用的心脑血管药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种活性氮致内皮细胞损伤的药物筛选方法，通过采用外源性的活性氮诱导物，以一定的浓度加入到体外培养的内皮细胞中，作用一定时间，造成内皮细胞的损伤，建立一种活性氮损伤内皮细胞的模型。利用该细胞模型，加入不同的药物，通过观察相应的ROS、3-NT生成的情况，细胞的存活率作为靶点，体外筛选可减轻活性氮对内皮细胞损伤的药物。本发明避免了细胞整体水平筛选的盲目性，减少了工作量且药物作用机制明确，具有直接，快速和简便的优点，适合大规模的心脑血管候选药物筛选。
文档编号C12Q1/02GK101654698SQ200910152760
公开日2010年2月24日 申请日期2009年9月28日 优先权日2009年9月28日
发明者刘启兵, 刘璐璐, 楼宜嘉, 峰 韩 申请人:浙江大学