专利名称：一种来源于极端嗜热菌的耐高温gus基因及其表达的制作方法
技术领域：
本发明属微生物技术领域，具体涉及一种来源于极端嗜热菌的耐高温GUS基因及 其表达。
背景技术：
细菌广泛分布于土壤和水中，或者与其他生物共生，是自然界中分布最广、个体数 量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。按细菌生存温度分类，可分为喜冷、常 温和喜高温三类，也有部分种类分布在极端的环境中，例如温泉，甚至是放射性废弃物中， 它们被归类为嗜极生物，其中最著名的种类之一是海栖热袍菌(Thermotoga maritima)，于 意大利的一座海底火山中发现。由于其蛋白质热稳定性高，代谢速率快、重要代谢产物能够 迅速再合成，因此有着广阔的开发应用前景。⑶S基因存在于一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是 一个水解酶，以葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由 于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调 控的研究中。根据GUS基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法组织化学法、 分光光度法和荧光法(灵敏度为荧光法最高)。GUS荧光分析法分析时以4-甲基伞形酮 酰-β -D-葡萄糖醛酸苷 G-methylumbelliferyl-β -D-glucuronide，简称4-MUG)为底物， ⑶S酶催化其水解为4-甲基伞形酮G-methylumbelliferone，简称4-MU)及β-D-葡萄糖 醛酸。4-MU分子中的羟基解离后在365nm的光激发下产生455nm的荧光。荧光分光光度计 测定的是相对值，因此用荧光分光光度计测定时必须用标准物4-MU进行校准。⑶S基因是在生物工程领域有着广泛应用的报告基因。Jefferson首次将⑶S基因 作为报告基因用于植物的遗传转化，表达GUS转基因的细胞在GUS底物5-溴-4-氯-3-吲 哚-β-葡糖苷酸脂(X-Gluc)存在下，显示蓝色。对被子植物和裸子植物在内的52种植 物内源GUS活性检测，显示多种植物在营养阶段并不存在内源GUS活性，但大多数植物的 果实、种皮、胚乳和胚中却有明显的GUS活性。随着种子的萌发，GUS基因的活性逐渐消失。 Vancannetyt等根据真核生物具有原核生物不具有的内含子剪切特性的原理，向GUS基因 中引入了一段植物内含子，在农杆菌中没有检测到明显的GUS活性。含有内含子的GUS基 因能够消除来自农杆菌的假阳性，但是没有消除植物本身的本底。转基因检测中由于其不 可避免的假阳性，影响了植物转基因检测的准确性和大规模的开展。利用来源于一种极端 嗜热菌的耐高温GUS基因，可以通过高温处理消除本底，提高检测的准确性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于极端嗜热菌的耐高温GUS基因 及其表达，以弥补现有技术的缺陷。本发明的技术方案如下—种来源于极端嗜热菌的耐高温GUS基因，是根据细菌偏爱密码子优化而得，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。所述GUS基因是TmGUSI基因，它是通过PTDS方法得到Xiong AS, Yao QH, Peng RH, Li X, Fan HQ, Cheng ZM, Li Y(2004)A simple, rapid, high-fidelity and cost-effective PCR—based two-step DNA synthesis method forlong gene sequence. Nucleic Acids. Res 32，e98。该方法共设计21对引物用于基因的合成。在50μ 1反应体系中，内侧引物 (Ρ2-Ρ41)的添加量为10ng，外侧引物(PI, P42)添加量为lOOng，扩增条件为94°C预热 IOmin ;94°C，30s ;54°C，30s ;72°C，40s ;35 个循环；最后 72°C延伸 IOmin0 使用的 Taq DNA 聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司日本)扩增目的基因。PCR产物用琼脂糖胶回收，所 得PCR产物经琼脂糖凝胶回收后，克隆到大连宝生物工程有限公司的pMD-18-Simple T载 体上进行克隆鉴定和序列测定。将上述鉴定正确的TmGUSI基因的阳性克隆用Bam H I和I酶切后，连入 相同酶切的载体pET48a(NEB公司)，得到重组质粒pET-TmGUSI，并将其转化大肠杆菌 (Escherichia coli)BL21 (DE3) (Novagen公司)，将转化子涂布在LB固体培养基中培养 24h0用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrapHP (Amersham Biosciences公司)对其进行蛋白表 达纯化，SDS-PAGE电泳检测。经SDS-PAGE电泳检测，本发明的TmGUSI基因能在大肠杆菌中成功表达，其表达蛋 白大小约65kDa。实验表明该蛋白最适温度为65°C，并在85°C条件下仍有69%的活性。 热稳定性实验表明该蛋白在80°C处理30min后，仍有100%活性；在85°C处理30min后， 活性有所下降，但仍可达到89%。有益效果本发明合成了来源于极端嗜热菌并根据细菌偏爱密码子优化的耐高温GUS基因， 即TmGUSI基因，并成功在大肠杆菌中表达。本发明的基因表现出耐高温的特性，在生物工 程领域有着广泛的应用前景。
图1为本发明的TmGUSI基因的PCR扩增电泳图，其中1为DNAMarker，2为从大 肠杆菌扩增的对照组，3为本发明的TmGUSI基因。图2为本发明的TmGUSI基因在大肠杆菌中的表达，其中1为该基因在大肠杆菌 中的蛋白表达产物，2为蛋白Marker。图3为温度对本发明的TmGUSI基因酶活性的影响。图4为本发明的TmGUSI基因酶的热稳定性。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a由上海市农业科学院生物技术研究所植物基 因工程研究室保存。克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、连接酶、dNTP、10XPCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。ABI PRIAM Bio-DyeTerminator DNA测序试剂盒购 自美国应用系统公司。下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行(Sambook J，Frets E F， Mannsdes T et al. In :Molecular Cloning. 2nd ed.Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)。实施例1密码子优化TmGUSI基因的合成本发明基因合成采取PTDS方法，共设计21对引物用于基因的合成。引物两端分别 引入Bam H I和Mc I的酶切位点，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成(http:// www. sangon, com/)。在50 μ 1反应体系中，内侧引物(Ρ2-Ρ41)的添加量为10ng，外侧引物(P1,P42)添 加量为 lOOng，扩增条件为:94°C预热 IOmin ；94°C，30s ；54°C,30s ；72°C，40s ；35个循环；最 后72°C延伸lOmin。使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司日本)扩增目 的基因。(所得基因的电泳图参见图1)。PCR结束后，琼脂糖胶回收，取10 μ 1直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物 公司)。4°C连接过夜，高效转化DH5ci感受态中。获得阳性克隆。鉴定正确的阳性克隆进 行测序，测序正确者-20°C保存待用。所用的PCR引物如下Pl :AGA, GGA, TCC, ATG, GTC, AGA, CCA, CAG, AGA, AAC, AAG, AAG, AGA, TTC, ATC, CTG, ATC，CTG，AAC，GGT，GTC，TGG，AACP2 :AGG, GAC, AGC, GAT，AGG, TCT，GTC, CTT，GGA, AGT，GAC, CTC, CAA, GTT，CCA, GAC, ACC，GTT，CAG，GATP3 :GAC,AGA，CCT，ATC，GCT，GTC，CCT，GGC，TCT，TGG，AAC，GAA，CAG，TAT，CAA，GAC， CTC，TGT，TAT，GAGP4 :AGG, GAC, ATA, GAA, AGT，AGT，CTT，GTA, GGT，GAA, TGG，ACC, CTC, CTC, ATA, ACA, GAG，GTC，TTG，ATAΡ5 :AAG, ACT, ACT, TTC, TAT，GTC, CCT，AAG, GAA, CTC, AGT，CAG, AAG, CAT, ATC, AGA, CTG，TAC，TTC，GCAP6 CTC，ACC，ATT，CAG，GAA，GAC，TTC，ACA，GTC，AGT,GTT,GAC,AGC，TGC，GAA，GTA， CAG，TCT，GAT，ATGP7 :GAA,GTC，TTC，CTG，AAT，GGT，GAG，AAG，GTT，GGT，GAG，AAC，CAC，ATC，GAG，TAC， CTG，CCA，TTC，GAGP8 CTC，ATT，CTC，ACC，ACT，CTT，GAC，CTT，ACC，AGT,AAC,GTC,AAC,CTC,GAA,TGG， CAG，GTA，CTC，GATP9 :GTC,AAG，AGT，GGT，GAG，AAT，GAG，TTG，AGA，GTC，GTC，GTC，GAA，AAC，AGA，CTC， AAG，GTT，GGT，GGCPlO :AAC, AGT, ATG, AGT, ACC, AGA, ATC, TGG, AAC, TTT, GCT, TGG, GAA, GCC, ACC, AAC，CTT，GAG，TCT，GTTPll :GAT, TCT, GGT，ACT, CAT, ACT, GTT，GGC，TTC，TTC，GGT，TCC，TTT，CCA，CCA，GCC，AAC，TTT，GAC，TTCP12 :CTC, GAT, GAG, GAC，TGG，TCT， AAA, GTT，GGC，TGG，TGGP13 :ATC, AGA, CCA, GTC, CTC, ATC, GAC，ATC，TGG，GTT，GATP14 :GAC, CTT, ACC, CAA, CTT, CTT, CCA，GAT，GTC，CAA，GATP15 :GAG, AAG, AAG，TTG，GGT，AAG， GAA，GCT，GTT，GGT，CAAP16 :GAT, CTT, CTT，CTC，CTC，TTC， AAC，AGC，TTC，CTC，ACTP17 :GGT, GAA, GAG, GAG, AAG，AAG， GGT，GAG，TTC，ATC，TTGP18 :CAA, GTA, AGG，GTC，CTC，CAA， GAA，CTC，ACC，TTC，GACP19 :TCC, TTG, GAG，GAC，CCT，TAC， AAG，GAT，GAA，TAC，ACCP20 :CTT, TTC，ATC，CCA，AGA，GAT， TTC，ATC，CTT，CTC，CAAP21 :ACC, ATC, TCT, TGG, GAT, GAA, GTC，TTC，CTG，AAA, GGCP22 :ACC, TTG, ACC, CAA, GAC, AGG, CAG, GAA, GAC, TGG, CTTP23 :TTT, CCT, GTC, TTG, GGT, CAA, GAC, TTC, AAT, CTC, TTGΡ24 :GTA, GTG, GGA, GGT, TCT, GAA, ATT，GAA，GTC，CTT，GATΡ25 :TCC, TTC, AGA, ACC, TCC, CAC, TTG，GCT，GAC，AGA，TTGΡ26 :ΑΑΤ, TCC, GAC, ATG, TGG, AGC, GTC，AGC，CAA，GTC，CAAΡ27 :GAA, GCT, CCA, CAT, GTC, GGA, ACC，CAG，AAG，ATC，GCTP28 :GTT, CTT，ATG，TCT，GTC，GAT， CTT，CTG，GGT，TTC，TGGP29 :ATG, ATC, GAC, AGA, CAT, AAG, GTT，GCT，AAT，GAG，CCTP30 :TGC, CTT，GAA，GAA，GCC，TTC， ATT，AGC，AAC，GGA，CCA
GAT，GAT，GCC，TCC，ATA，AGG，AAA, GAA，GTC， GAG，TTT，ACC，GAT，CAT, GCT，AGA，ATC，TTG， CTC，TGG，TTC，GGA，TTC，GGA，AGT，ATC，AAC， GTC，AAG，GTC，AAG，ATC，GAA，GTT，AGT，GAG， ACC，CAA，CTT，GAT，GGT，CAT, CTC，TTG，ACC， ATC，AGA，ACC，AGT，AAC，AGA，TTC，GTC，GAA， GGA，CCA，GAA，TCT，AGC，ATT，CTC，CAA，GAT， TTG，TAC，CCA，TTG，AAA, GTC，GAG，TTG，GAG， GGT，TCT，GAT，GCC，AAT，GTC，CAA，GGT，GTA， AAG，AGA，TTG，TAC，CTC，AAT，GGC，AAG，CCA， AAA, CTC，TTC，ATG，TTT，ACC，GAA，GCC，TTT， GGT，ACT, TTC，TAT，CCT，CTT，ATG，ATC，AAG， GGA，GTT，GGC，ATT，GAT，CCA，TTT，CAA，GAG， TAC，CCA，TAC，TCC，GAA，GAA，TGG，TTG，GAC， TTC，ATC，AAT，GAC，CAA，GAT，GCC，CAA，TCT， ATT，ACC，AGA，TAC，CAC，TAC，AAC，CCA，GAA， CAT, TCT，TCT，GAT，GTT，ATC，CTC，AGC，GAT， AAC，CAC，CCA，TCC，GTC，ATC，ATG，TGG，TCC， AGC，ATC，AGG，GTG，ATT，GCT，TTC，AGG，CTC，
P31 :GCT, GAA，GGC，TTC，TTC，AAG，GCA，TTG，TAC，GAA，ACT, GCC，AAC，GAG，ATG， GAC，AGA，ACC，AGA，CCTP32 :TCT, TTC, ATC, AGG, AGC, ATC, CAT, CAT, AGA, GAC, CAT, AAC, GAC, AGG, TCT, GGT, TCT, GTC, CAT, CTCP33 :ATG, GAT, GCT, CCT, GAT, GAA, AGA, ACC, AGA, GAT, GTT, GCT, CTC, AAG, TAC, TTC，GAC，ATT，GTC，TGTP34 :TCT, GCC，TTG，GTA，GAT，GTA，CCA，ACC，ATA，GTA，TCT，GTT，GAC，ACA，GAC， AAT，GTC，GAA，GTA，CTTP35 :TGG, TAC, ATC, TAC, CAA, GGC, AGA, ATC, GAG, GAG, GGT, CTT, CAG, GCA, TTG, GAG, AAG，GAC，ATC，GAGP36 :GGT, AAC，GAA，GAT，TGG，CTT，TCT，GTG，TCT，GGC，ATA，CAA，CTC，CTC，GAT， GTC, CTT, CTC, CAA, TGCP37 :AGA, AAG, CCA, ATC, TTC, GTT, ACC, GAG, TTT, GGT, GCT, GAT, GCT, ATC, GCA, GGT，ATC，CAT, TAT，GACP38 :CAG, TTC，AGC，CTG，GTA，CTC，CTC，ACT, GAA，CAT, CTG，TGG，AGG，GTC，ATA， ATG，GAT，ACC，TGC，GATP39 :GAG, GAG, TAC，CAG，GCT，GAA，CTG，GTC，GAG, AAA, ACC，ATC，AGA，CTG，CTG， CTG，AAG，AAG，GAC，TACP40 :TTT, GAA, GTC, AGC, GAA, AGC, CCA, GAC, ATG, GGT, GCC, AAT, GAT, GTA, GTC, CTT，CTT，CAG，CAG，CAGP41 :TGG, GCT，TTC，GCT，GAC，TTC，AAA, ACC，CCA，CAG，AAC，GTC，AGA，AGA，CCA， ATC，CTG，AAT，CAC，AAAP42 :AGA,GAG,CTC,TTA,GAC,TTC,GGA, CCA,GAG,TCT，TCT，GAG, GAC, GTG, TGC, GAC, CAA，CTT，AGG，CTG，TCT，ATC，TCT，GGT，AAA, GAC，GCC，TTT，GTG，ATT，CAG，GAT，TGG，TCT本发明的按细菌偏爱密码子优化合成的TmGUSI基因的序列开放阅读框为1692 个碱基，不包含保护碱基和酶切位点。通过在美国国立生物技术信息中心进行同源性检索 (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)，结果发现本发明的基因序列与原基因序 列(GenBank Accession No. AE000512)同源性为73%，编码563个氨基酸。具体对照如下Query 1ATGGTCAGAOCACAGAGAMCMGMGAGATTCATOCTGATOCTGMOGGTGTCTGGMC 60Illll Illll II ιιιιιιιιιιιιιιιι Il Il III Illl Il Il IIISbjct 1077230 ATGGTMGAOOGCMOGAAACMGMGAGATrTATTCrTATCrTGMTGGAGTTTGGMT 1077171Query 61 TTGGAGGTCACTTOCMGGACAGAOCTATOGCTGTOOCTGGCTCTTGGMOGMCAGTAT 120ι π Il Il III ΝΙΝΙ III Il III III Il IIISbjct 1077170 CTTGMGTMOQ\GCMAGAQ\GMMTOGCOGTKrrGGMGCrGGMTGAGQ\GmC 1077111Query 121 CMGAOCTCIUrTATGAGGAGGGTOCATTCAOCTACMGACTACTTTCTATGTOOCTMG 180Il Il Il Il Il Il Il Il Il lllllllll Il Il III Il Il IlSbjct 1077110 CAGGAIOGTGCrAOGMGMGGAOOCrTCAOCrACMAAOCAOCrTCrAOGTTOOGMG 1077051Query 181 GMCTCAGTCAGMGCATATCAGACTGTACTTOGCAGCTGTCMCACTGACTGTGMGTC 240IN Il Il Il Illlll III Il Il Il III III Il Il
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实施例2
TmGUSI基因在大肠杆菌中的表达
实施例1鉴定正确的TmGUSI基因的阳性克隆用Bam H I和Mc I酶切后，连入 相同酶切的载体pET48a(NEB公司)，得到重组质粒pET-TmGUSI，并将其转化大肠杆菌 BL21 (DE3) (Novagen公司)，将转化子涂布在LB固体培养基中培养Mh。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP (AmershamBiosciences公司)对其进行蛋白表达纯化，SDS-PAGE电泳 检测。经SDS-PAGE电泳检测，蛋白大小约65kDa，与预测值相符(参见图2)。蛋白浓度 卞艮Bradford 力夕去1||胃。Smith P. K, Krohn R. I，Hermanson G. Τ, Mallia Α. K, Gartner F. H, Provenzano Μ. D, Fujimoto Ε. K, Goeke N. Μ, OlsonB. J, Klenk D. C, Measurement of protein using bicinchoninic acid, AnalBiochem. 150(1985)76-85.]实施例3TmGUSI基因在大肠杆菌中的表达产物的酶活测定一、β -葡萄糖苷酸酶酶活力测定酶活测定采用荧光分析法，具体实施方法如下取800倍稀释的酶液10μ 1，加入2mmol/L 4-MUG抽提buf f er 90μ1，置37°C水浴 反应lh，然后加入900 μ 1 0. 2Μ的Na2C03终止反应。用DNA Quan200荧光光度计(Hoffer 公司)测定反应液中生成的4-MU的浓度。根据标准曲线还算成MU的产率。再根据已测定的总蛋白浓度换算成单位时间单位蛋白的⑶S比活力(nmol MU mg-lprotein min-1)。二、TmGUSI耐高温特性的测定最适反应温度在不同温度O0-80°C )下进行酶促反应，然后按照荧光分析法测 定酶的活性。结果表明，该蛋白最适温度为65°C，并在85°C条件下仍有69%的活性(参见 图3)。热稳定性将酶液在不同温度(60_80°C )下处理30min，然后加入底物，在37°C进 行酶促反应，荧光分析法测定酶的活性。结果表明，该蛋白在80°C处理30min后，仍有100% 活性；在85°C处理30min后，活性有所下降，但仍可达到89% (参见图4)。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围中。附本发明所涉及的核苷酸/氨基酸序列表<110>上海市农业科学院<120>—种来源于极端嗜热菌的耐高温⑶S基因及其表达<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>SEQ ID No 1<211>1692<212>DNA<213> 海栖热袍菌(Thermotoga maritima)1ATGGT CAGAC CACAG AGAAA CAAGA AGAGA TTCATCCTGATCCTGAACGGTGTCTGGAAC
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601GGTCAAGAGATGACCATCAAGTTGGGTGAAGAGGAGAAGAAGATCAGAACCAGTA ACAGA
661TTOGTOGAAGGTGAGTTCATCTTGGAGAATGCTAGATTCTGGTCCTTGGAGGACC CTTAC
721TTGTACCCATTGAAAGTOGAGTTGGAGAAGGATGAATACACCTTGGACATTGGCA TCAGA
781ACCATCTCTTGGGATGAAAAGAGATTGTACCTCAATGGCAAGCCAGTCTTCCTGA AAGGC
841TTOGGTAAACATGAAGAGTTTCCTGTCTTGGGTCAAGGTACTTTC TATCCTCTTA TGATC
901AAGGACTTCAATCTCTTGAAATGGATCAATGCCAACTCCTTCAGAACCTCCCACT ACCCA
961TACTCOGAAGAATGGTTGGACTTGGCTGACAGATTGGGCATCTTGGTCATTGATG AAGCT
1021CCACATGTCGGAATTACCAGATACCACTACAACCCAGAAACCCAGAAGATCGCTG AGGAT
1081AACATCAGAAGAATGATOGACAGACATAAGAACCACCCATCOGTCATCATGTGGT COGTT
1141GCTAATGAGCCTGAAAGCAATCACCCTGATGCTGAAGGCTTCTTCAAGGCATTGT AOGAA
1201ACTGCCAACGAGATGGACAGAACCAGACCTGTCGT TATGGTCTCTATGATGGATG CTCCT
1261GATGAAAGAACCAGAGATGTTGCTCTCAAGTACTT CGACATTGTCTGTGTCAACA GATAC
1321TATGGTTGGTACATCTACCAAGGCAGAATCGAGGA GGGTCTTCAGGCATTGGAGA AGGAC
1381ATOGAGGAGTTGTATGCCAGACACAGAAAGCCAAT CTTOGTTACCGAGTTTGGTG CTGAT
1441GCTATOGCAGGTATCCATTATGACC CTCCACAGAT GTTCAGTGAGGAGTACCAGG CTGAA
1501CTGGTOGAGAAAACCATCAGACTGCTGCTGAAGAA GGACTACATCATTGGCACCC ATGTC
1561TGGGCTTTCGCTGACTTCAAAACCCCACAGAACGT CAGAAGACCAATCCTGAATC ACAAA
1621GGOGTCTTTACCAGAGATAGACAGCCTAAGTTGGT CGCACAOGTCCTCAGAAGAC TCTGG
1681TCCGA AGTCT AA
<210>SEQ ID No 2
<211>563
<212>PRT
<213> ^ (Thermotoga maritima)
1 MET Val Arg RroGln Arg Asn Lys Lys Arg Phe lieLeu lie LeuAsn Gly Val Trp Asn
21 Leu GluVal HirSer Lys Asp Arg Rro lie Ala ValRro Gly SerTrp Asn Glu Gln Tyr
41 Gln Aspiu CysTyr Glu GluGly Rro Phe Thr TyrLys Thr ThrPhe Tyr Val Rro Lys
61 Glu LeuSer GlnLys His lieArg Leu Tyr Phe AlaAla Val AsnThr Asp Cys Glu Val
81 Phe Leu Asn GlyGlu Lys ValGly Glu Asn His lieGlu Tyr LeuRro Phe Glu Val Asp
101 Val HirSly LysVal Lys SerGly Glu Asn Glu LeuArg Val ValVal Glu Asn Arg Leu
121 Lys ValSly GlyPhe Pro SerLys Val Rro Asp SerGly Thr HisHir Val Gly Phe Phe
141 Gly Ser Phe RroRro Ala AsnPhe Asp Phe Phe RroTyr Gly Glylie lie Arg Rro Val
161 Leu IleSlu PheThr Asp HisAla Arg lie Leu Asplie Trp ValAsp Thr Ser Glu Ser
181 Glu Rroalu LysLys Leu GlyLys Val Lys Val Lyslie Glu ValSer Glu Glu Ala Val
201Gly GlnGluMET HirlieLys LeuGlyGlu GluGluLysLyslieArgHirSerAsnArg
221Phe ValGluGly GluPhelie LeuGluAsn AlaArgPheTrpSerLeuGluAspRroTyr
241Leu TyrRroLeu LysValGlu LeuGluLys AspGluTyrIhrLeuAsplieGlylieArg
261Hir IleSerTrp AspGluLys ArgLeuTyr LeuAsnGlyLysRroValPheLeuLysGly
281Phe Gly LysHisGluGluPhe ProValLeu GlyGlnGlyHirPheTyrRroLeuMETlie
301Lys AspPheAsnLeuLeuLys TrplieAsn AlaAsnSerPheArgHirSerHisTyrRro
321Tyr SerGluGluTrpLeuAsp LeuAlaAsp ArgLeuGlylieLeuVallieAspGluAla
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361Asn IleArg ArgMETlieAsp ArgHisLysAsnHisRroSerVallieMETTrpSerVal
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401Hir AlaAsnGluMETAsp Arg ThrArgRroValValMETValSerMETMETAspAlaRro
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541Gly ValPheHirArg Asp Arg Gln Rro LysLeuValAlaHisValLeuArg ArgLeuTrp
561Ser Glu Val-k -k-k
1权利要求
1.一种来源于极端嗜热菌的耐高温GUS基因，其特征在于，所述基因是根据细菌偏爱 密码子优化而得，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。
2.根据权利要求1所述的来源于极端嗜热菌的耐高温GUS基因，其特征在于，其编码的 蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。
3.根据权利要求1所述的来源于极端嗜热菌的耐高温GUS基因，其特征在于，所述基因 是TmGUSI基因。
4.权利要求1至3任一项所述的来源于极端嗜热菌的耐高温⑶S基因在大肠杆菌 Escherichia coli DH5 α 表达中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种来源于极端嗜热菌的耐高温GUS基因及其表达，所述GUS基因是根据细菌偏爱密码子优化而得，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。所述GUS基因是TmGUSI基因，采用PTDS方法人工合成。本发明的GUS基因能在大肠杆菌中成功表达，并具有耐高温的特性，在生物工程领域有着广泛的应用前景。
文档编号C12N15/70GK102108367SQ20091020067
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 彭日荷, 熊爱生, 田永生, 许晶, 赵伟, 高峰 申请人:上海市农业科学院