专利名称：一种家蚕微粒子病荧光pcr检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及家蚕微粒子病(Pebrine)病原微生物家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N. b)的检测方法，特别是涉及使用荧光PCR方法对家蚕微孢子虫进行快 速准确检测的方法，属于生物技术领域。本发明进一步涉及一种用于该病检测的试剂盒。
背景技术：
家蚕微粒子病(Pebrine)是蚕业生产的毁灭性疫病，引起该病害的病原微生物为 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis，简称N. b)。由于其特殊的经卵传染方式，对蚕业生产，尤 其是蚕种生产造成严重危害且长期得不到根治。法国、意大利等欧洲主要养蚕国家曾因该 病的暴发而导致蚕丝业蒙受重大损失，我国近几年每年因微粒子病而淘汰的各级原种达数 百万张之多，直接经济损失达数亿元之巨。该病害的广泛流行不但给蚕种的生产造成严重 的损失，而且极易导致丝茧育蚕茧质量的下降和蚕农的歉收，严重影响蚕丝产业链下游经 济的发展，甚至给社会带来不稳定因素。鉴于此，家蚕微粒子病始终是蚕丝业国家蚕病防治 和进出口检疫的难点和重点。家蚕微粒子病的病原是蚕微孢子虫，属原生动物界微孢子虫门、微孢子虫纲、微 孢子虫目、微孢子虫科、微孢子虫属。除了微孢子虫属，在家蚕体中还发现有变形孢子虫 属(Vai. rimorpha Pilly，1976 ；佐藤令一和渡部仁，1985)具褶孢子虫属(Pfeis hora Gurley, 1893 ；藤原公，1985)、泰罗汉孢子虫属(Thelohania hennegay，1892)(早坂昭二， 1985)、内网虫属(Beenel&Kennedy，1988)以及与N. b同属异种(田中茂男等，1972 ；万国富 等，1995)的微孢子虫等寄生。到目前为止，已发现上百种Nosema属的微孢子虫，它们大都 是鳞翅目昆虫的典型寄生虫。据检查发现，包括家蚕在内的大多数昆虫种类至少都受到一 种以上的微孢子虫寄生，且从昆虫的卵到成虫的每一阶段都可能被微孢子虫感染，微孢子 虫可在蚕、蛹、蛾体内寄生，并能经蚕卵遗传给下一代。该病在全国各蚕区不同季节都有不 同程度的发生，对种茧育和丝茧育都有影响，给农业生产带来巨大的损失。因此为了及早发 现和剔除病蚕，有效避免该病的蔓延和传播，建立一种针对家蚕微粒子病病原也即家蚕微 孢子虫的快速准确检测方法是非常必要的。综观家蚕微孢子虫检测技术发展史，其采用了肉眼鉴定、显微镜检查、血清学检测 和分子生物学检测等几种方法。1865 1870年，法国的Pasteur创立的通过母蛾镜检制 造无毒蚕种的方法为家蚕微粒子病的防治奠定了基础，后来发展到集团袋蛾和集团磨蛾镜 检。目前蚕业生产中一般采用光学显微镜(明视野，或位相差)的方法，对所检样本是否存 在病原微孢子虫进行确认，该技术在大规模生产中为控制家蚕微粒子病的流行起到重要作 用。但该技术存在一些缺陷，其一是速度和效率问题；其二是检测技术的特异性和灵敏度方 面的问题；其三是无法区别和鉴定不同微孢子虫的种和属；其四是很难实现早期检测。血 清学鉴别法具有特异性强、灵敏度高的特点，但是存在比较高的交叉反应与非特异性反应。随着分子生物技术的发展，蚕微粒子病的分子生物学检测技术也开展探索研究。 有学者曾用PCR技术，利用家蚕微孢子DNA的高度保守序列，设计引物，对蚕微孢子虫进行定性PCR检测；也有学者为了将家蚕微孢子虫(N.b)从蚕业生产中流行的多种病原微孢 子虫中鉴定出来，用PCR技术合成了一段317bp的DNA片段，将其克隆到大肠杆菌E. coli DH5a中，并大量制备该片段，用地高辛(DIG)标记成特异性检测探针，用于蚕业生产上对带 毒蚕蛾和蚕卵的模拟检测。该种方法是有一定的创新性，但这仅仅是一个尝试，尚有许多需 要完善的地方。因此建立一种快速、特异、灵敏、简便、实用的家蚕微粒子病的检测方法，对 提高家蚕微粒子病监控技术，加强检疫能力，保证进出口蚕种的安全，提升养蚕的产业水平 非常迫切，具有十分重要的现实意义。本发明的检测方法的依据是荧光定量PCR技术，它的原理是在常规PCR扩增系统 中加入一段与靶基因特异性互补的荧光探针。探针的5'端标记有报告基团，如FAM、VIC 等，3'端标记有荧光淬灭基团，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能 量被淬灭基团吸收，仪器检测不到荧光信号。当开始进行扩增时，随着PCR循环扩增的进 行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针就会将探针切断产生荧光信号。在整个 PCR过程中，就会连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。信号增强到某一阈值时的循 环次数(用循环阈值Ct表示)被记录下来。Ct值和PCR体系中起始模板的对数之间有着 严格的线性关系，利用阳性定量标准品扩增的Ct和标准曲线，再根据待测样品的Ct值就可 以确定出起始模板中某核酸的存在并对其进行定量。利用上述原理，我们发明了一种用于家蚕微粒子病的病原微生物微孢子虫检测的 荧光定量PCR方法，并研制了一种“家蚕微粒子病荧光定量PCR检测试剂盒”，实现了对蚕微 孢子虫的快速准确检测的目的。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得微孢 子虫检测的灵敏度和特异性得到很大程度的提高，并避免了漏检和误检。
发明内容
本发明提供了用于检测蚕微孢子虫(N.b)的方法，特别是提供了一种快速准确地 检测家蚕和蚕卵等样本中微孢子虫的荧光定量PCR方法。本发明进一步提供了用于该类微 孢子虫检测的试剂盒。本发明具体步骤包括(1)标本的选取(家蚕和蚕卵等样本)；(2)提取孢子虫 DNA (孢子虫发芽及其DNA提取)；(3)荧光定量PCR扩增法对样本进行检测；(4)扩增反应 结束后根据每个扩增反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中家蚕 微孢子虫的存在并根据阳性标准品对其标本中的微孢子虫进行定量。从Genbank检索家蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA(Nosema sp. smallsubunit ribosomal RNA, ssUrRNA)基因序列如下 AGACCCAAATATCAAGTAATTTAGATAATAATGAAAACATTGTAGAACCAAAATATGAGTTCTCTAATT GCACAATTTTGAAATCTAGTGCCATCGTTGCTGGTTCAACCGCTAAGGAAACCCGCAAGGATATAGGAAAGAAGAAA GGCCCAAGATCAAAACAGGTTGAAGAACTAGTCTTTACTTCTAACAAGTATGAACCCCTCATATAAGTTACATCCAT AAGAATGCCCAACAAAGAACACGAATTTGTCTTTGATGCAAGTGGTTTTCTTGAAACTAGTTCTGTCATGAATGAGT TGATGCAGTACACAACGATTGCCCAATCGTGCGAATCAACGACGCTGGAAGATAAGACGAAIACACTTACCGTCTAG GTCACATCTCAACCACCAAGAAAATAAGCTATTCTTTTGTCGATGAAGAAGCAACATGATTTTATGATACCATCAAA GTAGTTAAAAATTCACCAGTAACATCTCCATCATTTTGCAGCATATATGGCTGAAGGTTTTGGTATGAAGAGAACAT CTTTTCCACGTTCATACACATCTTAAATGTCACAAACCTTACCTAGTAAGCTCTTAAGACGAAACTTAAAGAGAAAGAIAAAAACGGAGACCACGTAGAATAAAAACTTTGCGTAAATGTTCAAAAAACTAGGTGGAGAGAATATTACTTACAA AGAATATTACAAGAATTTTCATCATCATTAAATGTAAGGATTCTTAATGTCAAGACCAAACATCGACGAAATGATTC GACAAATGATGGGTTGACTGTTCCCGTAAAGCCATCCATCGATAAGGACCAIATCTGAACAGT(SEQ ID NO. 1)。用生物信息学方法根据引物设计原则，并利用PRIMER EXPRESS设计软件，设计出 扩增该基因片段的特异性引物和荧光探针上游引物5，-AAGAATTTTCATCATCATT-3，(SEQID NO. 2)；下游引物5，-TCATTTGTCGAATCATTTCGT-3，(SEQID NO. 3)；荧光探针FAM-5，GGATTCTTAATGTCAAGACCAAAC3，-TAMRA(SEQ IDNO. 4)。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的荧光探针标记是指检测家蚕微孢子 虫小亚单位核糖体 RNA(Nosema sp. small subunit ribosomal RNA, ssUrRNA)基因的探针 的报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA。根据本发明的一个优选实施方案，为了完成本发明的分型检测方法首先采集标 本，适用标本类型有家蚕和蚕卵等。根据本发明的一个优选实施方案，为了完成本发明的检测方法，用检测上述标本 中家蚕微孢子虫基因的PCR扩增体系按照如下方式配制，5XFQ PCR buffer6ul
上游引物(IOuM)Iul
下游引物(IOuM)Iul
荧光探针(IOuM)0. 5ul
dNTPS(IOmM)Iul
Taq酶2ul
DNA4ul
ddH2014. 5ul_Total30. 0μ 1根据本发明的一个优选实施方案，上述用于检测微孢子虫的反应体系中的5XFQ PCR buffer 含以下成分250mM Tris-HCl (pH8. 0)、25mM MgC12、250mMKCl 以及 10%的DMSO寸。根据本发明的一个优选实施方案，上述PCR扩增体系中6ul 5XFQ PCRbuffer, Iul 上游引物(IOuM)Uul 下游引物(IOuM)、0.5ul 荧光探针(10uM)、lul dNTPS(IOmM)、 14. 5ul ddH20总计24ul，即为该体系的PCR MIX，可以批量配制，并同时配以扩增用的Taq
酶系，可满足大量检测的需要。本发明的另一个目的是提供一种用于快速检测蚕微孢子虫DNA的试剂盒，该试剂 盒包括核酸提取液、Taq酶系、Nb-PCR MIX、Nb_阳性质控品(1 X 107COpieS/ml)和阴性质控 品等。其中本试剂盒的一个组成部分“核酸提取液”是用来提取标本中的微孢子虫的DNA， 该提取液由 25mM Na0H、50mMTris-HCl (PH8. 0)、0· 1 % TritonX-100,0. 05mM EDTA(PH8. 0)组 成。根据本发明的一个优选实施方案，本试剂盒的的反应体系设置为30ul，具体配制 方法是上述PCR MIX24ul、Taq酶系2ul以及提取的DNA或者阳性质控品或者阴性质控品分别为4ul。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的阳性质控品是蚕微孢子虫小亚单位 核糖体 RNA(Nosema sp. small subunit ribosomal RNA, ssUr RNA)基因特异性扩增片段， 经过克隆连接到载体上，构成的重组质粒，经过绝对定量，其浓度为107COpieS/ml。ssUr RNA普通PCR的扩增结果见
图1。对阳性质控品进行梯度稀释，其扩增的动力学曲线和标准 曲线如图2和3。根据本发明的一个优选实施方案，稀释阳性质控品(107COpieS/ml)，浓度梯度为 每 mil. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、1. 0X103、1. 0X102、1. OX IO1Copies,进行灵敏度实验， 结果证实本试剂盒检测灵敏度为不低于1.0X102COpieS/ml，该荧光定量PCR的方法敏感 性和精确性均优于普通PCR方法。为了完成本发明的方法，取上述标本加入适量生理盐水研磨，勻浆液用纱网过滤， 收集滤液，以差速离心法(500rpm，离心2分钟，弃沉淀，然后上清液以5000rpm，10分钟离 心)弃上清。用适量生理盐水悬浮，得到Nb孢子粗提液。取0.5ml(浓度为IO8个/ml)微 孢子虫悬浮液，5000rmp，离心5分钟，去上清，保留孢子，同时加入0. 2mol/L KOH 0. 25ml, 充分混合，27°C诱导1小时后5000rpm，离心5分钟，去上清。用0. 5ml生理盐水重悬，25°C 放置30分钟。5000rpm，离心5分钟，沉淀加50 μ 1核酸提取液充分混勻(提取液用前需室 温溶解并充分混勻)，然后100°C沸水浴10分钟，13，OOOrpm离心3分钟，上清液即为提取的 微孢子虫DNA。DNA短时间可于4°C保存，长时间于_20°C保存。根据本发明的再一个优选实施方案，取上述配制的蚕微粒子病NB-PCR MIX反应 液(内含有扩增用的引物探针和各种反应成分等)、Taq酶系，室温融化并振荡混勻后， 10，OOOrpm离心10秒。每个检测反应体系配制如下表
权利要求
本发明为一种用荧光定量PCR技术检测家蚕微粒子病(Pebrine)的病原微生物家蚕微孢子虫(Nosema bombycis，N.b)的检测方法及其试剂盒，对家蚕、蚕卵等样本通过提取孢子虫DNA，然后用荧光定量PCR扩增法对样本进行检测，扩增反应结束后根据每个扩增反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中蚕微孢子虫的存在并根据阳性标准品对其进行定量。
2.根据权利要求1所述的一种检测家蚕微孢子虫的荧光定量PCR检测方法 及其试剂盒，特征在于检测的特异性基因为小亚单位核糖体RNA (Nosema sp. smal 1 subunitribosomal RNA，SSUrRNA)基因，设计的特异性引物和探针序列为上游引物5，-AAGAATTTTCATCATCATT-3，；下游引物5，-TCATTTGTCGAATCATTTCGT-3，；荧光探针FAM-5，GGATTCTTAATGTCAAGACCAAAC3，-TAMRA, FAM 为探针的报告基团， TAMRA为探针的淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的荧光PCR检测方法及其试剂盒，该试剂盒包括核酸提取液、 Taq酶系、Nb-PCR MIX、Nb_阳性质控品(1 X 107COpieS/ml)和阴性质控品等。其中“核酸提 取液”用以提取标本中的微孢子虫DNA，其成分由25mM NaOH、5OmMTris-HCl (PH8. 0)、0. 1% TritonX-100、0. 05mM EDTA(PH8. 0)组成；Nb-PCRMIX是蚕微孢子虫检测的扩增反应液，每 个检测的NB-PCR MIX 由 6ul 5XFQ PCRbuffer、Iul 上游引物(IOuM)、Iul 下游引物(IOuM)、 0. 5ul 荧光探针(IOuM) Uul dNTPs (IOmM)、14. 5ul ddH20 组成。其中 5XFQ PCR buffer 由 250mM Tris-HCl (pH8.0)、25mM MgC12、250mM KCl 以及 10%的 DMSO 等组成。
4.根据权利要求1所述的一种试剂盒其适用的荧光定量PCR扩增仪有ABIPRISM7700、 ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000、ABI PRISM 7300/7500、MJ Opticon 等，扩增条件为 930C- 2分钟，然后93°C 30秒一55°C 45秒，采集荧光信号，40个循环；LightCycler等使 用毛细管的仪器扩增条件为93°C— 2分钟，然后93°C 5秒一58°C 45秒，检测荧光信号，共 40个循环。
全文摘要
本发明提供了一种使用荧光定量PCR技术(PCR-荧光探针法)从家蚕和蚕卵等样本中检测引起家蚕微粒子病(Pebrine)的病原微生物家蚕微孢子虫(Nosema bombycis，N.b)的方法及其试剂盒。该方法包括(1)采集样本；(2)家蚕微孢子虫DNA的提取；(3)荧光定量PCR扩增法对样本进行检测；(4)扩增反应结束后根据反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中家蚕微孢子虫的存在，并能对其进行准确定量，实现了对家蚕微孢子虫的实时快速检测。
文档编号C12Q1/68GK101967512SQ20091015735
公开日2011年2月9日 申请日期2009年7月27日 优先权日2009年7月27日
发明者何永强, 刘健翊, 史成军, 帅江冰, 张晓峰, 徐贵峰, 王华雄, 鲁兴萌 申请人:浙江大学;北京索奥生物医药科技有限公司