专利名称：：生物催化法生产r-扁桃酸及其衍生物的方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物催化法生产R-扁桃酸及其衍生物的方法。(二)
背景技术：
：R-扁桃酸是一种重要的药物中间体，广泛地应用于多种药物的合成，如头孢菌素、青霉素、抗肿瘤制剂、抗肥胖药物、光学纯的氨基酸、血管紧张肽转化酶抑制剂、辅酶A等，还可以用来制成手性溶剂。研究表明，单一构型的扁桃酸(或扁桃酸的衍生物)所合成的药物与外消旋的扁桃酸或其衍生物合成的药物相比，不仅药效更高，更关键的是副作用下降了，因此在许多药物合成方面应用必须要求是单一型化合物；R-扁桃酸由于具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学拆分剂，可使多数外消旋体胺类和氨基酸类经非对映体异构盐形成法进行光学拆分，如治咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物可由R型扁桃酸拆分。R-扁桃酸新的用途正在不断被开发，市场需求日益扩大。据不完全统计，国外扁桃酸主要生产公司有德国瓦克公司、日本山川药品公司和日东化学公司等。目前国际市场上光学活性的扁桃酸需求约以年均10%以上的速度增长，已成为热点的精细化工中间体。制备R-扁桃酸的旋光性单体大致有以下三种方法不对称合成法、光学异构体拆分法、生物合成法，其中生物合成法为最理想的方法。1、不对称合成法是直接利用化学合成的方法来合成扁桃酸的异构体的一种方法。Blacker等人采用不对称合成法，以TMSCN为氰化剂，Jacobsen催化剂合成了扁桃酸及其衍生物。所得产物的e.e^为65^85X。但是该法所采用的催化剂价格昂贵，且回收不便，反应条件的要求也比较严格，造成成本过高，难以工业化生产。吴珊珊等人用自制的手性相转移催化剂来催化苯甲醛和氯仿合成手性扁桃酸，但是所得的扁桃酸e.e^都不高，最大的仅为3.4%。2、光学异构体的拆分是先合成扁桃酸的外消旋体，再采用一定的方法对其进行拆分。R-扁桃酸作为一种高附加值的物质，其应用非常广泛、且市场需求量大，其制备越来越受到重视。国内外已有很多学者尝试用各种途径来制备该物质。其中通过对外消旋扁桃酸的拆分可以得到R-扁桃酸。拆分的方法主要有以下几种。①非对映体盐结晶拆分法，面临的共同的问题就是价格昂贵，且有一定的毒性，因此在一定程度上造成了资源的浪费和环境的污染。②色谱拆分法，色谱法具有较好的容量、选择性和稳定性，拆分纯度最高，在手性拆分中发挥越来越重要的作用，但是该法设备费用太高，消耗大，成本太高，处理量小，因此仅限于检测以及实验室制备，无法用于商业生产。③手性萃取拆分法，手性萃取分离法是近几年才提出的手性分离方法，其基本原理是依靠手性选择体与两种对映体生成两种非对映体的自由能差将外消旋体分开，在足够多的级数下，可实现对映体的高纯度分离。离商业化生产还有很大的距离。④毛细管电泳拆分法，毛细管电泳(CE)是一种电迁移技术，因具有高效、快速、经济等特点，广泛应用于各种药物对映体的分离其原理是加入手性选择剂使与对映体分别结合，根据对映体和选择剂结合的稳定常数的区别进行分离。该方法就有成本高等缺点。⑤酶法拆分，从外消旋扁桃酸出发，先利用具有立体选择性的脂肪酶将其中的R型对映体酯化，再利用外消旋酶酯化外销旋的的S型异构体，从而达到了拆分的目的。但是不管用那种拆分的方法，理论收率也只有50%。3、生物法制备R-扁桃酸大致有三种方法(1)先合成扁桃酸外消旋体，而后酯化或氨解，获得扁桃酸酯或扁桃酸酰胺，再在酯化水解酶或酰胺水解酶的作用下，得到单一对映体扁桃酸。Gan即ati等人首先将外消旋体扁桃酸用交换树脂催化转变为扁桃酸甲酯，而后用假丝酵母中的水解酶立体水解成R-扁桃酸，光学纯度只有78%。(2)以苯乙酮酸为底物直接利用具有氧化还原酶的微生物催化合成手性扁桃酸，多数是形成R-扁桃酸。TakaoM等人利用链球菌、假丝酵母、肠球菌、红酵母、酵母等中的还原酶将苯乙酮酸立体还原为R-扁桃酸，但是收率较低。(3)以苯甲醛和氢氰酸为原料，先制得扁桃腈，后在腈水解酶的作用下，得到R-扁桃酸。目前已报导的含有能催化扁桃腈生产R-扁桃酸腈水解酶的微生物主要有AlcaligenesfaecalisATCC8750，AlcaligenesECU0401，PseudomonasputidaMTCC5110等。但是面临着活性低，工业化困难等问题。
发明内容为克服上述技术的缺陷，本发明利用筛选得到的高活性腈水解酶菌株，提供一种收率高的生物催化外消旋扁桃腈化合物生成R-扁桃酸及其衍生物的方法，应用于R-扁桃酸和R-邻氯扁桃酸的工业生产。本发明采用的技术方案是生物催化法生产手性R-扁桃酸及其衍生物的方法，所述方法包括在以式(I)所示的外消旋扁桃腈化合物为底物、以粪产碱杆菌CCTCCNo:M208168培养获得的腈水解酶为催化剂(催化剂可以为纯化后的酶液，也可直接以含酶细胞形式参与反应)的反应体系中，于pH8.08.5、206(TC下进行水解反应，得到式(II)所示的手性R_扁桃酸化合物OHOH(II)式(1)、(II)中，R为H或卤素。涉及反应式如下4R-扁桃酸化合物I+HCN所述粪产碱杆菌CCTCCNo:M208168为粪产碱杆菌的突变株粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)ZJUTBIO，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo:M208168，保藏日期2008年10月22日，该菌株已作为新菌株在在先申请"微生物催化法生产亚氨基二乙酸及其菌株"(申请号CN200810122191.3)中予以保护。发明人经研究发现，该菌株除了可以用于亚氨基二乙酸的生产以外，还可用于R-扁桃酸化合物的生产，不同于已经报道的用于生产R-扁桃酸的其它菌种。该菌株一个显著的特点是催化扁桃腈生产R-扁桃酸的活性比现有的菌种都高，更适合于R-扁桃酸和R-邻氯扁桃酸的工业化生产。所述反应体系中底物外消旋扁桃腈化合物的初始浓度为10100mmol/L。所述反应在pH8.08.5的水溶液或磷酸盐缓冲液中进行。所述腈水解酶来自粪产碱杆菌CCTCCNo:M208168培养获得的含酶细胞，每10ml反应体系添加所述含酶细胞湿重为1090mg。所述含酶细胞由如下方法制备得到粪产碱杆菌CCTCCNo:M20816S接种至常规适用于粪产碱杆菌的发酵培养基，在培养开始后06小时加入15g/L的诱导剂，于204(TC下培养2496小时，培养得到的发酵液经分离(离心或膜分离)，得到所述含酶细胞；所述诱导剂为下列之一正丁腈、异丁腈、己内酰胺。本发明采用单因素实验和响应面法对Alcaligenes-faecalis产腈水解酶的培养基组分进行了优化，实验结果得出最优发酵培养基组成醋酸铵12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠lg/L，硫酸镁0.2g/L，初始pH7.5，溶剂为水(诱导剂正丁腈直接加入至发酵培养基中)。用以上培养基，在151发酵罐中的生长与产酶情况，发酵条件温度3(TC，接种量6%(v/v)，在上述条件下培养20h后，生物量为2.64g/L，以R-扁桃腈为底物，腈水解酶的活力达到997U/L。具体的，所述方法如下(1)粪产碱杆菌CCTCCNo:M208168接种至发酵培养基，于2040。C下培养2496小时，培养得到的发酵液经分离，得到所述含酶细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下醋酸铵12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠lg/L，硫酸镁0.2g/L，pH7.5，溶剂为水；5(2)将底物外消旋扁桃腈或邻氯扁桃腈和步骤(1)含酶细胞加入至pH8.08.5的磷酸盐缓冲液中，底物初始浓度为1050mmol/L，含酶细胞加入量为15g/L，于206(TC下进行水解反应，制得R-扁桃酸或R-邻氯扁桃酸。本发明的有益效果主要体现在菌种腈水解酶活性高，菌体用量少，反应过程中废水产量少，污染少；反应条件温和、能耗低；成本低，转化率高、产率高，易于工业化生产。(四)图1为实施例1中菌株WT10的诱变谱；图2为15L发酵罐中A.faecalisZJUTB10的生长和产酶曲线；图3为不同底物浓度的产物生成曲线。(五)具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:菌株的筛选及鉴定1、菌种的筛选从浙江省各地的工厂的排污口，垃圾废弃物堆放处以及实验室附近采集到约80份土样用于菌种筛选。富集培养基终浓度组成(NH4)2S04lg/L，KH2P040.2g/L，Na2HP040.8g/L，MgS047H200.2g/L，CaCl20.lg/L，FeCl30.005g/L，pH7.O，溶剂为水。斜面培养基终浓度组成葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，K2HP045g/L，MgS047H200.2g/L，FeS040.03g/L，NaCllg/L，琼脂20g/L，pH7.0，溶剂为水。产酶培养基终浓度组成葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，K2HP045g/L，MgS047H200.2g/L，FeS040.03g/L，NaCllg/L，己内酰胺lg/L，pH7.O，溶剂为水。在富集培养基中加入2mM苯乙腈作为碳氮源，土样中的微生物经过两次富集培养，每次富集培养时间为3d左右，培养温度为3(TC，将培养液稀释涂布，涂布完毕后置于生化培养箱中培养，培养温度为30°C，培养时间以长出合适的单菌落为宜，大致为2d左右。待长出合适大小的单菌落后，将单菌落转接于试管斜面并编号，继续置于生化培养箱中培养，培养温度为30°C，培养23d。再从已长好的斜面中挑取一环转接至产酶培养基中，摇瓶培养温度为30°C，摇床转速为150rpm。观察微生物的生长情况，培养23d后，将发酵液高速冷冻离心(10000rpm，4°C，10min)得到菌体，并用生理盐水洗涤一次，离心后弃上清用于转化。转化条件如下磷酸盐缓冲液(10mM，pH7.2)中，加入菌体，使得菌悬液浓度为6g/l，扁桃腈10mM。通过HPLC分析产物R-扁桃酸的浓度及其光学活性。经过两次富集培养得到225株菌株，它们可以利用该腈化合物作为碳氮源。将这225株菌株在以己内酰胺作为产酶诱导剂的培养基中进行发酵培养后，用于转化底物扁桃腈。其中编号为WT10的菌株活性最高，达到了53.09U/g，ee>99%。2、菌种的鉴定菌种WT10养约ld后，在平板上形成红色略透明、略突起、边缘薄、不整齐的菌落。通过革兰氏染色确定其为革兰氏阴性菌，在显微镜下观察，细胞为短杆状，成对或成链状生长。扫描电镜下放大可以清楚地观察到其大小约为1.21.5X0.60.8iim，周生鞭毛。生化反应特点为不分解任何糖类，在氧化发酵培养基中产生碱性反应，在蛋白胨肉汤中产氨，可使pH值达8.6以上。应用革兰氏阴性细菌鉴定试验卡(GNI)鉴定，菌种WT10生化特征如下characteristicsResultsGramstainingDP3-300Glucoese(oxidative)GrowthControl+Acetamide+EsculinPl肌tlndic肌UreaCitrate+Malonate+Phenylal肌inePolymyxinBLactoseMaltoseMannito1XyloseRaffinose7characteristicsResultsSorbitolSucoseInositolAdonitolp-CounmricH2So_NitrophenolRhamnoseArabinoseGlucose(Fermentative)ArginineLysineOrnithineOxidase10%lactose+，阳性；-，阴性。根据该菌种的生理生化特征，由此可以确定菌株WT10为粪产碱杆菌。3、菌种的诱变选育紫外线与氯化锂复合诱变在液体培养基中加入0.5%的氯化锂，培养后经离心获得菌体，用生理盐水制成菌悬液，加入玻璃珠振荡分散，以无菌滤纸过滤，使形成单细胞，进行紫外诱变，菌悬液的浓度约为1.0X108个/ml。取制备好的菌悬液约3ml于平皿中，将盛有菌悬液的平皿置于磁力搅拌器上，离紫外灯管约25cm，紫外灯功率为15W，打开皿盖，边搅拌边照射，照射时间为20s，且照射过程在暗室中进行，以免光修复，挑选正突变株进行等离子注入诱变。等离子注入诱变同上制备浓度为1.0X101Q个/ml的菌悬液，吸取0.lml涂布于8培养皿，于超净工作台中自然干燥，用10kev的氮离子(N+)照射处理，离子注入量为30s(离子束单位为X2.6X1013ions/cm2s)。诱变后用无菌水洗涤平皿，将诱变后菌株涂布与平板上培养，继续挑选正突变株进行紫外线与光复活交替处理。紫外线与光复活交替处理紫外照射同上所述，经紫外照射20s后自然光照30s，如此交替重复两次。筛选高活性，高选择性，并且遗传稳定的菌株作为进一步研究的对象。诱变谱见图1:对突变株CCTCCNo:M208168的传代稳定性进行了研究；其结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由此可以看出，以筛选到的A.faecalisWT10为出发菌株，结合紫外氯化锂复合诱变，等离子诱变以及紫外和光复活交替处理诱变方法，得到突变株CCTCCNo:M20S168，活力由53U/g提高到260U/g，且具有很好的传代稳定性。实施例2:1、含腈水解酶细胞的培养种子培养基终浓度组成醋酸铵10g/L，酵母膏6g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠lg/L，硫酸镁O.2g/L，溶剂为水。将CCTCCNo:M208168菌株接种至种子培养基，3(TC培养28h，得种子液。产酶发酵培养基终浓度组成醋酸铵12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠lg/L，硫酸镁0.2g/L，溶剂为水。种子液以6%(v/v)的接种量转接至优化后的发酵培养基中，15L发酵罐中装液量为8L。培养温度为30°C，转速为150rpm，通气量为0.4vvm，并且取样检测生物量和酶活力。结果见图2。可见，前9个小时内，菌体生长速度比较缓慢，之后进入指数生长期，菌体生长快速，至30h时，生物量达到最大，之后生物量基本保持不变。通过对酶活力的分析发现，酶活力随着菌体的生长逐渐增大，在20h时达到最大，生物量为2.64g/L，以R-扁桃腈为底物，腈水解酶的活力达到997U/L，之后酶活力呈下降趋势。2、腈水解酶在不同的pH条件下转化外消旋扁桃腈生产R-扁桃酸分别将10ml水溶液配成不同的pH值(4.9、5.3、6.2、6.9、7.7、8.3、8.6、9.1)，各自加入菌体和底物外消旋扁桃腈，使反应体系中菌体浓度(以湿重计)为5mg/ml，外消旋扁桃腈浓度为20mM，置于30°C，150r/min水浴摇床中反应2h，从而考察pH值对酶催化反应的影响。得到的结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>可见，在pH值较低的条件下，该菌的酶活力很低，随pH值的增大有所提高。pH值增至6.2时，酶催化能力较大提高，增大至8.3时，上升至最高。再增大pH值，酶催化能力则略有所下降。3、腈水解酶在不同温度下转化转化外消旋扁桃腈生产R-扁桃酸10ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)中，底物外消旋扁桃腈浓度分别为20mM，细胞浓度(以湿重计)为5mg/ml，分别置于20，30，40，50，60。C，150r/min水浴摇床中反应2h，分析反应液中的R-扁桃酸含量，结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>可见，较合适的转化温度为30-40°C。4J青水解酶在不同的底物浓度下转化外消旋扁桃腈生产R-扁桃酸10ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)中，加入不同量的外消旋扁桃腈，使底物浓度分别为10、20、30、40、50mM，含酶细胞浓度(以湿重计)为5mg/ml，置于30°C，150r/min水浴摇床中反应，每隔一段时间取样分析反应液中的R-扁桃酸含量，结果见图3。当底物浓度分别为10、20、30、40和50mM时，完全转化底物所需要的时间分别为60、150、300、420和540min。5、不同的腈水解酶浓度转化外消旋扁桃腈生产R-扁桃酸10ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)中，底物外消旋扁桃腈浓度分别为20mM，加入不同浓度的细胞菌体，使其浓度(以湿重计)分别为1，3，5，7，9mg/ml，置于3(TC，150r/min水浴摇床中反应2h，分析反应液中的R-扁桃酸含量，结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>随着腈水解酶浓度的增大，转化体系中R-扁桃酸的浓度逐渐升高，当腈水解酶浓度增加到大于5mg/ml时，转化体系中R-扁桃酸的浓度几乎不变。5mg/ml的腈水解酶浓度已经能够满足催化的需要。6、不同的腈水解酶浓度转化外消旋邻氯扁桃腈生产R-邻氯扁桃酸10ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)中，底物外消旋邻氯扁桃腈浓度分别为20mM，加入不同浓度的细胞菌体，使其浓度(以湿重计)分别为1，3，5，7，9mg/ml，置于3(TC，150r/min水浴摇床中反应2h，分析反应液中的R_邻氯扁桃酸含量，结果如下579R-邻氯扁桃酸浓度(mM)6.810.114.315.415.3可见，CCTCCNo:M208168不仅可以用于R_扁桃酸的生产，对于底物外邻氯扁桃腈也具有较高的催化活性，还可以用于R-邻氯扁桃酸的生产。权利要求生物催化法生产手性R-扁桃酸及其衍生物的方法，所述方法包括在以式(I)所示的外消旋扁桃腈化合物为底物、以粪产碱杆菌CCTCCNoM208168培养获得的腈水解酶为催化剂的反应体系中，于pH8.0～8.5、20～60℃下进行水解反应，得到相应式(II)所示的手性R-扁桃酸化合物式(I)、(II)中，R为H或卤素。F2009101544844C0000011.tif2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应体系中底物外消旋扁桃腈化合物的初始浓度为10100mmol/L。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应在pH8.08.5的水溶液或磷酸盐缓冲液中进行。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述腈水解酶来自粪产碱杆菌CCTCCNo:M208168培养获得的含酶细胞，每10ml反应体系添加所述含酶细胞湿重为1090mg。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含酶细胞由如下方法制备得到粪产碱杆菌CCTCCNo:M208168接种至适用于粪产碱杆菌的发酵培养基，在培养开始后06小时加入15g/L的诱导剂，于204(TC下培养2496小时，培养得到的发酵液经分离，得到所述含酶细胞；所述诱导剂为下列之一正丁腈、异丁腈、己内酰胺。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)粪产碱杆菌CCTCCNo:M208168接种至发酵培养基，于2040。C下培养2496小时，培养得到的发酵液经分离，得到所述含酶细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下醋酸铵12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠lg/L，硫酸镁0.2g/L，pH7.5，溶剂为水;(2)将底物外消旋扁桃腈或邻氯扁桃腈和步骤(1)含酶细胞加入至pH8.08.5的磷酸盐缓冲液中，底物初始浓度为1050mmol/L，含酶细胞加入量为15g/L，于2060°C下进行水解反应，制得R-扁桃酸或R-邻氯扁桃酸。全文摘要本发明提供了一种生物催化法生产R-扁桃酸及其衍生物R-邻氯扁桃酸的方法，所述方法包括在以式(I)所示的外消旋扁桃腈化合物为底物、以粪产碱杆菌CCTCCNoM208168培养获得的腈水解酶为催化剂的反应体系中，于pH8.0～8.5、20～60℃下进行水解反应，得到相应式(II)所示的手性R-扁桃酸及其衍生物本发明的有益效果主要体现在菌种腈水解酶活性高，菌体用量少，反应过程中废水产量少，污染少；反应条件温和、能耗低；成本低，转化率高、产率高，易于手性R-扁桃酸及R-邻氯扁桃酸的工业化生产。文档编号C12R1/05GK101701243SQ20091015448公开日2010年5月5日申请日期2009年11月2日优先权日2009年11月2日发明者徐赛珍,柳志强,沈寅初,薛亚平,郑裕国申请人:浙江工业大学