与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoR_AAG/CTC112及其获得方法

专利名称：与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoR_AAG/CTC112及其获得方法
技术领域：
本发明涉及与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记及其获得的方法，属于生
物技术领域。
背景技术：
结球甘蓝在世界各地普遍栽培，也是我国的主要蔬菜作物之一。甘蓝霜霉病是由 专性寄生菌寄生霜霉引起的一种世界性病害，这种真菌性病害常引起幼苗和成株叶片枯 黄，导致产量降低，品质下降，给甘蓝生产上带来极大的损失。为解决上述的重大问题，挖掘 新的抗源，以往育种家们大多借助形态学标记和生化标记来辅助育种，经筛选已获得一些 优良的抗霜霉病自交系，但在抗病育种和抗病转育过程中用传统的方法筛选抗性植株时选 育时间较长、操作程序繁琐；另一方面抗性易受环境条件的影响，难以适应育种实践需要。 近年来，随着分子生物学的发展，利用分子标记辅助甘蓝抗病育种显出巨大潜力。 一类基于 DNA变异的分子标记技术已经被国内外许多学者应用于甘蓝抗病研究。应用分子标记技术， 可以免除传统育种中繁重的选择过程，而且跟踪、检测外源基因，还可以把多个抗霜霉病基 因聚合到同一优良品种中，获得持久抗性。目前，国内外对结球甘蓝霜霉病的研究较少，迄 今还未有与结球甘蓝霜霉病抗性基因相连锁的分子标记的报道。因此，寻找与抗性基因紧 密连锁的稳定、简单的分子标记不仅可应用到分子辅助育种中，提高甘蓝抗病育种效率，在 农业上有重要的应用价值，而且还可以为进一步克隆相关的抗病基因并分析其功能奠定基 础。

发明内容
本发明的目的在于提供一个与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记B0RAAe/ CTC112 及其获得的方法。
本发明实现其发明目的所采取的技术手段是该与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁
的分子标记B0RAAG/CTai2为SEQ ID No. 1的序列，序列的长度共191bp。 本发明所述的分子标记B0RAAe/CTai2的获得方法主要包括以下步骤 1)利用经过多代自交选育出的结球甘蓝的抗病亲本'R103'和感病亲本'S101'，
将所述抗病亲本'R103'和感病亲本'S101'进行杂交得到&群体，并构建相应的BQ、F2群
体； 2)根据田间自然发病材料的病害症状，以及病原物镜检和回接鉴定，明确该病害 的病原是十字花科霜霉菌； 3)经过对BQ、&群体田间自然诱发鉴定和苗期人工接种鉴定，进行抗病性调查发 现在所述BQ、 F2群体中对霜霉病的抗性受单基因显性控制； 4)利用AFLP分子标记技术，运用改良BSA法进行与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差 异片段的筛选；
5)筛选出 一 个AFLP差异片段B0RAAe/CTC，将该AFLP差异片段B0RAAe/CTC转化为 SCAR标记BoR雄組n2，设计的引物为FMG/CTC112 :5—-ATCCTACTGGTCCATACTCAC-3—和RAAG/CTC112 : 5— -TAGAAAATTTGGACATTCAT-3—;经单株验证分析，该SCAR标记BoRAAe/CTai2与抗性基因的遗 传距离为5. 7cM。 本发明采用AFLP分子标记方法对结球甘蓝抗、感亲本及F2分离群体运用改良BSA 法构建的抗、感池进行抗霜霉病标记的筛选，然后将得到与结球甘蓝抗霜霉病相关的差异 片段，该片段实际长191 bp。将该片段转化为简单、稳定的SCAR标记BoRg^，同时，经 F2代群体160个单株的SCAR验证，利用Mapmaker/EXP3. 0软件进行分析，BoRMe/CTeil2标记 与抗病基因遗传连锁距离为5. 7cM。该标记可用于结球甘蓝抗霜霉病的辅助选择育种。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于 霜霉病是目前影响结球甘蓝生产的一种严重病害。本发明利用AFLP分子标记方 法，结合改良的BSA法得到一个与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差异片段，并通过克隆、测 序、引物设计，将该片段转化成稳定简单的SCAR标记，可直接用于结球甘蓝抗霜霉病分子 标记的辅助选择育种。利用该分子标记，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点， 还可以有目的的聚合多个抗霜霉病基因，培育出具有稳定抗性的结球甘蓝品种。同时也可 利用这个新霜霉病抗性基因的分子标记克隆抗霜霉病基因，并对其进行结构和功能分析， 这对于进一步了解结球甘蓝抗霜霉病的分子遗传机理有积极意义。因此，本发明在结球甘 蓝育种实践及抗病理论研究上均具有重要意义。


图1是结球甘蓝霜霉病菌图，该霜霉病菌为寄生霜霉(Hyaloperonospora); 图2是两个亲本和两对抗感池预扩产物1 %琼脂糖凝胶电泳图； 图3是AFLP特异条带的筛选及另一对池和亲本的验证谱带图； 图4是SCAR在两亲本、两对池、FpBQ中的分布谱带图； 图5是SCAR标记在抗病单株和感病单株中的分布谱带图； 图6是SCAR标记在30份材料中验证谱带图； 其中，图2-6中符号分别表示为 1.抗病亲本；2.感病亲本；3.第一抗病池；4.第一感病池；5.第二抗病池；6.第
二感病池；7.Fi群体；8.感病亲本为回交亲本的BQ感病群体；9.感病亲本为回交亲本的
BQ抗病群体；10.抗病亲本为回交亲本的BQ ; M :1000bp pUC mix marker ; R :有B0RMe/CTC112特异带的杂交后代抗病单株； R* :没有该特异带，但表型为抗病的杂交后代单株； S :没有B0RMe/CTC112特异带的杂交后代感病单株； S* :有该特异带的感病单株，表型为感病的杂交后代单株。
具体实施例方式
本发明与结球甘蓝抗霜霉病分子标记B0RMe/CTai2的获得方法主要包括以下步骤
(1)利用经过多代自交选育出的结球甘蓝的抗病亲本'R103'和感病亲本'S101'，
4两者进行杂交得到巳群体，并构建了相应的BQ、 F2群体。根据田间发病材料的病害症状， 以及病原物镜检和回接鉴定，明确该病害的病原是十字花科霜霉菌(即寄生霜霉)。利用田 间自然诱发抗性鉴定和苗期人工接种抗性鉴定，表明结球甘蓝对霜霉病的抗性受单基因显 性控制。 具体做法为对经多年选育的结球甘蓝的抗病亲本'R103'和感病亲本'S101'整 个生长过程中的霜霉病等病害发生情况进行调查，记载发病率、病情指数，并观察和描述症 状。采集'S101'的新鲜病叶，并进行处理，培养新生孢子囊产生后，制作临时镜检片，观察 病菌孢囊梗和孢子囊的形态特征。另用80% a-羟基丙酸浸泡田间病叶表皮组织，在150 倍显微镜下观察卵孢子形态特征，重复试验以明确病原。如图l所示说明孢子梗和孢子囊 的形态特征与十字花科寄生霜霉相一致。田间自然诱发抗性鉴定，采用五点法进行调查抗 病性，对'R103'、 'S101'、F2和BQ群体进行发病情况调查，调查级别分为免疫、高抗、抗病、 耐病、感病和高感，并随机镜检发病植株的病原菌。田间苗期人工接种鉴定，即在结球甘蓝 拉十字期，将从感病亲本材料上得到的病菌，并进行重新培养后，采用孢子悬浮液喷雾法接 种，接种7天后进行抗性调查。 (2)用AFLP分子标记方法，得到与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差异片段B0RAAe/CTC。
具体做法是抗病亲本多代自交系'R103'为抗病基因供体，与多代自交系'S101' 感病材料进行杂交，并构建F2群体用于研究，用AFLP分子标记与改良BSA方法相结合得到 与结球甘蓝霜霉病相关的差异片段B0RAAC/CTC。
1)采用CTAB法提取与纯化甘蓝基因组DNA 具体做法为取结球甘蓝新鲜的嫩叶0. 5g，在液氮中研磨成粉末，迅速加入DNA提 取缓冲液2% CTAB(2% CTAB，50mmo1 L—1 Tris pH 8. 0，20,1 L—泊DTA， 1 % PVP-360, 1. 4mol L—、aC1，0. 2%疏基乙醇)，充分混匀后，65t:温浴45min，其间颠倒混匀2次。在 2(TC下，12000rpm离心20min，取上清，加入等体积预冷的氯仿异戊醇(24 : l)抽提，缓慢 颠倒混匀。在4t:下，12000rpm离心10min，取上清液，加入上清体积2/3预冷的异丙醇，缓慢 混匀。置于-20。C下培养30min。在4。C下，13000rpm离心10min，弃上清。加入lmL预冷的 70%乙醇洗涤两次DNA沉淀，微干。力n 200 ii L TE，溶解DNA，力n 2 y L 10mg *mL—^NAse 37°C 水浴60min，加入等体积200iiL预冷的氯仿异戊醇(24 : 1)混匀，静置10min。在4°C 下，12000离心10min，取上清加入1/9体积的3mo1 'L—NaAc， 2倍体积冷的无水乙醇。_20°C 放置30min。在4。C下13000rpm，离心15min，用70%的冷乙醇洗沉淀两次，再用无水乙醇漂 洗1次，风干后，加50 ii L ddH20溶解。紫外分光光度法检测DNA样品的浓度及质量，0. 8% 的琼脂糖凝胶(含0. 5% ii g/ ii L Goldview)电泳检测DNA的质量。
2)抗、感基因池的构建 具体做法为本发明采用改良的BSA法分别构建抗病池和感病池，用于AFLP引物 的多态性筛选。F2单株DNA提取后各取极端抗病和感病10个单株DNA等量混合，构建1对 抗感池，采用相同的方法另选不同单株构建另1对抗感池。抗病亲本'R103'和感病亲本 'S103' DNA采用10株混合样DNA。
(3)扩增多态性DNA(AFLP)分析 具体做法为AFLP接头和引物由上海生物工程合成。1对EcoR I和Msel预扩引 物，8个EcoR I和8个Mse I选择性引物，共构成64对选扩引物组合进行筛选。
5
i.酶切基因组DNA取150ng基因组DNA，采用EcoR I和Mse I进行双酶 切。酶切体系2.5U EcoRI 0. 125ii L，2. 5UMse I 0. 25 ii L， 10XY+/TangoBuffer (with 10XBSA)5. Oil L，补dd H20终体系为25ii L。 37。C酶切6h，酶切后于7(TC水浴处理15min
灭活酶。 ii.人工接头连接在酶切产物中加ddH20 0. 6 ii L， 10X连接Buf f er3. 0 ii L， EcoR I接头0. 5 ii L， Mse I接头0. 5 ii L， T4DNA连接酶0. 4 y L，终体系为30 y L。 20。C或室温连 接过夜。 iii.预扩增预扩增体系25 ii L :ddH20 18. 1 ii L，连接后DNA模板2. 5 ii L， EcoR I 引物(50ng' ii L—"O. 7ii L， Mse I引物(50ng ii L—0 0. 7 ii L， dNTPs (lOmmol L—0 0. 5 ii L， 10XPCR reaction buffer(with Mg2+) 2. 0 ii L， 2U Taq Polymerase 2. 5iiL。预扩增的PCR 反应程序为94°C 30s， 56°C 30s， 72°C 60s， 16个循环。产物在1. 2%的琼脂糖凝胶(含0. 5% g/ LGoldview)电泳检测，紫外灯下观察并拍照，表明基因组DNA酶切充分，接头连接较 好，可以继续进行AFLP分析。图2是第一抗病池3、第一感病池4、第二抗病池5、第二感病 池6的预扩结果，其中，图2中的M为1000bp pUC mixmarker。 iV.选择性扩增选择性扩增体系20 ii L :模板(预扩产物X 50) 0. 5 y L， EcoR I弓| 物(20ng ii L—"O. 25ii L， Mse I引物(20ng ii L—0 1. 5 ii L， d證s (10,1 L—0 0. 4 ii L， 10XPCR reaction buffer(with Mg2+) 2. 0 ii L， 2U Taq Polymerase 0. 5 ii L， ddH20 14. 85ii L。选择性扩增程序为94。C预变性120s，94。C 30s，65。C 30s，72。C 60s，然后每个循 环退火温度降低0. 7°C ，经13个循环后，退火温度降至56 °C ，再进行28个以下循环的扩增 94°C 30s，56。C 30s，72。C 60s后72。C延伸420s。产物于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 然后用银染方法显色。 V.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将玻璃板洗涤干净。干燥后，平板用BindingSilane 擦拭，U型板用Sigmacote处理。将平板平放，取0. 4mm的Space置于左右两侧，将U型板 压于其上，夹子固定。配置60mL 6%聚丙烯酰胺凝胶(25.2g尿素+6.8mL 40%的胶原液 +6mL 10XTBE，加水至60mL)的，灌入上述准备好的玻璃板中(灌入前胶中加入30 y LTEMED 和300iiL10X AP)。插梳子，聚合3h以上或过夜。胶聚合后，将玻璃板安装在电泳仪上， 60W恒功率预电泳30min。将AFLP选择性扩增样品加入等体积的Loading Buffer (98%甲 酰胺，10mM EDTA，O. 25%溴酚蓝，0. 25%二甲苯青)，95。C变性5min，立即置于冰上冷却。每 份样品取4 ii L上样，电泳至距胶底部约10cm处，终止电泳。 Vi.银染显色将电泳后的平板放入加有1L固定液(900mL ddH20中加入lOOmL冰醋 酸)的托盘中，轻摇20min。然后用1L ddH20漂洗凝胶3次，每次2min，将玻板取出，让玻板 竖直滴干10 20s，再用1L染色液(lg AgN03和1. 5mL 37%甲醛溶于1L ddH20中)染色 30min，随后用1L ddH20漂洗1次，立即将胶置于预冷的显色液(30g Na2C03溶于1L ddH20 中，冰浴至l(TC，显色前加入l. 5mL 37X甲醛和200iiL 10mg'mL—^S^)中，轻摇显色，直 至胶上大部分条带都清晰出现。最后在显色完成后，用1L ddH20漂洗凝胶2次，每次2min， 将玻板取出自然晾干或将胶面放于通风厨中充分干燥，可以用照相机拍照或用扫描仪进行 扫描成像。 我们利用64对引物对抗、感池进行了 AFLP分析，发现在引物组合EcoRI-AAG/ Msel-CTC的扩增产物在抗病池中出现特异条带。图3是该引物组合扩增的结果，重复实验三次，此带仍能稳定出现，由此说明这条特异带可能与结球甘蓝霜霉病抗性存在联系。
3) AFLP差异片段转化为稳定的SCAR标记B0RAAG/CTC112 具体做法是为了将AFLP分析得到的差异片段B0RMe/CTC转化成稳定简单的SCAR 标记，将该差异片段用上海生物工程公司的UNIQ-5柱离心式DNA胶回收试剂盒纯化，纯化 的DNA片段与PGEM*-Teasy Vector (Promega)连接，转化大肠杆菌Jml09，重组质粒PRC产 物电泳检测，EcoRI酶切鉴定，获得阳性克隆子，送Sangon测序。将测序结果用生物信息学 SMS进行分析，并通过Internet与GenBank国际基因数据库进行同源性分析。经双端测序 后，该片段共由191bp组成。该序列为SEQ ID No. l的序列。由于从GenBank没有查询到 相关的基因与该片段同源，该片段可以认为是结球甘蓝'R103'中与抗霜霉病相关的新的片 段。 根据克隆片段的DNA序列，我们合成了一对SCAR标记引物，该对引物序列如下
F雄/面2 :5— -ATCCTACTGGTCCATACTCAC-3— RMG/CTC112 :5—-TAGAAAATTTGGAAAGTTCAT-3— 用上述引物在抗感亲本、2对抗感池、巳、群体中分别进行扩增，反应体系为 IOXPCR反应缓冲液2ii L(with Mg2+) ， dNTP (lOmmol L—0 0. 4 ii L，引物1 (10 ii M) 0. 5 ii L，引 物2 (10 ii M) 0. 5 ii L， 5U Taq E 0. 2 ii L，模板DNA (50ng ii L—0 1 ii L， ddH20 15. 4 ii L，总体积 20ii L ;反应程序为94。C 180s，94。C 30s，53。C 30s，72。C 30s，35个循环，72。C 420s，。扩增 产物在1. 2%的琼脂糖凝胶(含O. 5% i！ g/ii L Goldview)上电泳检测，紫外反射投射分析 仪观察并照相。扩增结果证明，在抗病亲本、2个抗病池、、以抗病亲本为回交亲本的BQ和 以感病亲本为回交亲本的抗病群体中均扩增出110bp左右的一条特异带，而在感病亲本、 感病池和以感病亲本为回交亲本的感病群体中没有检测到这条特异带。由此说明AFLP得 到的差异片段确实与结球甘蓝霜霉病抗性有关。具体可参看图4。 结球甘蓝抗病亲本'R103'和感病亲本'S101'杂交构建的&分离群体中，经田 间自然鉴定后的抗、感单株分别提取总DNA，用上述同样的反应体系及程序，用上述SCAR引 物进行单株的PCR扩增，统计抗、感单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用 M即maker EXP3. 0b计算标记与抗霜霉病基因之间的遗传距离。结果显示(图5所示)，96 个抗病单株中有94株存在特异带，2株没有特异带；35株感病单株中5株有特异带，其他的 均没有特异带。这一实验结果表明特异SCAR标记是与结球甘蓝抗病性是紧密连锁的，但在 抗病和感病单株中有一定的交换，交换率为5. 3% ，经计算SCAR标记BOR雄/cTcm与抗病基因 的遗传距离为5. 7cM。如图5所示R是有B0RMe/erai2特异带的杂交后代抗病单株；R*是没 有该特异带，但表型为抗病的杂交后代单株，表明发生了交换；S是没有B0RAAe/CTai2特异带 的杂交后代感病单株，SA是有该特异带的感病单株，表型为感病的杂交后代单株，表明也发 生了交换。 为了检测这个SCAR标记的可靠性，我们用20份多代自交所得的材料进行验证。10 份抗病材料中都有该特异带，10份抗病和感病杂交材料中也可以扩出该条带，在10份感病 材料中有1份中得到了特异条带。如图6所示R是有B0RMe/CTai2特异带的杂交后代抗病 材料；S是没有B0RAAe/CTai2特异带的杂交后代感病材料，S*是有该特异带的感病材料，表型 为感病的感病材料，表明该SCAR标记可直接用于结球甘蓝霜霉病抗病育种。
上述实施用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。 与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoRMe/CTC112序列表 〈110>浙江大学 江苏省农业科学院蔬菜研究所 〈120〉与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoRAAG/CTC112及其获得方法 〈160〉1 〈170>PatentIn version 3. 1 〈210>1 〈211〉 191 <212>DNA 〈213〉结球甘蓝(Brassica oleracea var. c即itata L ) 〈400〉 1 gactgcgtec caattcaagg cttctgtgag agctcaggga teactcgaca tcctectggt 60 ccatectcac cgcagcag朋tggagtegte gagcgtcgaa acagaaccct tctcgagatg 120 actaggagca taatgaaaca tatgaatgtt ccaaattttc tatgggggga aggagttact 180 caggactcat c 191
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权利要求
一种与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoRAAG/CTC112，其特征在于为SEQ ID No.1的序列，序列的长度共191bp。
2. —种权利要求1所述的分子标记BoR皿/^^的获得方法，其特征在于包括以下步骤1) 利用经过多代自交选育出的结球甘蓝的抗病亲本'R103'和感病亲本'S101'，将所 述抗病亲本'R103'和感病亲本'S101'进行杂交得到巳群体，并构建相应的BQ、F2群体；2) 根据田间自然发病材料的病害症状，以及病原物镜检和回接鉴定，明确该病害的病 原是十字花科霜霉菌；3) 经过对BQ、&群体田间自然诱发鉴定和苗期人工接种鉴定，进行抗病性调查发现在 所述BQ、F2群体中对霜霉病的抗性受单基因显性控制；4) 利用AFLP分子标记技术，运用改良BSA法进行与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差异片 段的筛选；5) 筛选出 一 个AFLP差异片段B0RAAe/CTC，将该AFLP差异片段B0RMe/CTC转化为SCAR 标记BoRMG/CTC112，设计的引物为FMG/CTC112 :5:ATCCTACTGGTCCATACTCAC-3—和RAAG/CTC112 : 5— l-TAGAAAATTTGGACATTCAT-3—;经单株验证分析，该SCAR标记BoRMe/CTai2与抗性基因的遗 传距离为5. 7cM。
全文摘要
本发明公开了一种与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoRAAG/CTC112及其获得方法。该分子标记为SEQ ID No.1的序列，长度共191bp。其获得方法如下将结球甘蓝的抗病亲本‘R103’和感病亲本‘S101’杂交得到F1群体并构建相应的BC1、F2群体；明确该病害的病原是十字花科霜霉菌；进行抗病性调查发现在BC1、F2群体中对霜霉病的抗性受单基因显性控制；利用AFLP分子标记技术及改良BSA法进行与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差异片段的筛选，得到AFLP差异片段BoRAAG/CTC并转化为SCAR标记BoRAAG/CTC112，设计的引物为FAAG/CTC1125`-AT CCTACTGGTCCATACTCAC-3`和RAAG/CTC1125`-TAGAAAATTTGGACATTCAT-3`；该SCAR标记BoRAAG/CTC112与抗性基因的遗传距离为5.7cM。该分子标记简单稳定，克服了常规育种方法周期长等缺点；可有目的的聚合多个抗霜霉病基因，培育出具稳定抗性的结球甘蓝品种。
文档编号C12Q1/68GK101748211SQ20091015294
公开日2010年6月23日 申请日期2009年9月21日 优先权日2009年9月21日
发明者余小林, 曹家树, 李建斌, 王神云 申请人:浙江大学;江苏省农业科学院蔬菜研究所