专利名称：一种用Zeocin筛选千年桐SAD基因的产油酵母表达载体及构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，主要涉及一种用Zeocin筛选千年桐基因的产油酵母表达 载体及构建方法，具体涉及酵母表达载体重组，新建表达载体产物可用博来霉素筛选转千年 桐基因的产油酵母转化子。
背景技术：
为应对愈演愈烈的石油危机，世界各国都在积极制定和实施新的能源发展战略，希望通 过各种可能途径寻找到新的石油替代品，生物柴油便是其中之一。目前，生产生物柴油的原 料主要依赖于油料作物、木本油料人工林、动物脂肪及废弃油脂等。从油料树木中提取油脂， 具有占用耕地面积、周期长、成本高等一系列制约因素。发展动物油脂也同样面临一系列制 约因素。因此，开辟新的植物源油脂生产途径，特别是工业化生产途径对满足不断增长的生 物柴油的需求具有重要意义。研究发现，除高等植物和动物能生产油脂外，低等的微生物也能产生油脂，大部分微生 物油脂的脂肪酸组成和一般植物油相似。通常情况下微生物细胞仅含油2~3%，但在适宜条件 下，某些微生物产生并贮存的油脂占其生物总量的20%以上，在已知细菌、酵母、霉菌和藻 类中都发现有产油脂的菌株。利用微生物作为生物反应器生产脂肪酸，为生物柴油原料生产 开辟了一条新的技术途径。微生物生产油脂时，具有增殖快，生长周期短，适合工厂化生产， 投入较少，收获稳定，不受季节、气候等环境条件影响，且不消耗化学肥料和农药，因而对 环境污染减轻。但目前微生物存在产油率低，油脂成分组成复杂，与生产优质生物柴油的原 料要求仍为较大距离。运用分子生物学技术，将植物脂肪酸合成相关基因特别是控制产脂量 和脂肪酸品质的基因导入真菌中，构建优质"基因工程菌株"，使植物脂肪酸合成酶基因在微 生物细胞中的高效表达，增加微生物产脂量，提高和控制脂肪酸组成。此种新方式可从根本 上解决微生物产脂菌油质差、产油率低的缺陷，又可充分发挥微生物适合于生物反应器发酵 以及林源优质脂肪酸合成酶的优点。△9硬脂酰-ACP脱饱和酶(Stearoyl-ACPdesaturase，简称SAD)是目前研究最多、最 广泛的Acyl-ACP脱饱和酶。该酶催化的反应是在第9 10碳原子之间形成第一个双键，是 不饱和脂肪酸生物合成途径的第一步脱饱和，直接调控膜脂与贮脂中饱和与不饱和脂肪酸的 比例，该酶对调节油料作物种子中脂肪酸含量和组分具有非常重要的意义。千年桐是生产生 物柴油的理想树种之一，将千年桐的S^D基因构建在酵母表达载体上并整合到产油酵母中高效表达，使产油酵母的饱和脂肪酸向油酸转化，从而大大提高油脂成分中油酸的含量，为酵 母产油符合生物柴油的质量要求奠定基础。目前高效筛选产油酵母转化子的表达载体还鲜见报道。酵母是一种重要的基因表达系统， 其中酿酒酵母和毕赤酵母应用最广，但它们的表达载体在产油酵母中没有相应的表达元件， 因此不能直接作为产油酵母的表达载体。pCAMBIA系列的表达载体是植物中常用的表达载 体，其中pCAMBIA3300被改造后曾被用于转化产甘油的假丝酵母，获得了转基因工程菌。 pCAMBIA2300也属于这类表达载体，但它本身所携带的抗性标记基因——新霉素磷酸转移 酶基因(NPTII)具有卡那霉素抗性，而产油酵母对卡那霉素不是很敏感，因此也不能直接 作为产油酵母的表达载体。新一代的毕赤酵母表达质粒pPICZ A、 B、 C具有博来霉素(Zeocin) 抗性标记基因幼他，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选。幼他基因编码一种13，665 Da 的蛋白，具有Zeocin抗性的细胞可以避免Zeocin结合和剪切细胞DNA。 Zeocin可用于选择 哺乳动物细胞系、酵母、昆虫和细菌。在含Zeocin平板上生长的酵母转化子中，100%具有 外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程。将S/zWe基因从pPICZA、 B、 C表 达载体上克隆下来连接到常用的表达载体上，使该载体获得Zeocin抗性，有利于产油酵母转 化子的筛选。发明内容本发明的目的是克服上述技术的不足,而提供一种用Zeocin筛选千年桐基因的产油 酵母表达载体及构建方法。本发明目的通过以下技术方案来实现-本发明所述的用Zeocin筛选千年桐基因的产油酵母表达载体，该载体以 pCAMBIA2300为基本骨架，其所含的幼We基因，适用于筛选具有Zeocin抗性的转基因产 油酵母；该载体含有千年桐&4Z)基因，可以改变产油酵母脂肪酸成分从而提高油酸含量。本发明所述的用Zeocin筛选千年桐&4。基因的产油酵母表达载体的构建方法,步骤如下1 、千年桐基因cDNA编码区全长序列获得根据在GenBank上登录的基因核苷酸和氨基酸序列设计兼并引物，以千年桐种子总 RNA为模板，经RT-PCR扩增，获得全长cDNA，电泳回收基因cDNA片段，克 隆到pGEMT-Easy载体，转化大肠杆菌DH5a，测序，命名该载体为pGEM-T-Vesad。2、 &10正义表达载体构建结合表达载体pCAMBIA2300的限制性内切酶切位点——Kpn I、 I、 I、 Xba I、Sal I、 Pst I，分析基因的限制性内切酶酶切位点，由于基因不含Sal I、 Kpn I，因 此选用Sal I、 Kpiil两个限制性内切酶来作为插入WZ)基因的酶切位点。设计正义引物带Kpn I、反义引物带SalI酶切位点的引物，以克隆载体质粒pGEM-T-Vesad为模板进行PCR反应。 将扩增产物与表达载体pCAM2300分别用Sal I和Kpn I双酶切。电泳后回收扩增产物和 pCAMBIA2300的酶切产物，用T4 DNA连接酶进行连接，转化五.co// DH 5a感受态细胞。 提取质粒进行酶切鉴定。表达载体命名为pCAM2300-sad。3、 Zeocin抗性标记基因幼We的克隆根据pCAM2300-sad酶切位点特征，选择作为幼We基因的插入位点，设计包含幼We基 因TEF1、 EM7双启动子引物，两端含HindIII酶切位点，以毕赤酵母表达载体pPICZB为模板， 用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，电泳回收目的片段，克隆到pGEMT-Easy载体上，转 化大肠杆菌E co//DH5a，测序。命名该克隆载体为pGEM-T-Z。4、 酵母表达载体构建及农杆菌转化用HindIII分别酶切pCAM2300-sad和pGEM-T-Z，回收相应的片段，用T4 DNA连接酶 进行连接，转化五.co// DH 5a感受态细胞。提取质粒进行酶切鉴定。表达载体命名为 pCAM2300-sad-z。本发明有益的效果1、 本发明将从千年桐种子总RNA中分离的基因构建到酵母表达载体pCAMBIA2300 上，为产油酵母油酸含量的提高提供基因转移供体。2、 本发明根据毕赤酵母表达载体pPICZB设计引物分离了 Zeocin抗性基因S/z We，与上述重 组载体连接组成新载体，大大简化了产油酵母遗传转化过程，对于筛选具有Zeocin抗性 的转SAD基因的产油酵母具有重要作用。
图1:千年桐sad全长cDNA的RT-PCR结果，其中M是分子量标准DL2000, 1为扩增得到的目的基因片段。图2:重组质粒载体pCAM2300-sad酶切电泳图，其中，2为重组质粒，1.3.4为表达载 体酶切产物。图3:重组质粒载体pCAM2300-sad-z酶切电泳图，其中M为分子量标准DL2000， 1为 非重组质粒，2， 3， 4为重组质粒HindIII酶切产物 图4:质粒pCAM2300-sad-z表达载体构建过程。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。 1实验材料1.1植物材料2006年8月25日至9月10日，从中国林业科学研究院亚热带林业研究所树木园采取千 年桐发育中的果实，将种子剥出在液氮中速冻后一80°C冰箱保存备用。 1.2菌株与质粒大肠杆菌DH5a、根癌农杆菌EHA 105为本实验室保存。质粒pCAMBIA2300为本 实验室保存，克隆载体pGEM-TEasy购自Promega公司。 1.3主要生化试剂RNA提取试剂盒购自天泽基因工程有限公司(四川绵阳)；cDNA合成试剂盒、IPTG、 X-gal、购自上海生工生物工程技术有限公司；质粒提取试剂盒、DNA胶纯化回收试剂盒购 自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase、大肠杆菌￡.co//DH5a感受态细胞、T4连接酶、限制性内切酶￡coR I、 5awHI、 ^>a/I、 Sa/I、尺/wI均购自宝生物工程(大连)有限公司。引物合成及菌液测序分别由上海 生工生物工程技术有限公司和上海联合基因公司完成。 2实验方法2.1千年桐发育中种子总RNA提取(1) 液氮研磨破碎细胞，取约100mg左右的细粉至新离心管中；(2) 加入1 mL溶液A振荡混合30 s;(3) 加入0.3mL溶液B和0.2mL氯仿，振荡混匀；(4) 室温离心13000 g, 5min，取上清(约0.8mL)移至新离心管中；(5) 加入0.5mL溶液C和0.2mL氯仿，振荡混匀；(6) 室温离心13000 g， 3min，取上清(约950mL)移至新管中；(7) 力tU/2体积的溶液D，振荡混匀；(8) 室温离心13000 g， 5min，形成白色沉淀；(9) 加1 mL75X乙醇振荡混匀，离心13000 g, 3 min，弃上清；(10) 重复步骤9，吹干后溶于30uLDEPC处理的纯水中。(11) 取2 uL在1.0%的琼脂糖凝胶中快速电泳检测总RNA的完整性。于一8(TC保存待用。 2.2反转录运用(上海生工)AMV第一链cDNA合成试剂盒，以总RNA为模板，合成cDNA第一 链。具体方法如下 (1)冰浴中加总RNA 3 uL下游特异性引物 luL 无RNA酶去离子水 3 uL总体积 7uL(2) 混匀离心3 5s， 70。C5min，冰浴30 s(3) 冰浴加入5 x Reaction Buffer 4 uLRNA酶抑制剂(20U/ uL) 1 uL dNTP(10mM) 2 uL(4) 混匀离心，37。C5min，加入1 uLM-MLV RT(20 U/uL)，混匀。(5) 37°C 60min;最后70。C保温10min。 2.3 PCR扩增基因cDNA编码区全长根据在GenBank上登录的基因核苷酸和氨基酸序列设计兼并引物，引物序列如下K，d F1: AAC AAT ggC丽T NA A gNT C A A Rl: TgC ACT NAN AgC TNC ACT TCT其中N为A、 T、 C、 G为四碱基兼并。以2.2合成的cDNA为模板，以KradFl、 Rl为引物，PCR扩增千年桐S^D基因cDNA编码区。扩增条件为94'C预变性4 min， 94'C30S、 58。C30S、 72。Clmin， 30个循环，72。C延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。 结果如图1。2.4博来霉素(Zeocin)抗性基因SA 6fe的克隆根据pCAM2300酶切位点特征，即含有HindIII，设计包含幼6/e基因、TEF1、EM7双启 动子引物Zl: gCgAATTCACgCACTCAAgCTZ2: ggT CTA gAT TAC AgC TgC ACT TCT CTT T以毕赤酵母表达载体pPICZ B为模板，以Z1、 Z2为引物，扩增幼6/e基因。扩增条件 为98。C预变性5min， 98。C10S、 57。C15S、 72。Clminl0s， 30个循环，72。C延伸7min。扩增 产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。2.5扩增产物的克隆和测序 2.5.1 PCR产物的回收
将cDNA和幼We基因用B型小量DNA片断快速胶回收试剂盒(博大泰克)进行特 异性扩增产物的回收纯化，操作步骤如下
(1) 在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳，使扩增产物分离形成特异带；
(2) 切下目的条带置离心管中；
(3) 加700uL溶胶液，55。C溶胶，其间偶尔摇动；装柱，12000 rpm，离心30 s;去掉废
液；
(4) 加入500uL漂洗液(wash buffer)漂洗，12000 rpm离心30 s。重复漂洗一次。倒掉 废液后再于12000 rpm离心2 min;
(5) 加入45uL的洗脱缓冲液(Elutionbuffer)或水，室温放置2min， 12000rpm离心。 管底溶液即为回收的目的片断。
2.5.2回收产物的连接和转化
回收产物连接到pGEM T-Easy载体上，按照Promega公司pGEM-T Easy连接试剂盒说 明书进行操作。转化按照宝生物￡ co// DH 5a感受态转化方法进行。
(1) 将回收纯化的PCR产物连接到pGEM-TEasy载体上，在离心管中分别加入下列成分 回收产物4uL; T载体luL; 2xT4 Buffer 5 uL; T4 DNA连接酶(3 U/uL) 1 uL;轻轻混匀后 离心收集到管底，16'C过夜连接。
(2) 从一80。C冰箱中取100uL感受态细胞，室温下解冻后立即置冰上；
(3) 加入5 uL连接产物，混匀，冰浴30 min;
(4) 42。C水浴热击90 s，迅速置于冰上冷却3 5 min;
(5) 向管中加入lmLLB液体培养基(不含Amp)，混匀后37'C振荡培养1 h,使菌恢复 正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp');
(6) 将上述菌液摇匀后取200 uL加入40 uL X-gal及4 uL IPTG混合均匀，涂布于含Amp 的筛选平板上。37'C倒置过夜培养。
(7) 白色菌落为重组子。 2.5.3质粒DNA提取
将5 mL含Amp (50 mg/L) LB液体培养基加入到50mL小三角瓶中，挑取白色单菌落 37^振荡过夜。质粒提取按照博大泰克公司试剂盒描述的方法进行。
(1)取l-3mL在LB培养基中过夜培养的菌液，12000 rpm离心30 s，弃尽上清。
8(2) 用250 uL己加入RNaseA的溶液I均匀悬浮细菌沉淀，室温放置5 min;
(3) 加入250uL溶液I1，温和上下翻转4-6次混匀，使菌体充分裂解；
(4) 加入350 uL溶液III，上下翻转6-8次混匀，12000 rpm离心10 min;
(5) 吸取离心上清并转移到DNA制备管中，12000 rpm离心1 min;
(6) 将制备管放回离心管，加入500 uL的Buffer Wl ， 12000 rpm离心1 min;弃滤液；
(7) 将制备管放回离心管，加入700 uL的Buffer W2, 12000 rpm离心1 min;弃滤液； 重复洗涤一次。
(8) 将制备管移入新的离心管中，在膜正中央加40-60uL水，室温静置lmin; 12000rpm 离心1 min。将收获的重组质粒于-20'C保存。
2.5.4质粒的酶切鉴定及测序
根据pGEMT-Easy载体的图谱，选用￡coR I限制性内切酶对提取的质粒进行鉴定。将酶 切鉴定的阳性克隆对应的菌液，送往上海联合基因集团公司联众基因科技研究院测序部进行 测序。命名该载体为pGEM-T-Vesad，全长4206bp，其特征在于所含SAD基因可作为构建其 它表达载体的供体，在添加Amp的液体LB培养基中繁殖含该载体的大肠杆菌②/f DH 5a 然后提取质粒就能大量生产该载体。 2.6含5L4Z)基因的表达载体构建
根据测序结果进行酶切位点分析，结合表达载体pCAMBIA2300的限制性酶切位点图谱， 选用Sal I、 Kpn I两个位置来作为插入目的片段的酶切位点。
设计带Sa/1、尺/wI酶切位点的引物
r證d F2: gAT gTC gAC ATg NCN NTC AAg NT
船ac R2: gAC ggT ACC TNA NAg CTN CAN TT
以克隆载体质粒pGEM-T-Vesad为模板进行PCR反应。将扩增产物与表达载体pCAM2300 一起均用Sal I和Kpn I双酶切。分别回收相应的片段，用T4 DNA连接酶进行连接，转化 co//DH 5a感受态细胞。将菌液涂布在含Kan的LB平板上，37'C倒置培养过夜。碱法提取 质粒DNA，双酶切质粒来验证目的片段插入是否正确，结果如图2。表达载体命名为 pCAM2300-sad，全长9933bp，其特征在于所含基因能在植物、真菌中表达，在添加Kan 的液体LB培养基中繁殖含该载体的大肠杆菌DH 5a然后提取质粒就能大量生产该载 体。
2.7含&4D、幼6fe双基因的酵母表达载体构建
根据pCAM2300-sad上的限制性酶切位点图谱，选用HindIII作为插入片段的酶切位点。以pPICZ B为模板扩增的幼We基因两端已包含HindIII酶切位点，将扩增产物与 pCAM2300-sad—起用HindIII酶切，分别回收相应的片段，用T4 DNA连接酶进行连接，转 化￡ co/i DH 5a感受态细胞。将菌液涂布在含相应抗生素的LB平板上，37'C倒置培养过夜。 提取质粒，由于幼We基因自带TEFl、 EM7双启动子及CYC1终止子，因此不用验证其插 入方向，直接用HindIII酶切，结果如图3。表达载体命名为pCAM2300-sad-z。该载体全长 11122bp，其特征在于所含&4￡>基因能在植物、真菌中表达，在添加Zeodn的液体LB培养 基中繁殖含该载体的大肠杆菌co// DH 5(x然后提取质粒就能大量生产该载体。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技 术方案，均落在本发明要求的保护范围。
权利要求
1、一种用Zeocin筛选千年桐SAD基因的产油酵母表达载体，其特征在于该载体以pCAMBIA2300为基本骨架，产油酵母表达载体含有千年桐SAD基因。
2、 根据权利要求l所述的用Zeocin筛选千年桐&4D基因的产油酵母表达载体，其特征 在于所述产油酵母表达载体同时含有幼We基因。
3、 一种构建如权利要求1所一种用Zeocin筛选千年桐5L4"基因的产油酵母表达载体的方法，其特征在于该方法包括步骤如下(1) 千年桐基因cDNA编码区全长序列获得根据在GenBank上登录的基因核苷酸和氨基酸序列设计兼并引物，以千年桐种子总 RNA为模板，经RT-PCR扩增，获得&4D全长cDNA,电泳回收目的片段，克隆到pGEM T-Easy 载体，转化大肠杆菌DH5a，测序，命名该载体为pGEM-T-Vesad;(2) S4I)正义表达载体构建根据测序结果进行酶切位点分析，结合表达载体pCAMBIA2300的限制性酶切位点图谱， 选用SalI、 Kpnl两个位置来作为插入目的片段的酶切位点；设计带& /1、《p"I酶切位点的 引物，以克隆载体质粒pGEM-T-Vesad为模板进行PCR反应；将扩增产物与表达载体 pCAM2300 —起均用Sal I和Kpn I双酶切；分别回收相应的片段，用T4 DNA连接酶进行连 接，转化co/i DH 5a感受态细胞；提取质粒进行酶切鉴定，表达载体命名为pCAM2300-sad;(3) 博来霉素(Zeocin)抗性标记基因幼We的克隆根据pCAM2300-sad酶切位点特征，选择作为S/ We基因的插入位点，设计包含幼We基 因TEF1、 EM7双启动子引物，两端含HindIII酶切位点，以毕赤酵母表达载体pPICZ B为模板， 用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，电泳回收目的片段，克隆到pGEMT-Easy载体上，转 化大肠杆菌五.co"DH5a，测序，命名该克隆载体为pGEM-T-Z;(4) 酵母表达载体构建及农杆菌转化用HindIII分别酶切pCAM2300-sad和pGEM-T-Z，回收相应的片段，用T4 DNA连接酶 进行连接，转化E. coli DH 5 a感受态细胞，提取质粒进行酶切鉴定，表达载体命名为 pCAM2300-sad-z。
全文摘要
本发明主要涉及一种用Zeocin筛选千年桐SAD基因的产油酵母表达载体，该载体以pCAMBIA2300为基本骨架，产油酵母表达载体含有千年桐SAD基因，或同时含有Sh ble基因；其构建方法步骤如下1.千年桐SAD基因cDNA编码区全长序列获得；2.SAD正义表达载体构建；3.Zeocin抗性标记基因Sh ble的克隆；4、酵母表达载体构建及农杆菌转化。本发明有益的效果本发明将从千年桐种子总RNA中分离的SAD基因构建到酵母表达载体pCAMBIA2300上，为产油酵母油酸含量的提高提供基因转移供体。本发明根据毕赤酵母表达载体pPICZ B设计引物分离了Zeocin抗性基因Sh ble，与上述重组载体连接组成新载体，大大简化了产油酵母遗传转化过程，对于筛选具有Zeocin抗性的转SAD基因的产油酵母具有重要作用。
文档编号C12N15/81GK101665802SQ20091015286
公开日2010年3月10日 申请日期2009年9月18日 优先权日2009年9月18日
发明者李纪元, 李辛雷, 敏 田, 范妙华, 范正琪, 陈东亮 申请人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所