专利名称：生产谷氨酰胺的发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种生产谷氨酰胺的发酵方法，属于发酵技术领域。
背景技术：
谷氨酰胺是一种中性多功能氨基酸，因其独特而复杂的生理功能逐渐成为了营养 学、生理学、免疫学等学科的研究热点。谷氨酰胺具有维持机体酸碱平衡，调节机体免疫功 能等诸多的生理作用，是治疗肠溃疡、慢性胃炎的有效药物，它不仅为机体物质和能量代谢 提供原料，而且为核酸、糖蛋白等的生物合成提供氮。关于谷氨酰胺的生产，由于它特殊 的理化性质，用化工合成的方法生产难度很大，目前较为理想的方法是通过谷氨酰胺的前 体-谷氨酸为原料，以Raney镍铝合金为催化剂化工合成谷氨酰胺；但是仍存在反应步骤多 的问题，而且需要多次分离，得率低(20% 40%)，不稳定；PH、温度等条件要求苛刻，易出 现多种强副反应-生成的谷氨酰胺重新分解或形成焦谷氨酸。此外，终产物的分离尚存在 较大技术难度，而且成本较高，还存在环境污染等问题。国内的一些研究机构在90年代开 始对发酵法生产谷氨酰胺进行了一些探索，获得了一些产量较高的菌株，但生产谷氨酰胺 都还只是实验室阶段。目前谷氨酰胺都是进口的，国内生产的得率很低。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种生产谷氨酰胺的发酵方法。本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的生产谷氨酰胺的发酵方 法，依次包括如下步骤(1)选取重量比分别为15%、1.5%、0. 01%、0. 05%、10%、5%的葡萄糖、玉米桨、 磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸铵、CaCO3，其余部分为水，然后将上述物质搅拌并制成溶液；(2)待上述溶液制成后再加入硫酸锰120mg/L、硫酸铜10mg/L、硫酸铁lmg/L、维生 素Biang/L、生物素H ang/L，再次搅拌，制得均一稳定的底物；(3)在步骤( 制得的底物中接种黄色短杆菌，并控制温度在30-32°C ；(4)在第1 M小时将PH控制在7. 0 7. 2，M小时后将PH控制在6. 5，并发酵 44-48小时。黄色短杆菌在市场上能够买到，它的形态学特性、培养特性及生理特性如下短杆 至棒状，无鞭毛，不运动，不形成芽孢，菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、菌落半透明 状；适宜培养温度30°C，适宜保存温度-70°C。发酵法生产谷氨酰胺的难点在于生产中不清楚该在发酵液中需放置什么配料，特 别是无机盐需要放哪几种，各放多少量以及条件的控制。本发明人经过长时间的试验和总 结得出了上述配方，并通过严格的条件控制可将谷氨酰胺的产量提升到45g/L，达到国内先 进水平。作为优选，在发酵用时到达44小时后，将底物中生成的谷氨酰胺分离出来的同时 补充葡萄糖、玉米桨、磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸铵、CaCO3、硫酸锰、硫酸铜、硫酸铁、维生素Bi、生物素H，以维持发酵液中各物质含量的稳定。优选后的方案可实现连续生产，其难度之一在于如何将谷氨酰胺适时地分离出 来，以避免谷氨酰胺向谷氨酸转化，本发明人经过长期的实践，发现在发酵后的44 48分 钟分离谷氨酰胺，能获得较好的得率；难度之二在于如何保证黄色短杆菌维持在稳定期，防 止它向衰亡期转变。本发明人经过长期实践，发现在发酵进行M小时后将PH控制略微调 低，即控制在6. 5时可有效延长稳定期。综上所述，本发明具有以下有益效果1、本发明方法可替代化工合成方法生产谷氨酰胺，这样不仅生产成本低，效率高， 而且可有效减轻对环境的污染；2、本发明方法是实验室研究转化为工业生产的典型，其谷氨酰胺得率与实验室的 得率相差不大，实验室为46. 6g/L，工业生产为45g/L ；达到国内先进水平。
图1是谷氨酰胺发酵过程曲线图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明作进一步详细说明。本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人 员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本 发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。生产谷氨酰胺的发酵方法，依次包括如下步骤(1)选取重量比分别为15%、1.5%、0. 01%、0. 05%、10%、5%的葡萄糖、玉米桨、 磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸铵、CaCO3，其余部分为水，然后将上述物质搅拌并制成溶液；(2)待上述溶液制成后再加入硫酸锰120mg/L、硫酸铜10mg/L、硫酸铁lmg/L、维生 素Biang/L、生物素H ang/L，再次搅拌，制得均一稳定的底物；(3)在步骤⑵制得的底物中接种黄色短杆菌，并控制温度在30-32°C ；(4)在第1 M小时将PH控制在7. O 7. 2，M小时后将PH控制在6. 5，并发酵 44-48小时。在发酵用时到达44小时后，将底物中生成的谷氨酰胺分离出来的同时补充葡萄 糖、玉米桨、磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸铵、CaCO3、硫酸锰、硫酸铜、硫酸铁、维生素Bi、生物素 H，以维持发酵液中各物质含量的稳定。谷氨酰胺工业预生产的研究1材料与方法1. 1 菌种H'fe^iff ' (Brevibacterium flavum)1. 2试剂和仪器玉米浆、葡萄糖、其他均为国产试剂(化学纯)1. 2. 1 仪器721型分光光度计、pH计、4
发酵罐①NBS公司SF2116型自控罐配有pH电极和溶氧电极；②往复无节调速摇床。1. 2. 2 培养基发酵培养基葡萄糖15 %，玉米桨1.5%，磷酸二氢钾0.01%，硫酸锌0.05%，硫酸 铵10%，硫酸铜10mg/L，硫酸锰120mg/L，CaC035%，硫酸铁lmg/L ；维生素Bl^iig/L，生物素 H 2mg/L ；PH 6. 5。1.2.3培养条件16L自控罐装液量8L，118°C消毒5min，冷却后种量3% 5%接入发酵罐培养液 中，按试验需要控制PH、风量、转速、溶氧水平。发酵过程中定期取样，在培养基平板上划线， 检查有无染菌，并测定PH、及谷氨酰胺产量。1.2.4分析方法1.2. 4. 1谷氨酰胺测定纸层析法发酵液经离心除去菌体等固体物质，在层析纸上定量点样，用谷氨酰胺 标准液对照。以正丁醇、冰醋酸、水G 1 1)作展开剂。展开完毕，吹干滤纸，用0.5% 茚三酮丙酮溶液显色。洗脱液为0. 1 % CuSO4 · 5H20 75%乙醇O 38)，洗脱30min后 在510nm测0. D值，并与标准谷氨酰胺比较计算样品中谷氨酰胺含量。1. 2. 4. 2发酵液残糖的测定采用斐林定糖法1.2. 4. 3pH 值的测定用酸度计或精密pH试纸，发酵过程用pH电极测定。2实验结果与讨论(1)ρΗ对谷氨酰胺发酵的影响由于菌体对培养基营养成分的利用和代谢产物的形成，使培养液的pH不断发生 变化。培养基中的(NH4)2S0 4被菌体利用以及糖被利用生成有机酸等中间代谢产物，使pH 值下降；谷氨酰胺的形成，耗用大量的氨也使PH值下降。因此，需要不断补充氮源(氨)和 调节PH值，直至发酵结束。本研究采用的黄色短杆菌在中性和微碱性条件下，发酵产生积 累谷氨酸；在酸性条件下(PH 5. O 5. 8)产生谷氨酰胺(见下表)。产胺期PH对谷氨酰胺的影响
权利要求
1.生产谷氨酰胺的发酵方法，依次包括如下步骤(1)选取重量比分别为15%U.5%,0.01%,0. 05%、10%、5%的葡萄糖、玉米桨、磷酸 二氢钾、硫酸锌、硫酸铵、CaCO3，其余部分为水，然后将上述物质搅拌并制成溶液；(2)待上述溶液制成后再加入硫酸锰120mg/L、硫酸铜10mg/L、硫酸铁lmg/L、维生素 Biang/L、生物素H ang/L，再次搅拌，制得均一稳定的底物；(3)在步骤( 制得的底物中接种黄色短杆菌，并控制温度在30-32°C；(4)在第1 24小时将PH控制在7.0 7. 2，M小时后将PH控制在6.5，并发酵44-48 小时。
2.根据权利要求1所述的生产谷氨酰胺的发酵方法，其特征在于在发酵用时到达44 小时后，将底物中生成的谷氨酰胺分离出来的同时补充葡萄糖、玉米桨、磷酸二氢钾、硫酸 锌、硫酸铵、CaCO3、硫酸锰、硫酸铜、硫酸铁、维生素Bi、生物素H，以维持发酵液中各物质含 量的稳定。
全文摘要
本发明涉及一种生产谷氨酰胺的发酵方法，属于发酵技术领域。本发明方法可替代化工合成方法生产谷氨酰胺，这样不仅生产成本低，效率高，而且可有效减轻对环境的污染；本发明方法是实验室研究转化为工业生产的典型，其谷氨酰胺得率与实验室的得率相差不大，实验室为46.6g/L，工业生产为45g/L；达到国内先进水平。
文档编号C12R1/13GK102051391SQ20091015320
公开日2011年5月11日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者姜礼辉, 邹晓庭 申请人:浙江博信药业有限公司