建立系统性红斑狼疮oaz基因应用模型的方法

文档序号:575483阅读:294来源:国知局
专利名称:建立系统性红斑狼疮oaz基因应用模型的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种人类Olf-1/EBF相关锌指蛋白 (01f-l/EBF associated zinc finger protein, 0AZ),特别涉及建立系统性 红斑狼痴OAZ基因应用模型的方法。
背景技术
系统性红斑狼疳(systemic lupus erythematosus, SLE)是典型的非器官特 异性自身免疫病,以T、 B细胞异常活化产生大量自身抗体为特征,被认为是自身 免疫病的原型。目前该病的具体发病机制尚不清楚, 一般认为遗传因素在狼疮发 病过程中起重要作用。目前,治疗系统性红斑狼疮主要药物有激素和免疫抑制剂, 它们对人体免疫过程的多个环节均有明显的非特异性免疫抑制作用,从而暂时抑 制T、 B细胞异常活化来达到治疗的目的。但是,由于这些药物治疗系统性红斑狼 疮没有特异性,所以只能緩解病情,不能达到根治的目的。并且它们会产生严重 的毒副反应,甚至可能成为患者死亡的直接原因之一,因而在临床应用中受到一 定限制。
究其原因,主要是对该疾病的发病机理仍然不清楚,研究模式原始和简单, 没有一个从根本上对系统性红斑狼疮发病机制进行分析、选择和实验的生物模 型。

发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷,研制一种建立Olf-1/EBF相关锌指 蛋白基因的系统性红斑狼疮模型的方法。 本发明的技术方案是
建立系统性红斑狼疮OAZ基因应用模型的方法,其主要技术步骤在于 (1)采集并分离被测者外周血单个核细胞,提取RNA,逆转录为cDNA,加
入相应的引物,进行实时荧光定量PCR以分析OAZ基因的表达水平; (2 )用Spearman相关统计软件分析OAZ基因的表达量与系统性红斑狼疮疾 病活动相关性;(3)采集并分离患者外周血单个核细胞,用0AZ小干扰RNA在体外对培养细 胞进行干扰,然后分离细胞和上清液,从细胞中提取RNA,逆转录为cDNA, 用实时荧光定量PCR分析不同分组OAZ信号通路相关基因OAZ表达水平的 变化,ELISA法测定上清液中IFN-Y、 IL4、 ILIO、 IL12、 IL21、 CCL2、 ANA浓度;
(4 )将特异性选择OAZ基因位点作为药物干预靶点;
(5 )构成系统性红斑狼疮OAZ基因应用模型。
通过这个模型,研究人员可以发现系统性红斑狼疮患者OAZ基因功能存在 异常,即系统性红斑狼疮OAZ基因的表达量与SLE疾病易感性、活动性成正相关。 运用RNAi干扰技术可有效降低狼疱患者外周血单个核细胞中OAZ信号通路 相关基因表达,同时减低多种细胞因子及抗核抗体水平。因此,科研人员 就可以借助该模型,根据不同患者的个体差异进行特异性选择,作为药物干预 輩巴点,以选择适当的药物对该干预靶点进行干预治疗研究,从而大大提高疗效, 避免盲目用药给患者带来的强烈的副作用。
本发明的其它优越之处在下面将进一步进行阐述。


图1一一本发明实施例l基因cDNA引物序列示意图。
图2——本发明实施例ISLE患者与正常人OAZ基因mRNA表达示意图。
图3——本发明实施例l SLE患者与正常人OAZ基因mRNA表达图。
图4——本发明实施例1 SLE患者外周血OAZ基因表达与SLEDAI相关性示意图。
图5 — 一本发明实施例1 SLE患者外周血0AZ基因表达与与补体C3相关性示意图。
图6—一本发明实施例IOAZ基因表达与SLEDAI、肾脏损伤指数与补体C3 相关性图。
图7——本发明实施例l SLE患者外周血抗ds-DNA抗体阳性组与阴性组 OAZ基因mRNA表达示意图。
图8——本发明实施例1 SLE患者外周血ENA抗体阳性组与阴性组OAZ 基因mRNA表达示意图。
4图9——本发明实施例1外周血抗体阳性组与阴性组0AZ基因mRNA表 达图。
图10——本发明实施例2基因cDNA SiRNA和引物序列示意图。 图11——本发明实施例2 RNAi后0AZ基因mRNA表达示意图。
图12——本发明实施例2 RNAi后上清液细胞因子与ANA表达(X土S)示意图。
图13 — 一本发明实施例2干扰后0AZ基因raRNA表达水平与细胞因子水平相 关性示意图。
具体实施例方式
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。以下实施例仅用于说明 本发明而非用于限定本发明的范围。
本发明提供了建立系统性红斑狼疮0AZ基因应用模型的方法,该方法第 一步骤为采集并分离被测者外周血单个核细胞,提取RNA,逆转录为cDNA, 加入相应的引物,进行实时荧光定量PCR。在分析被检者的遗传背景和相关资 料的基础上,由于系统性红斑狼疮OAZ基因的表达水平显著增高,若被测者0AZ 基因的表达量越高,该被测者患系统性红斑狼疮的几率越大,即易感性就强。
本发明提供了建立系统性红斑狼疮0AZ基因应用模型的方法,该方法第 二步骤为釆集并分离被测者外周血单个核细胞,提取RNA,逆转录为cDNA, 加入相应的引物,进行实时荧光定量PCR。在分析患者临床资料的基础上,运 用Spearman相关软件分析患者OAZ基因的表达水平与SLE疾病活动的相关性。 由于系统性红斑狼掩OAZ基因的表达量与SLE疾病活动成正相关,若被测者0AZ 基因的表达量越高,该患者疾病活动性就越大。
本发明提供了建立系统性红斑狼疮0AZ基因应用模型的方法,该方法第 三步骤是在前二个步骤基因分析的基础上,釆集并分离患者外周血单个核细 胞,用OAZ小干扰RNA ( siRNA)在体外对培养细胞进行干扰。72小时后分离细胞 和上清液,从细胞中提取RNA,逆转录为cDNA,用实时荧光定量PCR分析不同分组 OAZ信号通路相关基因OAZ表达水平的变化,ELISA法测定上清液中IFN-y、 IL4、 ILIO、 IL12、 IL21、 CCL2、 ANA浓度,并分析这些因子分泌水平与0AZ基因 表达的相关性。由于0AZ siRNA可有效降低狼疮外周血单个核细胞中OAZ信号通路相关基因表达,同时减低多种细胞因子及抗核抗体水平,所以针对每 个患者,特异性选择这一位点,作为药物干预靶点。
该模型认为0AZ基因与SLE相关,因此这一位点可被用作系统性红斑狼痴易 感性与活动性的检测。更重要的是研究人员借助这一模型,根据不同患者的个体 差异进行特异性选择,因此该模型还可以提供药物干预的耙点。针对该位点筛选 出合适的药物使得OAZ基因的表达趋于正常,从而能有效下调SLE患者0AZ基因 的表达,最终下调ANA的分泌,为指导诊断与治疗SLE等自身免疫疾病及其它由 OAZ基因异常表达所引起的疾病提供了新思路。
本发明的说明书中使用了如下术语,它们的定义如下所迷
Olf-l/EBF相关锌指蛋白人类Olf-1/EBF相关锌指蛋白(OAZ)基因位于 16号染色体,通过精细定位研究已发现中国人群16q11.2区与SLE发病相关联, 而阳性微卫星标记D16s517位于OAZ基因内部。其基因结构中存在疾病相关的单 倍型,且优势传递单倍型可能与基因表达水平相关。
OAZ基因编码一种DNA结合多锌指蛋白,属于Kruppel样C2H2锌指蛋白家族, 其本身无转录活性,但通过锌指区域与信号蛋白结合,可提高后者结合DNA能力 从而增强輩巴基因转录,亦可以抑制信号蛋白与DNA的结合从而抑制转录。因此, 在信号转导中起着双向作用(Wrana几.Cell, 2000, 100:189-192 ) 。 OAZ可 调节早期B细胞因子(EBF)功能;EBF是一种组织特异性且具分化时期特异性 的DNA结合蛋白,参与前B细胞和B淋巴细胞特异的MBl基因调控)。
实时荧光定量PCR,其定义为在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧 光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定 量分析的方法。
肾脏损伤指数按照尿常规及24h尿蛋白指标累积计算血尿4分、脓 尿4分、管型尿4分、蛋白尿4分,分值最小0分,最高16分。
RNA抗体抗Sm抗体、RNP抗体、SSA抗体/ SSB抗体是一类针对RNA的 抗体,将其中 一项为阳性者作为RNA抗体阳性。
SLEDAI评分标准即把判断SLE活动的最具代表性的24种症状或表现予 相应评分癫痫;精神病变;器质性脑综合征;视力障碍;脑神经受损;狼疮性 头痛;脑血管以外;血管炎表现。以上为8分。关节炎;肌炎;管型尿;血尿;蛋白尿;脓尿。以上均为4分。皮渗;脱发;粘膜溃疡;胸膜炎;心包炎;低补 体血症;抗双链DNA效^介升高。以上均为2分。发热;血小板减少;白细胞减少。 以上均为1分。将患者10天内出现的各种阳性症状或表现的评分相加,总分相 加为该患者的SLEDAI。评分范围从0 - 105分。 一般认为,0-4为基本无活动, 5-9为轻度活动,10-14为中度活动,>15为重度活动。
Thl/ Th2细胞因子T细胞所分泌的细胞因子通常被分为两大类,Thl细胞 因子及Th2细胞因子,这两类细胞因子的作用不同。Thl细胞因子主要包括IL2、 IL12、 ifn-y因子,介导细胞免疫。Th2细胞因子主要分泌IL4、 ilio、 IL6因 子,介导体液免疫,促进B淋巴细胞活化,诱导ANA的产生。大部分研究显示 SLE是Th2细胞占优势的疾病。
CC趋化因子配体(CCL) 2: CCL2是趋化因子CC亚家族中的一员,人类CCL2 基因位于17号染色体,由76个氨基酸组成,可由多种细胞分泌,如成纤维细胞、 平滑肌细胞、人血管内皮细胞,其主要功能是趋化和激活单核细胞至炎症部位。 Accel卜SiRNA:目前脂质体转染试剂在siRM转染中被广泛使用,但问题亦随之 而来,脂质体对细胞有或多或少的毒性,而导致部分细胞死亡,进而影响研究人 员对实验结果的科学判断。更重要的是,适合运用脂质体进行转染的细胞种类很 有限,那么对于那些对脂质体转染方法具有抵抗性的细胞类型。Accel 1 siRM (美国赛默飞世尔公司提供)创新的化学修饰技术不用任何传统转染介质(比如 转染试剂、病毒载体和电转等)确保siRNA被细胞高效吸收,同时提高siRNA 的稳定性和特异性。首次克服了由于细胞转染问题所带来的基因沉默效率不佳的 障碍。
莒盼蓝拒染法测细胞活力正常的健康细胞能够排斥台盼蓝,而丧失细胞膜 完整性的细胞可以被台盼蓝染色。严格来说,台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整 性,通常认为细胞膜丧失完整性,即可认为细胞已经死亡。
以下实施例中使用的ABI Prism7500型高通量荧光定量PCR仪购自美国 Applied Biosystems公司,以SDS2. O(PE Biosys tem)软件分才斤其Ct值。
采用SPSS12. 0软件进行数据统计分析,数据以X士S表示。按患者与正常
人分组进行方差齐性分析和t检验。对患者SLEDAI积分与基因表达水平进 行回归分析,并以方差分析进行显著性检验。两组均数间的比较用Wilcoxon秩和抬r验,变量间的相关关系用Spearman相关分析,以P< 0. 05为差异 有统计学意义。
实施例1:系统性红斑狼瘙患者0AZ基因表达
根据建立系统性红斑狼痴0AZ基因应用模型的方法,可以检测系统性红斑 狼疮患者OAZ基因表达水平,分析OAZ基因的表达量与系统性红斑狼疮疾病活 动相关性。
1.1引物设计及合成才艮据NCBI网站GenBank查询人0AZ基因的mRNA序 歹寸,利用primer express 4欠寸牛^:计引物,由大连TaKaRa^^司合成(图l)。 1. 2 外周血细胞提耳又采集30例SLE患者和20例正常对照外周血。SLE患者, 其中男5例,女25例,年龄14 70岁,平均年龄为33. 54岁。所有患者均符 合1997年美国风湿病学会修定的SLE诊断标准,正常人对照20例,在年龄和 性别与实验组相匹配,均无风湿病史和风湿病家族史。安静状态下抽取静 脉全血2ml,以肝素抗凝,裂解红细胞后TRIzol抽提RNA,存放于-70°C。 1. 3 骨髓前体细胞提取在取得知情同意后,收集5例SLE患者(均为女性) 及5例健康亲属(男2例,女3例)骨髓标本,平均年龄分别为33. 2岁、37.6 岁。安静状态下抽取髂后上棘骨髓4ml,用lml浓度为100U/ml的肝素抗凝。 先加入人骨髓前体细胞预富集试剂RosetteSep (加拿大Stemcell公司) 200ul,再用等量磷酸緩冲液(PBS)混匀后,离心(常温1000r/min, 5min), 去除上清,PBS稀释至原骨髓两倍体积。骨髓稀释液与l. 077g/L Ficoll淋 巴细胞分离液按l: l的体积比,将骨髓沿试管壁緩緩加入淋巴细胞分离液 上层,离心(常温3000r/min, 20min)。用吸管插入中间单个核细胞(MNC) 层,轻轻吸出灰白色的MNC至另一离心管,加入PBS洗涤两次,离心去上清, 加入TRIzol (美国Invitrogen 7>司),-70。C冻存备用。
1. 4 总RNA抽提和cDNA逆转录在将收集的外周血有核细胞应用酚氯仿 法抽提TRIzol总RNA。将TRIzol提取液移入容积lml的环氧树脂(EP )管 中,加入200ul氯仿,离心(11440r/min, 15min )后取最上层清液400ul, 置于另一无RNA酶的无菌EP管中,加入500ul异丙醇,颠倒混匀,室温下 静置10min, 4°C离心(11440r/min, 15min )后去除上清液,加入75%乙醇 (用DEPC水)洗涤后弃上清,加入DEPC水调整RNA浓度在l|jg/|jl左右。
8用Superscript II逆4争录酵i式剂盒(美国Invi trogen乂^司)逆專争录为cDNA。 首先加RNA5)jl、寡聚脱氧胸苷酸铵盐d (oligodT) lpl 、 dNTP lpl混匀 离心后65 。C5min,快速置于冰上再加入FS缓冲液(5x )化l、 0. 1 mo1/ L DTT 2|jl、 RNA酶抑制剂l|jl、最后加入l|jl的M-MLV混匀离心后于PCR 叶义上37。C50 min, 70 °C15 min 。
1.5 实时荧光定量聚合酶链反应PCR反应体系总体积20pl,含SYBR Premix Ex TaqTM(2x,大连TaKaRa/^司)10|jl , ROX Reference Dye (—种萸光染 料,50 x) 0. 4jjl, cDNA2. O[jl, dH20 6.8[jl。各基因每个标本侮:3个复孔, 扩增条件采用两步法PCR扩增标准程序第一步(预变性),95。C 10 S 1 个循环;第二步(PCR反应)95°C 5 S、 60°C 34 S 45个循环。软件分析其 Ct值,计算各标本平均Ct值,以RPLPO作为内参,将OAZ Ct值减去RPLPO Ct 值作为ACt值。计算标准化后的2 —AAet值表示mRNA的相对表达含量。结果 见图2、图3。
从图2、图3可知,SLE患者骨髓前体细胞和外周血有核细胞OAZ基因 m R N A的表达水平明显高于正常对照组,差异有统计学意义。
1.6 0AZ基因表达与SLEMI、肾脏损伤指数、补体C3相关性分析结果见图4、 图5、图6。
从图4、图5、图6可知,SLE患者的骨髓前体细胞和外周血有核细胞OAZ tnRNA表达水平与SLEDAI积分、肾脏损伤指数呈显著的负相关,但与补体C3 呈显著的负相关。
1. 7 抗dsDM、 RNA抗体阳性组外周血有核细胞0AZ mRNA表达水平比较果 见从图7、图8、图9。
从图7、图8、图9可知,SLE患者抗dsDNA、 RNA抗体阳性组外周血 有核细胞OAZ mRNA表达水平高于抗dsDNA、 RNA抗体阴性组。
利用本模型,通过实时荧光定量聚合酶链反应(real time PCR),就可以 发现狼疮患者OAZ基因表达在骨髓前体细胞和外周血有核细胞中均显著升高,并 且其表达与抗双链DNA(dsDNA)和抗RNA抗体相关,说明OAZ信号通路异常与狼 疮中B淋巴细胞发育和抗体产生有关。
实施例2: s iRNA阻断0AZ信号通路对狼齊抗核抗体产生的影响根据本发明模型,可以运用RNA小干扰技术、实时焚光定量PCR、 ELISA 法分析干扰前后0AZ基因、细胞因子、抗核抗体表达水平的变化,特异性选择 药物千预靶点。
1.1 Accel1-SiRNA序列、基因扩增引物i殳计及合成阳性对照为SiRNA-GAPDH, 不针对任何基因的s iRNA序列(NC)作为阴性对照。4条0AZ基因s iRNA 、 一对阳性 与阴性对照siRNA序列均由美国Thermo Fisher公司设计并合成(图lO)。
1.2 PBMC提取5例SLE患者,均为女性,平均年龄为40. 4岁,于安静状态下抽 取静脉全血5-6ml,以肝素抗凝,用等量磷酸緩冲液(PBS)混匀后,外周血稀释 液与l, 077g/LFicoll淋巴细胞分离液按l: l的体积比,将外周血沿试管壁緩緩 加入淋巴细胞分离液上层,离心(常温^00r/min, 30min)。用吸管插入中间单 个核细胞(MNC)层,轻轻吸出灰白色的MNC至另一离心管,用PBS和专用培养基(美 国Thermo Fisher公司)各洗涂一次,离心去上清,力口lml专用培养基,混匀,取 一滴悬液沖血细胞计数板。
1.3 细胞计数和莒盼蓝拒染法测细胞活力以0. 4%台盼蓝染色溶液进行活细胞 染色和计数,分别取2滴细胞悬液加入1滴0, 4%台盼蓝溶液,充分混匀5min后, 镜检,活细胞不着色,而死亡细胞被染成蓝色。计数200个细胞,算出活细胞的 百分率。结果为细胞培养前活力分别为(97. 6±1. 45) %,培养后实验组、阳性 对照组、阴性对照组和空白对照组活力分别为(95. 3 ± 2. 16 ) %、 ( 94. 7 ± 1. 33 ) %、 (96. 4 ±1.52)°/。、 (96. 3 ±1. 75)°/。,不同分組间有差异未见明显差异(P>0. 05)。 1. 4 细胞培养及OAZ基因沉默分离出的PBMC用专用培养液重悬后,被分成实验 组、阳性、阴性与空白对照四组,每组设4-10个复孔,每孔2xl()S个细胞,实验 组、阳性、阴性对照组每孔加入100plsiRNA (lOOpM)混合液,空白对照组为培 养基对照組,加入100pl专用培养液,混匀,在37。C、饱和湿度和5。/。C02培养箱内, 孵育72小时。收集四组PBMC悬液,离心,上清液-2(TC保存,细胞加入TRIzol (美 国Invitrogen />司),—70。C冻存备用。
1. 5 总RNA抽提、cDNA逆转录和实时荧光定量聚合酶链反应具体步骤见实施例l, 结果见图ll。
从图ll可知干扰效率OAZ SiRNA干扰PBMC后,OAZ mRNA表达水平(据ACt 值计算)平均约是阴性对照的O. 203倍,即干扰效率平均为79. 7%,显然OAZ SiRNA为有效干扰片段,因此可以看到经干扰后PBMC的0AZ基因mRNA表达水平显著降低。 作为阳性对照的GAPDH组也可看到GAPDH基因经其有效的S iRNA干扰后其mRNA表达 水平显著下降到阴性对照的O. 125倍,干扰效率可达87. 5%。
从图ll还可知,实验组PBMC 0AZ基因mRNA的表达水平明显低于阴性对照 组,差异有统计学意义。
1. 6 细胞因子等检测按试剂盒要求步骤用酶联吸附(ELISA )法测定上清液中 干扰素(IFN)-y、白细胞介素(IL)4、 ILIO、 IL12、 IL21、 CC趋化因子配体 (CCL) 2 (试剂盒由美国R&D公司提供)、ANA浓度(试剂盒由德国欧蒙公司提 供)。结果结果见图12。
从图12还可知,实验组上清液IFN-y、 ILIO、 IL12、 IL21浓度,AM的0D值 均较阴性对照组显著降低;CCL2较阴性对照组显著增高,差异有统计学意义;IL4 与阴性对照组相比有降低趋势,但差异无统计学意义;阴性对照组与空白对照 组被测细胞因子的水平未见明显差异。
1. 6 干扰后0AZ基因mRNA表达水平与细胞因子水平相关性见图13。
从图13可知,虽然干扰后SLE患者的PBMC OAZ基因mRNA表达水平A ACt值与 Thl样细胞因子IFN-y 、 IL10与Th2样细胞因子IL4、 IL12浓度比(实验组阴性 对照组)无相关性,但是OAZ基因mRNA表达水平△厶Ct值与Thl/Th2比值呈显著的 正相关。OAZ基因mRNA表达水平厶ACt值与CCL2浓度比呈正相关,与ANAOD比值、 IL21浓度比呈负相关。
利用本模型,运用RNAi技术对SLE患者外周血单个核细胞(PBMC ) OAZ基 因进行阻断研究,发现OAZ SiRNA可有效降低狼疮外周血单个核细胞中OAZ信号 通路相关基因表达,且OAZ可通过Id耙基因影响细胞因子的水平而导致AM异 常表达,说明OAZ基因位点可作为特异性选择药物干预靶点。
本发明首次报道了建立系统性红斑狼疮OAZ基因应用模型的方法。科研工 作者可以利用该模型进一 步从分子水平阐明SLE的发生机制,明确OAZ基因在 SLE发生、发展过程中的作用,可为疾病预防、诊断、特异性治疗药物的分子设 计以及基因工程药物的开发奠定基础,也可为其它免疫病相关基因的研究提供基 本和可^f于的思路和方法。
权利要求
1.建立系统性红斑狼疮OAZ基因应用模型的方法,其步骤在于(1)采集并分离被测者外周血单个核细胞,提取RNA,逆转录为cDNA,加入相应的引物,进行实时荧光定量PCR以分析OAZ基因的表达量;(2)用Spearman相关统计软件分析OAZ基因的表达量与系统性红斑狼疮疾病活动相关性;(3)采集并分离患者外周血单个核细胞,用OAZ小干扰RNA在体外对培养细胞进行干扰,然后分离细胞和上清液,从细胞中提取RNA,逆转录为cDNA,用实时荧光定量PCR分析不同分组OAZ信号通路相关基因OAZ表达水平的变化,ELISA法测定上清液中IFN-γ、IL4、IL10、IL12、IL21、CCL2、ANA浓度;(4)将特异性选择OAZ基因位点作为药物干预靶点;(5)构成系统性红斑狼疮OAZ基因应用模型。
全文摘要
本发明涉及建立系统性红斑狼疮OAZ基因应用模型的方法。本发明通过采集被测者外周血单个核细胞,提取RNA,逆转录为cDNA,加入引物,进行实时荧光定量PCR以分析OAZ基因的表达水平,分析OAZ基因的表达量与系统性红斑狼疮疾病活动相关性,用OAZ小干扰RNA在体外对培养细胞进行干扰,测定上清液中IFN-γ、IL4、IL10、IL12、IL21、CCL2、ANA浓度,将特异性选择OAZ基因位点作为药物干预靶点,构成系统性红斑狼疮OAZ基因应用模型。本发明克服了对系统性红斑狼疮发病机制研究缺少分析、选择和实验的生物模型的缺陷。本发明可以发现系统性红斑狼疮OAZ基因的表达量与SLE疾病易感性、活动性成正相关,运用RNAi干扰技术,确定药物干预靶点,避免副作用。
文档编号C12Q1/68GK101629213SQ200910184790
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月21日 优先权日2009年8月21日
发明者冯学兵, 孙凌云, 李荣良, 静 黄 申请人:南京大学医学院附属鼓楼医院
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1