专利名称：：高通量病毒快速培养鉴定的方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，具体涉及高通量病毒快速培养鉴定的方法及其应用，用于临床病毒快速培养与鉴定。
背景技术：
：病毒性传染病是当今人类感染性疾病中的主要疾病。新近资料显示，近30年新发现的传染病中，已明确病原体的疾病中约有60%是由病毒引起的，而呼吸道疾病中约有50%由病毒引起，其中的典例就是SARS冠状病毒和高致病性禽流感病毒。包括禽流感和SARS在内的许多突发性呼吸系统传染病在临床上多以发热或重症肺炎的形式出现，需要依赖于病原学检查才能做出明确诊断。这些疾病的病死率高，除了病毒本身具有高致病性外，诊断延误亦是一个重要原因。呼吸疾病严重威胁人们身体健康，在我国加强呼吸系统传染病的研究，尤其是临床病原诊断学的研究，已经成为社会发展面临的一种迫切要求。传染病的确定诊断依赖于病原学检查，当前该领域的重点之一是建立快速而敏感的病原学诊断方法。病原学诊断方法包括电镜、组织病理学和细胞病理学检查、免疫荧光和免疫化学染色、常规细胞培养方法、PCR分子检测方法、血清学检查等方法。其中，电镜适用于一些难以培养的或者迄今尚不能培养的病毒，但电镜检查所需仪器昂贵、需要专门的技术人员，且敏感性和特异性不高。通常标本中病毒含量要高达每毫升105_106，才会被电镜有效地检出。组织病理学和细胞病理学检查方法中，多数病毒感染造成的细胞学改变只能帮助诊断到科的水平，或仅能提示有病毒感染存在。尽管直接免疫荧光检查快速，但其漏检率较高，不能及时发现新现病毒。临床病毒的分离培养及其鉴定需要以哺乳动物的细胞培养为基础，而常规的细胞培养操作繁琐，接种数量少，培养时间长、工作量大、试剂消耗量大。这直接阻碍了临床病毒诊断的发展，导致我国病毒实验诊断落后于世界上主要国家。常规病毒分离作为一种实验诊断手段，但对于有些病毒目前还没有适当的培养方法，还有的因培养时间过长而失去其早期诊断价值，或者方法过于繁琐而不宜常规使用。分子检测方法敏感性高，但可能造成假阳性结果；不适用于未知病毒的检测；不能知道病毒的死活；不能获得活的病毒。近年来，一些营利和非营利性机构在免疫学和分子诊断技术方面做了不少研究和开发，这些都是必要的。但是，作为〃金标准〃的病毒分离培养却由于技术较为复杂、见效比较慢、要求投入比较高，而没有受到应有的重视。这种本末倒置的现象需要加以扭转。病毒分离培养是唯一能够获得活病毒的方法，这不仅对临床疾病的明确诊断有极为重要的价值，而且对开展病毒的后续研究如病毒的遗传与变异的研究、致病机理的探索、药物敏感性的检测、相应疫苗的研发等等都是不可缺少的前提条件。同时在国外，病毒培养也一直是新研发的免疫学和分子病毒诊断方法赖以比较与评价的基础。
发明内容为克服上述技术缺陷，本发明的目的是提供一种高通量病毒快速培养鉴定法，以改变常规病毒培养诊断速度慢，操作繁琐的现状，可以广泛应用于临床病毒实验室、公共卫生实验室、卫生监督机构对相关标本的病毒分离培养以及鉴定。为实现上述目的，采用如下的技术方案本发明的一种高通量病毒快速培养鉴定的方法为在培养板上接种细胞，将待培养鉴定的标本接种到所述细胞后离心，然后进行培养，最后将培养所得的待鉴定细胞液滴加到多孔玻璃片上进行免疫荧光检测。优选的，所述离心的转速为2500-4000转/分钟，离心的时间为30-90分钟，离心的温度保持为25-37°C。细胞采用原代或传代细胞，在显微镜下呈均匀的单层贴壁细胞。原代细胞中正常地存在着不同类型的细胞，而传代细胞株则为均一的细胞类型，细胞活力良好，没有老化、重叠、局部缺失等现象。细胞优选为狗肾细胞、原代恒河猴肾细胞、正常人胚肺成纤维细胞株、人鼻咽癌细胞株、人肺腺癌细胞株、恒河猴肾细胞株、非洲绿猴肾上皮细胞株、人结肠癌细胞、呼吸道病毒检测混合细胞、横纹肌肉瘤细胞和以上述细胞为基础作基因改造后的敏感细胞中的至少一种，即所用的细胞可以是一种类型的细胞，也可以是几种类型的细胞混合物。临床病毒分离常用细胞或细胞株见表l所示。表1英文缩写中文名称RHMK原代恒河猴肾细胞MRC-5正常人胚肺成纤维细胞抹HEp-2人鼻咽癌细胞抹A549人肺腺癌细力包才朱LLC-MK2恒河猴肾细胞林VERO-E6非洲绿猴肾上皮细胞林CACO-2人结肠癌细胞R-MIX呼吸道病毒检测混合细胞RD18S横紋肌肉瘤细胞细胞本身不含任何内源性病毒，对每批细胞产品做PCR和免疫荧光法检查，确定细胞中没有病毒存在，结果阴性方可使用。细胞产品无支原体污染，支原体污染是细胞培养中比较常见的现象，特别是实验室内的传代细胞株。为了保证细胞对临床各种待检病毒的敏感性和稳定性。每批细胞产品做PCR和免疫荧光法检查，确定细胞中没有支原体存在，结果阴性方可使用。所有细胞在荧光显微镜下，在350-600nm波长范围内都不存在自发荧光。细胞在实验室传代过程中都有可能发生遗传性状的改变，因此任何一种细胞都不可能无限制传代而始终保持其对病毒的敏感性不变。除了对每一批细胞都要抽样用标准病毒株予以考核以外，可以参考美国标准，对供临床病毒检验用的传代细胞的最高传代数做出如表2所述的规定。表2列出了供临床病毒诊断用细胞株的最高允许传代数。表2细胞抹最高传代数(次)MDCK130MRC-527HEp-2390A549100VERO-E6150采用本发明的方法，不同细胞的接种浓度具体见表3，可以适用于各种多孔细胞板。表3病毒每文感的宿主细月包接种浓度(个/mL)副济u感病毒、^f烏肺病毒LLC-MK24.5x104呼吸道合胞病毒、腺病毒HEp-2腺病毒A5492.0xl05流感病毒MDCK5.5xl04冠状病毒、偏肺病毒VERO-E6、CACO-21.0xl05肠道病毒、疱渗病毒MRC-5、RD18S5.0x105流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒R-MIX2.0xl05采用本发明所述的方法对病毒细胞进行培养鉴定的条件及时间见表4。表4病毒培养环境离心后培养天数不离心培养天数甲型流感病毒35°C，5%C02,2pg/mL的TPCK胰酶2-33-7乙型流感病毒副流感病毒呼吸道合胞病毒35°C，5%C02,2|ag/mL的TPCK胰酶35°C,5%C02,2pg/mL的TPCK胰酶35°C,5%C022-34-72-73-75-73-7腺病毒35°C,5%C022-72-12偏肺病毒35°C，5%C025-128-14肠道病毒35°C,5%C022-73-8冠状病毒35°C,5%C022-53-7所述多孔玻璃片包括玻璃片和带孔的胶片，所述带孔的胶片与所述玻璃片紧密相连。所述免疫荧光检测所需要的荧光标记抗体的用量为8-101。本发明的高通量病毒快速培养鉴定的方法可以鉴定DNA病毒，也可以鉴定RNA病毒；优选的，可鉴定的病毒包括副流感病毒、偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒、冠状病毒、肠道病毒和疱疹病毒。与现有技术相比，本发明的高通量病毒快速培养鉴定法检测通量高，标本处理时间减少，工作量减少不同种类的细胞接种到同一块多孔板上，如为96孔板，每块板可同时接种11份标本，每份标本同时检测7种病毒。本发明利用改进的高通量标本接种方法，通过离心操作，促使病毒进入细胞，既縮短病毒培养时间，又增加检测的敏感性。每种病毒试剂用量少，只需微量免疫荧光试剂即可判断结果，大大减少试剂消耗量。此方法改变常规病毒培养诊断速度慢，操作繁琐的现状，可以广泛应用于临床病毒实验室、公共卫生实验室、卫生监督机构对相关标本的病毒分离培养以及鉴定。图1是利用本发明检测临床样本后，病毒感染敏感细胞的免疫荧光染色图2是本发明中用到的多孔玻璃片的示意图。具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1:利用本发明的方法对1327份临床样品进行检测本实施例中用到的细胞株如下MDCK细胞(中科院上海细胞库)，LLC_MK2(中科院上海细胞库)、HEp-2细胞(中科院上海细胞库)，RD18S细胞(中科院上海细胞库)，MRC-5(美国ATCC)，其它细胞来源于本实验室培养保存的细胞。本实施例中用到的标本来源于广州医学院第一附属医院和广东省中医院于2009年1-9月份发热门诊采集成人流感样患者的咽拭子标本，共1327份。(1)细胞选择细胞采用原代或传代细胞，在显微镜下呈均匀的单层贴壁细胞。原代细胞中正常地存在着不同类型的细胞，而传代细胞株则为均一的细胞类型，细胞活力良好，没有老化、重叠、局部缺失等现象。细胞本身不含任何内源性病毒对每批细胞产品做PCR和免疫荧光法检查，确定细胞中没有病毒存在，结果阴性方可使用。细胞产品无支原体污染支原体污染是细胞培养中比较常见的现象，特别是实验室内的传代细胞株。为了保证细胞对临床各种待检病毒的敏感性和稳定性。每批细胞产品做PCR和免疫荧光法检查，确定细胞中没有支原体存在，结果阴性方可使用。所有细胞在荧光显微镜下，在350-600nm波长范围内都不存在自发荧光。细胞在实验室传代过程中都有可能发生遗传性状的改变，因此任何一种细胞都不可能无限制传代而始终保持其对病毒的敏感性不变。除了对每一批细胞都要抽样用标准病毒株予以考核以外，我们参考美国标准，对供临床病毒检验用的传代细胞的最高传代数按表2所列出的数据规定，其它细胞按常规进行传代培养。表2细胞林最高传代数(次)MDCK130MRC-527HEp-2390A549100VER0隱E61502、细胞培养多孔板准备(以接种96孔板为例)在细胞培养瓶中准备好的单层贴壁细胞(生长比率85-95%);(2)吸弃生长液；(2)以5ml1XPBS(磷酸缓冲液)轻柔的清洗细胞面，然后弃去；(3)加入1.5ml0.25%胰酶，置37。C反应2-3min;(4)用10ml含10%MEM(含10%胎牛血清的细胞培养基)重悬，反复吹打15次，充分混匀，并用牛鲍计数板或细胞计数仪进行细胞计数；(5)各种细胞按照表3的浓度接种于96孔细胞板，O.lmL/孔；按照不同的实验要求，多孔板中接种的细胞组合见下表，每种细胞接种2-3行；(6)37°C，5%C02孵育3天即可长满单层。不同细胞的接种浓度按表3数据来进行。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3、标本处理(3)震荡标本(振荡30-60秒)；(2)弃去拭子；(3)4°C，离心3000转/分钟，10分钟;(4)设立阴性对照孔，和阳性对照孔(用标准病毒株或新近鉴定的临床分离株)；(5)按照不同的实验要求每份标本上清液接种于相应敏感的宿主细胞，每孔0.lmL，每种细胞三个复孔；(6)26。C，离心3000转/分钟，60分钟;(7)加入病毒培养基；按照不同实验要求，不同病毒在不同温度下培养天数不同(详见表4)。表4培养环境离心后不离心培养天数培养天数甲型流感病毒35°C，5%C02,2iug/mL的TPCK胰酶2-33-7乙型流感病毒35。C,5%C02,2|ug/mL的TPCK胰酶2-33-7副流感病毒35°C,5%C02，2ng/mL的TPCK胰酶4-75-7呼吸道合胞病毒35°C,5%C022-73-7腺病毒35°C,5%C022-72-12偏肺病毒35°C,5%C025-128-14肠道病毒35°C,5%C022-73-8冠状病毒35°C,5%C022-53-74、标本接种取长满单层细胞，弃去培养液，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗2遍，每份标本分别接种于上述4种细胞(0.ImL/孔)。经室温3000rpm离心60min后，加入病毒维持培养液，置34°C、5%C02饱和湿度培养箱中培养。5、病毒鉴定(1)吸取孔中培养液到冻存管中暂存(其中可能含有活的病毒)；(2)用PBS洗细胞面一次；(3)每孔加入50iiLPBS，反复吹打细胞面，使细胞脱落；(4)取15yL细胞悬液至多孔玻璃片，每种病毒一个孔，待干；(5)将玻璃片浸泡于冻丙酮中20-30分钟，待干；(6)用PBS轻柔地洗玻璃片1次，待干；(7)每孔加入相应荧光标记抗体8-10iiL;(8)放湿盒置37t:温箱中孵育30分钟；(9)用PBS洗3次，待干；(10)在多孔玻璃片上滴加封片液后用盖玻片封闭；封片液主要是甘油和磷酸缓冲液；(11)置荧光显微镜下观察；结果判定标准为显示苹果绿荧光的细胞为阳性细胞，阴性细胞无荧光。病原体对照玻片有分别含阳性对照细胞和阴性对照细胞的点样孔。在检测的1327份样本中，病毒培养阳性一共556份，总阳性率为42%。其中甲型流感病毒381株(381/1327，28.7%)，乙型流感病毒143株(143/1327，10.7%)，副流感病毒10株(10/1327,0.75%)，腺病毒5株(5/1327,0.37%)，疱疹病毒4株(4/1327,0.3%)，呼吸道合胞病毒2株(2/1327,0.15%)，肠道病毒2株(2/1327,0.15%)，暂未分离到偏肺病毒和冠状病毒，见表5。表5为广州地区2009年1-9月ILI(流感样疾病)病例的病毒构成情况。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中，部分病毒感染敏感细胞的免疫荧光染色图可见图l，图l显示了病毒感染敏感细胞的免疫荧光染色图。由图l可见，病毒感染的阳性细胞经免疫荧光染色后呈现苹果绿荧光；其中，图1A显示InfA感染的MDCK细胞(免疫荧光染色，X200)，图IB显示RSV感染HEp-2细胞(免疫荧光染色，X100)，图1C显示ADV感染HEp-2细胞(免疫荧光染色，X100)。图2为本发明中用到的多孔玻璃片，多孔玻璃片包括玻璃片1和带孔的胶片2，带孔的胶片2与玻璃片1紧贴在一起，形成孔，可以将带检测的试剂滴加进去，进行显色检测。将上述标本上清液接种于相应敏感的宿主细胞后，当离心的转速选择为2500转/分，离心的时间选择为90分钟，培养的温度选择为25t:时或离心的转速选择为4000转/分，离心的时间选择为30分钟，培养的温度选择为37t:时，得到与上述结果相同的结论。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。权利要求高通量病毒快速培养鉴定的方法，其特征在于，在培养板上接种细胞，将待培养鉴定的标本接种到所述细胞后离心，然后进行培养，最后将培养所得的待鉴定细胞液滴加到多孔玻璃片上进行免疫荧光检测。2.根据权利要求1所述的高通量病毒快速培养鉴定的方法，其特征在于，所述离心的转速为2500-4000转/分钟，所述离心的时间为30-90分钟，所述离心的温度为25-37°C。3.根据权利要求1所述的高通量病毒快速培养鉴定的方法，其特征在于，所述细胞包括狗肾细胞、原代恒河猴肾细胞、正常人胚肺成纤维细胞株、人鼻咽癌细胞株、人肺腺癌细胞株、恒河猴肾细胞株、非洲绿猴肾上皮细胞株、人结肠癌细胞、呼吸道病毒检测混合细胞、横纹肌肉瘤细胞和以上述细胞为基础作基因改造后的敏感细胞中的至少一种。4.根据权利要求1所述的高通量病毒快速培养鉴定的方法，其特征在于，所述多孔玻璃片包括玻璃片和带孔的胶片，所述带孔的胶片与所述玻璃片紧密相连。5.根据权利要求1所述的高通量病毒快速培养鉴定的方法，其特征在于，所述免疫荧光检测所需要的荧光标记抗体的用量为8-10iU。6.根据权利要求1所述的高通量病毒快速培养鉴定的方法，其特征在于，所述病毒为DNA病毒。7.根据权利要求1所述的高通量病毒快速培养鉴定的方法，其特征在于，所述病毒为RNA病毒。8.根据权利要求1所述的高通量病毒快速培养鉴定的方法，其特征在于，所述病毒包括副流感病毒、偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒、冠状病毒、肠道病毒和疱疹病毒中的至少一种。9.权利要求l-8之一所述的高通量病毒快速培养鉴定的方法在病毒鉴定方面的应用。全文摘要本发明提供了一种高通量病毒快速培养鉴定的方法，在培养板上接种细胞，将待培养鉴定的标本接种到所述细胞后离心，然后进行培养，最后将培养所得的待鉴定细胞液滴加到多孔玻璃片上进行免疫荧光检测。离心的转速为2500-4000转/分钟，时间为30-90分钟，温度为25-37℃。多孔玻璃片包括玻璃片和带孔的胶片，带孔的胶片与所述玻璃片紧密相连。本发明的高通量病毒快速培养鉴定法检测通量高，标本处理时间减少，病毒培养时间缩短，检测敏感性增加，病毒试剂用量少，可以广泛应用于临床病毒实验室、公共卫生实验室、卫生监督机构对相关标本的病毒分离培养以及鉴定。文档编号C12N7/00GK101693887SQ20091019318公开日2010年4月14日申请日期2009年10月20日优先权日2009年10月20日发明者关文达,占扬清,招穗珊,杨子峰,王玉涛,秦笙,莫自耀,钟南山,黄群娣申请人:广州医学院第一附属医院;呼吸疾病国家重点实验室;