专利名称：：一种对香蕉镰刀菌枯萎病的抗病性进行快速鉴定的方法
技术领域：
：本发明涉及对香蕉镰刀菌枯萎病(Fusariumwilt)的抗病性进行快速鉴定的方法，尤其是在离体培养的条件下，通过改良培养基配方并且在生根培养阶段接种病原菌，快速而有效地筛选香蕉抗病种质资源和育种材料，提高香蕉抗枯萎病育种的效率。本发明属于农业一植物保护
技术领域：
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背景技术：
：香蕉镰刀菌枯蒌病(又称巴拿马病、黄叶病)是近年来威胁我国乃至全世界香蕉生产的主要病害之一。该病普遍被认为是有史以来最严重的毁灭性植物病害之一，它是由土壤真菌fkswf,考，ra附f.sp.cw6erae(E.F.Smith)Snyd.&HansCFoc)弓l起的。目前已确认了的4个生理小种，其中4号生理小种(race4)的毁灭性最大。现有的一些防治措施，例如化学防治、淹水休耕、轮作和使用有机物改良土壤等均不能有效地控制镰刀菌枯萎病。近年来，国内外关于香蕉枯萎病生物防治的研究主要集中在拮抗菌的筛选及其室内盆栽防治试验(Perez-vicente等，2003;Saravanan等，2003;Thangavelu等,2003;程亮等，2005;游春平等，2005;黄小光等，2006)，但真正可以应用到生产实际的并不多。目前普遍认为选育抗病品种是控制该病最有效的方法之一。而建立简便有效的抗性鉴定体系是进行香蕉枯萎病抗病育种的关键。由于香蕉镰刀菌枯萎病是一种土传病害，传统的ffl间鉴定法耍求有大面积发病较为均匀的地块，不仅费时费工，鉴定结果也容易受到环境条件的影响。目前普遍采用的苗期人工接种鉴定法主要分为2类盆栽系统(Matsumotoetal.,1995;林时迟等，2000;李敏惠等，2007;Weberetal.,2007;莫贱友等，2008;Smithetal.,2008)和水培系统(DeAscensaoandDubery,2000;Groenewaldetal.,2006;VandenBergetal.,2007)。接种方法通常采用伤根浸(淋)菌液、土壤或培养液接种菌液、用预先接种Foe的麦粒或高粱粒作为接种物等。至今尚未见报道有较大改进的其他抗性鉴定方法。
发明内容本发明的目的在于针对香蕉抗病育种的特点和现有技术的不足，提供一种新的香蕉镰刀菌枯萎病抗性鉴定体系。本发明是通过以下技术方案实现的-在香蕉离体快速繁殖的生根培养阶段，将巳经在生根培养基生长2-3周的试管苗转移至改良培养基(modifiedmediumforinteractionsystem,MIS)进行预培养，每个培养容器接种1株试管苗。MIS的组成包括NH4N03825mg/l、KN03950mg/l、MgS04'7H20185mg/l、KH2P0485mgA、CaCl22H20220mg/l、KI0.83mg/l、H3B036.2mg/l、MnS04-4H2022.3mg/l、ZnS04.7H208.60mg/l、Na2Mo04.2H200.25mg/l、CuS04.5H200.025mg/l、CoCl2-6H200.025mg/l、Na-EDTA37.26mg/l、FeS04'7H2027.80mg/1和6g/l琼脂。香蕉生根试管苗在MIS培养基生长1-2周后，选取株高4.5-5cm、植株上部展开叶片数^2、生根数3的小植株接种^Pbc。接种时，在超净工作台上打开培养容器的盖子，用镊子将预先浸泡在Foc孢子悬浮液(106个孢子/ml)中的无菌滤纸片(直径5mm)放置在MIS培养基表面距离小植株约1cm处。最后重新盖好培养容器的盖子，并将其放置在温度为25i2'C的组培室中观察发病情况。接种尸oc后24d，按照0-6级的病害评价等级对单株生根试管苗进行病害等级鉴定。其中0=小植株生长正常，无任何发病症状；1=假茎基部的小叶片枯萎，但假茎本身的颜色并未发生变化；2=假茎颜色变暗的区域小于或等于整个假茎高度的1/2;3=假茎颜色变暗的区域超过整个假茎高度的1/2;4=变黄或枯萎的上部叶片数小于或等于小植株上部总叶片数的1/2;5=变黄或枯萎的上部叶片数超过小植株上部总叶片数的1/2;6=整株试管苗枯萎死亡。本发明具有以下优点(1)现有的香蕉栽培品种绝大多数是3倍体，3倍体之间无论自花或异花授粉均得不到种子；3倍体(母本)与2倍体(父本)杂交也只限于某些品种，且只有少量种子。因此，目前香蕉枯萎病抗病育种的重点研究领域是离体选择(Matsumoto等，1995,1999;Bhagwat和Duncan,1998^1998b;Smkh等，1993，2006;刘海瑞等，2007;胡玉林等，2008)、遗传转化(Remy等，1998;裴新梧等，2005a,2005b)和原生质体融合等(Matsumoto等,2002)。上述研究均是以香蕉的细胞、组织培养作为基础；而大部分盆栽系统和水培系统所需的植物材料是株高15cm左右的假植苗；鉴于此，本发明提供的鉴定方法能与目前的香蕉抗病育种研究更紧密地衔接起来。(2)无论盆栽系统还是水培系统，抗病性鉴定一般是在温室大棚中进行的；而本发明的鉴定体系是在组培室中观察发病情况。已有的观察和研究表明，病原菌Foc的活动受到温度等环境因素的影响(刘绍钦等，2001)。由于培养室的环境条件较温室大棚稳定得多，加之本发明的鉴定体系本身是一个完全封闭的系统，使得鉴定结果的重复性和可靠性得到保证。(3)盆栽系统和水培系统分别要在接种Foc后7-8周和6周才能进行病害鉴定，而本发明提供的鉴定方法只需3-4周。具体实施例方式以巴西、GCTCV-119、Formosana、农科1号、广粉1号和东莞大焦等6个品种为实验材料。将上述品种由吸芽茎尖外植体产生的不定芽接种至生根培养基1/2MS+1.0mg/1NAA+0.2mg/1IBA+30g/1蔗糖+2g/1活性炭+6g/1琼脂。生根培养2-3周后，将叶片开始展开的生根试管苗转移至MIS进行预培养，以150ml三角瓶作为培养容器，每瓶接种1株试管苗。上述品种的生根试管苗在MIS培养基生长l-2周后，选取株高4.5-5cm、植株上部展开叶片数22、生根数^3的小植株接种Foc。接种时，在超净工作台上打开三角瓶的封口膜，用镊子将预先浸泡在Foerace4的孢子悬浮液(106个孢子/ml)中的无菌滤纸片(直径5mm)放置在MIS培养基表面距离小植株约1cm处。最后重新盖上封口膜，并将其放置在温度为25±2°C的组培室中观察发病情况。每个品种5个处理，每个处理重复3次。接种Foe后24d，按照0-6级的病害评价等级对单株生根试管苗进行病害等级鉴定。其中0级一小植株生长正常，无任何发病症状；1级一假茎基部的小叶片枯萎，但假茎本身的颜色并未发生变化；2级一假茎颜色变暗的区域小于或等于整个假茎高度的1/2;3级一假茎颜色变暗的区域超过整个假茎高度的1/2;4级一变黄或枯萎的上部叶片数小于或等于小植株上部总叶片数的1/2;5级一变黄或枯萎的上部叶片数超过小植株上部总叶片数的1/2;6级一整株试管苗枯蒌死亡。鉴定结果下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注表中同列数值后不同字母表示差异达到显著水平/^0.05。由上表可知，供试6个品种的平均病害等级与田间病害评价的结果一致，证明应用本发明提供的鉴定方法能够快速、准确地区分香蕉镰刀菌枯萎病的感病品种和抗病品种。权利要求1、一种对香蕉镰刀菌枯萎病的抗病性进行快速鉴定的方法，其特征在于1)在香蕉离体快速繁殖的生根培养阶段，将已经在生根培养基生长2-3周的试管苗转移至改良培养基MIS进行预培养，每个培养容器接种1株试管苗；2)MIS的组成包括NH4NO3825mg/l、KNO3950mg/l、MgSO4·7H2O185mg/l、KH2PO485mg/l、CaCl2·2H2O220mg/l、KI0.83mg/l、H3BO36.2mg/l、MnSO4·4H2O22.3mg/l、ZnSO4·7H2O8.60mg/l、Na2MoO4·2H2O0.25mg/l、CuSO4·5H2O0.025mg/l、CoCl2·6H2O0.025mg/l、Na·EDTA37.26mg/l、FeSO4·7H2O27.80mg/l和6g/l琼脂；3)香蕉生根试管苗在MIS预培养1-2周后，选取株高4.5-5cm、植株上部展开叶片数≥2、生根数≥3的小植株接种病原菌Foc；4)接种时，在超净工作台上打开培养容器的盖子，用镊子将预先浸泡在Foc孢子悬浮液(106个孢子/ml)中的无菌滤纸片(直径5mm)放置在MIS培养基表面距离小植株约1cm处。最后重新盖好培养容器的盖子，并将其放置在温度为25±2℃的组培室中观察发病情况；5)接种Foc后24d，按照0-6级的病害评价等级对单株生根试管苗进行病害等级鉴定。其中0级-小植株生长正常，无任何发病症状；1级-假茎基部的小叶片枯萎，但假茎本身的颜色并未发生变化；2级-假茎颜色变暗的区域小于或等于整个假茎高度的1/2；3级-假茎颜色变暗的区域超过整个假茎高度的1/2；4级-变黄或枯萎的上部叶片数小于或等于小植株上部总叶片数的1/2；5级-变黄或枯萎的上部叶片数超过小植株上部总叶片数的1/2；6级-整株试管苗枯萎死亡。全文摘要本发明涉及对香蕉镰刀菌枯萎病(Fusariumwilt)的抗病性进行快速鉴定的方法，属于农业—植物保护
技术领域：
。本发明是在香蕉离体快速繁殖的生根培养阶段，将已经在生根培养基生长2-3周的试管苗转移至改良培养基MIS预培养1-2周后，选取株高4.5-5cm、植株上部展开叶片数≥2、生根数≥3的小植株在超净工作台上接种病原菌Fusariumoxysporumf.sp.cubense(Foc)，接种后将培养容器放置在温度为25±2℃的组培室中观察发病情况。接种Foc后24d，按照0-6级的病害评价等级对单株生根试管苗进行病害等级鉴定。和目前普遍采用的盆栽系统和水培系统相比，本发明提供的鉴定方法不仅能与目前的香蕉抗病育种研究更紧密地衔接起来，而且还具有准确、快速的特点。文档编号C12Q1/18GK101643772SQ20091019217公开日2010年2月10日申请日期2009年9月9日优先权日2009年9月9日发明者吴元立,彭新湘,易干军申请人:广东省农业科学院果树研究所