专利名称：一种优化的三苯甲烷还原酶基因及其表达和应用的制作方法
技术领域：
本发明属植物修复领域，具体涉及一种优化的三苯甲烷还原酶基因及其表达和应用。
背景技术：
三苯甲烷类染料(Triphenylmethane dyes)是一类多苯环化合物，它是继偶氮类、 蒽醌类染料之后使用的第三大染料，在纺织印染、食品、医药、造纸、化装品、皮革处理等工 业及生物组织染色中被广泛地应用。此类染料及中间降解产物具有潜在的毒害和致突变作 用，有很强的致畸、致癌、致突变作用。在生产、使用过程中产生大量废水，此类废水颜色深， 生物降解难，严重污染环境。三苯甲烷类染料化合物及中间代谢物随着生产、运输、使用等环节进入到环境中。 据调查，目前全世界染料年产量约为8 9X105吨，染料种类多达100000多种，在染料的 使用过程中大约有10% 20%由于工艺效率问题被直接排放到污水处理系统或环境中， 造成环境污染。三苯甲烷类染料本身以及在自然环境中降解中间产物对水生生物和人类产 生毒害作用，如食品工业中常用于抑制真菌的龙胆紫被证实能抑制有丝分裂，而碱性绿的 中间产物苯胺具有“三致作用”。按照传统的染料分类标准，三苯甲烷类染料主要分为以下三大类(1)碱性染料， 如结晶紫、甲基紫、碱性品红、碱性艳蓝B0、碱性艳蓝B等；( 酸性染料，如酸性紫4BNS、酸 性湖蓝A、甲基蓝、酸性绿B等；⑶弱酸性染料，如柴林艳蓝6B、弱酸艳蓝FFR等。治理多苯环化合物染料污染主要有物理修复、化学修复和生物修复。同其它有机 污染物相比，多苯环化合物染料大多被排污到水域环境中且比较稳定。从废水处理角度，由 于染料行业具有品种多、产量小、工艺流程长、产品更新快等特点，因而染料工业废水成分 复杂，利用传统的物理化学方法很难去除。近年来，生物修复技术为三苯甲烷类染料的降解 提供了新的途径。自20世纪70年代筛选出能降解结晶紫染料的细菌以来，人们一直在从 各个角度研究微生物对三苯甲烷类的降解，包括高效降解微生物的筛选和分离、降解途径、 生物反应器的设计以及环境修复等等。但是，相对于偶氮染料而言，关于三苯甲烷类染料生 物降解文献报道还较少。因此，这为传统的生物处理工艺提出了严峻的挑战。生物修复通常是指利用各种生物(包括微生物，动物和植物)的特性，吸收、降解、 转化环境中的污染物，使受污染的环境得到改善的治理技术。一般分为植物修复、动物修 复和微生物修复三种类型。生物修复的基础是自然界中微生物对污染物的生物代谢作用， 因此早期的生物修复主要指微生物修复。由于三苯甲烷类染料是多苯环的芳香化合物，难 以被常规的微生物降解脱色，对此人们研究通过生物强化技术来促进其降解，主要体现在 (1)筛选高效的微生物或酶；(2)优化外界温度、PH值、底物浓度和营养物质等条件；(3)寻 找对微生物代谢中难降解物有促进作用的共代谢物质，以刺激微生物生长或提高其活力。人们通过筛选得到了一些能高效降解三苯甲烷类染料的微生物，主要有细菌和白 腐菌。^tome等筛选到菌种I^seudomonas seudomonallei 13NA对结晶紫和甲基紫能够进行降解褪色。早在1995年，ksilada 0等报道了白腐菌能快速降解结晶紫。一些研究也 指出白腐菌在有氧条件下降解多种人工合成的染料，最终将它们矿化成CO2和H2O,在环境 中有益，因此，近年来越来越受到重视。到目前为止，三苯甲烷类染料还能通过酵母、海藻和 真菌等降解。利用微生物修复具有很多优点，如成本低，只有物理化学处理的1/3左右；处 理灵活，可以进行原地或异地处理。但微生物修复技术对环境条件的要求较苛刻，微生物生 长受温度、氧气、水分、酸碱度和土壤的微生物环境影响，且微生物群落之间相互竞争。随着近几年生物修复技术的发展，在染料污染治理上出现了新的途径。植物修复 技术比其它物理、化学和生物等方法更受到社会的欢迎，它弥补了微生物修复技术的不足， 该技术成本低，对环境扰动少，在清理土壤染料的同时，可同时清除污染土壤周围的水体中 的污染物。有较高的美化环境价值，易为社会所接受，具有较大的应用前景。植物修复的 类型主要有植物固定(Phytostabilization)、根系降解(Iihizodegradation)、植物降解 (Phytodegradation)(Phytoaccumulation)、 · 军胃(Phytovolatilization)、 挥发转移(Evapotranspiration)、根系降解(Iihizodegradation)。植物修复可用于石油污 染、炸药废物、燃料泄露、氯代溶剂、填埋渗滤液及各种有机物污染的治理。植物修复染料污 染物的过程，也是土壤有机质含量和土壤肥力增加的过程，被植物修复过的干净土壤适合 于多种农作物的生长；植物固化技术能使地表长期稳定，有利于生态环境改善和野生生物 的繁衍，且维持固化的成本较低。研究证明植物降解环境中有机污染物的机制较为复杂，归纳起来大致有以下几 种机制1)植物对有机物的直接吸收和新陈代谢；幻植物根部释放降解土壤有机污染物的 特殊酶；；3)植物根际微生物群落的降解作用。据报道，水稻幼苗可通过根系吸收14C标记 的甲烷，而玉米幼苗可通过根和叶吸收同位素标记的甲烷、乙烷、丙烷、戊烷。研究还表明 苯、甲苯、二甲苯均可随灌溉水进入植物体内，并加入到植物的新陈代谢过程中。早在20世 纪70年代初期，人们就已经发现植物具有新陈代谢多氯联苯的功能，并鉴定出植物的新陈 代谢产物，羟基氯联苯等等。另外，植物根部也能释放降解有机污染物的特殊酶。如腈水解 酶、消化酶和漆酶、去卤代酶，它们分别降解4-氯苯腈、三硝基甲苯(ΤΝΤ)、氯代溶剂(如三 氯乙烯)。细胞色素Ρ450、过加氧酶(peroxygenases)和过氧化物酶等也能降解异型生物 质。与其它有机污染物相比，国内至今还没有利用植物降解不同类型染料污染物的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种优化的三苯甲烷还原酶基因及其表达 和应用。利用基因工程技术培育高效安全修复三苯甲烷类染料污染的植物，将来自柠檬酸 杆菌中的三苯甲烷还原酶基因转化到植物中，促使植物对其的降解，以提高植物对结晶紫 和孔雀石绿的修复能力，为三苯甲烷类染料污染物的修复提供了广阔的应用前景。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现一种优化的三苯甲烷还原酶基因(tmr)，是将柠檬酸杆菌中的三苯甲烷还原酶基 因经采用植物偏爱密码进行改造后而制得，序列全长864bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO 2所示。所述优化的三苯甲烷还原酶基因与原始基因的序列比对如图1所示。在pYPX245植物表达的BamHI和^icI酶切位点之间插入三苯甲烷还原酶合成基因编码序列，从而构成pYPKmr重组质粒载体。该表达载体还包括GUS报告基因和带内含 子卡那霉素标记基因。所述pYP)(tmr植物表达载体的构建，包括以下步骤(1)优化的三苯甲烷还原酶基因的合成具体合成方法参考Ai-ShengXiong, Quan-Hong Yao，Ri-He Peng, Xian Li, Hui-Qin Fan, Zong-Ming Cheng and Yi Li, Nucleic Acid Research,2004,32(12), 98 1-10。所述优化的三苯甲烷还原酶基因合成引物均为5’端至3’端，其中末端字母“Z” 表示“正向”，“F”表示“反向”，具体如下Pl ATGGCTATCGCTGTCACTGGTGCTACTGGTCAACTCGGTGGTCTTGTCATCCAACACTTTGCTP2 TTACGAACGATGGCAATGATCTGAGAGGCAGGGACCTTCTTCAGCAAAGTGTTGGATGACAAGA
P3 AGATCATTGCCATCGTTCGTAACGTCGAGAAAGCCTTCCACTCTTGCTGATCAAGGTGTCGAAP4 CTGAAAGAGACTCAGGTTGATTGTAGTCACCATGACGAACTTCGACACCTTGATCAGCAAGP5 AACCTGAGTCTCTTTCAGAAGGCTTTCGCTGGTGTCTCCAAGCTGCTCTTCATCTCTGGTCCTCAP6 CGACGTTAGCATGTTGGACGATCAGCAGAGTGTATGTCGTAGTGAGGACCAGAGATGAAGAGCAGP7 CGTCCAACATGCTAACGTCGTCAAGGCTGCTCGTGATGCTGGTGTCATAGCACATCGCTTACACP8 TGAGCAAGTGGAATGATGGATTCCTCAGCGAAAGCGTAACCAGTGTAAGCGATGTGCTATGACAP9 CCATCATTCCACTTGCTCACGTTCCACCTTGCTACTGAGTACGCTATCCGTACTACCAACATTCCPlO ACGAAGAAGTCAGTGTACAAAGCGTATACGAAGGAAGGTGTATGGAATGTTGGTAGTACGGATAPll TGTACACTGACTTCTTCGTCAACGAAGGTCTGCGTGCTTCCATCGAGTCTGGTGTCTATCGP12 TCGAGTCTGGTGTCTATCGTCACCAATGCTGGTAGTGGTATCGTCAACTCCGTCACTCGTAAC
P13 TCAACTCCGTCACTCGTAACGAACTTGCTCTTGGCTGCTGCTACTGTTCTGACTGAGGAAGGTCP14 CCAAGGTTGGTTGGAAGACCAGGTTGTAGGTCTTGTTCTCGTGACCTTCCTCAGTCAGAACAP15 GGTCTTCCAACCAACCTTGGACCTTCGACGAACTTGCTCAGATCCTCTCTGAGGTCTCTGGCP16 TTCTCTTCTTCGAAAGAGACAGGCTGATGGACGACCTATCTTGCCAGAGACCTCAGAGAGGP17 TCTCTTTCGAAGAAGAGAAGAACTTCCTTGTCAACGCTGGTGTTCCCTGAGCCATTCGCTGAGP18 GAAGACCTCACCTTTGGAGATAGCGTCGTAGATAGCAGCAGTGATCTCAGCGAATGGCTCAGGP19 CTCCAAAGGTGAGGTCTTCCAAGACCTCTGATGATCTTCAGAAGCTGATCGGTTCCTTGACTCCP20 ATTACATCTTCAGGGCTTGTTTGACGGATCTCCTTCAGAGGAGTCAAGGAACCGATCAGCT(2) ρYPXtmr表达载体的构建利用Bam HI和Mc I进行双酶切后，通过T4DNA连接酶将步骤(1)中得到的优化 的三苯甲烷还原酶基因与含有双35S启动子的pYPX245植物表达载体连接。(3)获得pYPXtmr表达载体在上述步骤( 之后，通过质粒纯化得到该表达载体。所述优化的三苯甲烷还原酶还可促使结晶紫和孔雀石绿染料降解。利用农杆菌将所述保含优化的三苯甲烷还原酶pYPX245植物表达载体转化到植 物中的方法，包括以下步骤(1)载体的导入农杆菌感受态细胞的制备-电击法导入载体-培养
(2)转化植物a)农杆菌蘸花法转化将三苯甲烷还原酶基因转化到拟南芥中。具体方法参考 Plant J. 1998，16，735-743。b)农杆菌介导将三苯甲烷还原酶基因转化到水稻中。具体方法参考刘巧全，植 物生理学报，1998，24 (3)，259-271。c)农杆菌介导将三苯甲烷还原酶基因转化到烟草中。具体方法参考美国发明专 利 US6, 323，396。通过上述方法转化的携带有优化的三苯甲烷还原酶基因的植物能持续表达三苯 甲烷还原酶，并能促使植物参与结晶紫和孔雀石绿的降解，验证了转基因植物对三苯甲烷 类染料的降解功能。从而可以为植物修复三苯甲烷类染料污染提供有益的帮助。含有本发 明的优化的三苯甲烷还原酶基因的植物安全稳定，对植物生长没有不良影响，对环境污染 小。本发明的有益效果1)来自柠檬酸杆菌中的优化的三苯甲烷还原酶基因能够持续在植物中表达。比较 了转三苯甲烷还原酶基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株对三苯甲烷类染料的耐受性。 结果表明野生型植株和转基因植株在存活率和表型上都有很大差异，转基因植物降解结 晶紫为对植株无毒的隐性结晶紫，从而可以为植物修复三苯甲烷类染料污染提供有益的帮 助。2)含有优化的三苯甲烷还原酶基因的植物安全稳定，对植物生长没有不良影响， 而且降解产物对植物没有影响，对环境污染很小。
图1为本发明的优化的tmr基因与原始基因序列比对。图2为本发明的优化的tmr基因植物表达载体的构建。图3为不同转基因拟南芥植株株系过量表达三苯甲烷还原酶基因电泳图，其中 WT为野生型植株；1-2，5-8，6-3，7-4，9-1，12-3分别为不同转基因的植株株系。图4为野生型拟南芥和转基因拟南芥对结晶紫(CV)和孔雀石绿(MG)的耐受能力 比较及根长、叶重和茎重，其中a为野生型和转基因拟南芥植株分别对CV和MG的耐受能 力；b为根长；(为叶重；d为茎重。图5为液相色谱-串联质谱分析三苯甲烷还原酶对结晶紫的降解产物，其中a为 液相图谱；b为液质图谱。
具体实施例方式以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技 术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员 应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精 神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社。)实施例1按照植物偏爱密码重新合成优化的三苯甲烷还原酶基因我们按照植物偏爱密码重新合成优化的三苯甲烷还原酶基因，并将新合成的基因 序列与原始基因序列进行了比对(图1)。优化的三苯甲烷还原酶基因合成引物如下PlATGGCTATCGCTGTCACTGGTGCTACTGGTCAACTCGGTGGTCTTGTCATCCAACACTTTGCT
P2TTACGAACGATGGCAATGATCTGAGAGGCAGGGACCTTCTTCAGCAAAGTGTTGGATGACAAGA
P3AGATCATTGCCATCGTTCGTAACGTCGAGAAAGCCTTCCACTCTTGCTGATCAAGGTGTCGAA
P4CTGAAAGAGACTCAGGTTGATTGTAGTCACCATGACGAACTTCGACACCTTGATCAGCAAG
P5AACCTGAGTCTCTTTCAGAAGGCTTTCGCTGGTGTCTCCAAGCTGCTCTTCATCTCTGGTCCTCA
P6CGACGTTAGCATGTTGGACGATCAGCAGAGTGTATGTCGTAGTGAGGACCAGAGATGAAGAGCAG
P7CGTCCAACATGCTAACGTCGTCAAGGCTGCTCGTGATGCTGGTGCATAGCACATCGCTTACAC
P8TGAGCAAGTGGAATGATGGATTCCTCAGCGAAAGCGTAACCAGTGTAAGCGATGTGCTATGACA
P9CCATCATTCCACTTGCTCACGTTCCACCTTGCTACTGAGTACGCTATCCGTACTACCMCATTCC
PlOACGAAGAAGTCAGTGTACAAAGCGTATACGAAGGAAGGTGTATGGAATGTTGGTAGTACGGATA
PllTGTACACTGACTTCTTCGTCAACGAAGGTCTGCGTGCTTCCATCGAGTCTGGTGTCTATCG
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P13TCAACTCCGTCACTCGTAACGAACTTGCTCTTGGCTGCTGCTACTGTTCTGACTGAGGAAGGTC
P14CCAAGGTTGGTTGGAAGACCAGGTTGTAGGTCTTGTTCTCGTGACCTTCCTCAGTCAGAACA
P15GGTCTTCCAACCAACCTTGGACCTTCGACGAACTTGCTCAGATCCTCTCTGAGGTCTCTGGC
P16TTCTCTTCTTCGAAAGAGACAGGCTGATGGACGACCTATCTTGCCAGAGACCTCAGAGAGG
P17TCTCTTTCGAAGAAGAGAAGAACTTCCTTGTCAACGCTGGTGTTCCCTGAGCCATTCGCTGAG
P18GAAGACCTCACCTTTGGAGATAGCGTCGTAGATAGCAGCAGTGATCTCAGCGAATGGCTCAGG
P19CTCCAAAGGTGAGGTCTTCCAAGACCTCTGATGATCTTCAGAAGCTGATCGGTTCCTTGACTCC
P20ATTACATCTTCAGGGCTTGTTTGACGGATCTCCTTCAGAGGAGTCAAGGAACCGATCAGCT
采取连续延伸PCR方法，共设计20条引物用于本发明基因的合成。
在50μ L反应体系中，内侧引物(Ρ2-Ρ19)的添加量为10ng，外侧引物(P1，P20)添
加量为 lOOng，扩增条件为94°C预热 IOmin -MV, 30s, 54°C, 30s, 72°C, 60s, 35 个循环；最 后72°C延伸lOmin。使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司日本)扩增目 的基因。PCR结束后，(W/V)琼脂糖胶电泳后回收，取10μ 1回收产物直接与Τ/Α克隆载 体相连(大连宝生物公司)。4°C连接过夜，高效转化大肠杆菌DH5ci感受态中。实施例2优化的三苯甲烷还原酶基因植物表达载体构建将来自柠檬酸杆菌的三苯甲烷还原酶按照植物偏爱密码进行改造，利用基因合成 方法(熊2004，核酸研究)将这个基因重新合成。分别用BamHI和McI进行双酶切，回收DNA片段，通过T4DNA连接酶将优化的三 苯甲烷还原酶基因与含有双35S启动子的pYPX245质粒连接，纯化，酶切鉴定和序列测定获 得含有三苯甲烷还原酶基因的重组质粒载体pYPKmr (图2、。该表达载体还包含GUS报告 基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因。
实施例3农杆菌培养和植物转化农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105，LBA4404，GV3101菌株。质粒经电击法导人农杆 菌中。挑取单菌到25ml YEB培养基(50mg/L利福平)培养过夜，取5ml菌液转接到IOOml YEB培养基(50mg/L利福平)，培养至0D600 = 0. 7-0. 8，菌液冰上放置10分钟，5000rpm离 心10min，4°C，收集菌体，加入IOOml无菌双蒸水清洗两次。加入細110%甘油悬浮菌体，转 到50ml离心管。5500rpm离心10min，4°C。收集菌体,加入500μ1 10%甘油悬浮菌体，转 到1. 5ml离心管。取70 μ 1感受态细胞，加入1 μ 1重组质粒载体pYPXtmr。用去头的黄枪 头混勻，转到0. Icm电击杯中。电击参数200Ω，1.7Κν，2. 5F，电击后立即加入800μ 1 SOC 培养液。培养1小时后，取100 μ 1涂抗性板筛选转化子，28°C培养。1.拟南芥粘花法转化含目的质粒的农杆菌菌株单菌落接菌在5毫升含对应抗生素的LB培养基中 培养2天。将5毫升菌液转到500毫升的液体LB培养基中培养16- 小时(0D = 1. 5-2. 0).液体可以在4°C保存30天。室温下离心收集菌体，4000g离心10分钟。用等体 积5%的新鲜蔗糖溶液悬浮。加入0.02%的Silwet-77混勻后转移到烧杯中。每个菌株用 300毫升转化，转2-3钵。将拟南芥倒置后浸入菌液中10秒钟。莲座和花序都要侵染。侵 染后将转化植株菌液空干燥3-5秒，用保鲜膜将转化植株罩住，以保持湿润环境，水平放置 22°C下避光培养16-24小时，转化后不要放置在高温和强光下。揭开保鲜膜直立培养，隔7 天后再转化，总共转化2-3次。拟南芥苗生长过程中保持一定湿度，再生长1个月后收种子。 利用50 μ g/mL潮霉素进行转化植株筛选，并利用RT-PCR检测了不同株系过量表达三苯甲 烷还原酶基因情况(图3)。2.烟草转化挑选较饱满的种子，用75wt %的酒精清洗1分钟，次氯酸钠加1滴土温灭菌10分 钟，种子铺在MSO培养基上，28度培养待发芽。将烟草幼叶剪成Icm2，放入MS0+NAA1 (lug/ ml)+BA2 (4ug/ml)的培养基中，22度培养1天。农杆菌培养0D0. 8-1. 0后离心5000g离心 8分钟，无菌水清洗一次，等体积MS培养液悬浮侵染8分钟后，吸干放置在MS0+NAA1+BA2 的培养基中，22度黑暗共培养3天。然后转入筛选培养基MS0+IAA1(0. lug/ml)+ZT (2ug/ ml) +Cb (500ug/ml) +Km (50ug/ml)培养 2-3 周，再转入分化培养基 MS0+IAA1 (0. Iug/ ml) +ZT (2ug/ml) +Cb (500ug/ml) +Km (lOOug/ml)培养 2-3 周，最后转入生根培养基 1/2MS+IAA1 (0. lug/ml)培养，可生根形成阳性苗。自然光温下炼苗3_5天移载到育苗钵中， 成活后移栽到温室中。3.水稻转化N6培养基为基本培养基，去壳的种子，授粉后12-15天的幼胚，经表面消毒后接种 到N6D2培养基中诱导愈伤组织(N6培养基，水解乳蛋白500mg/L，蔗糖30g/L，2，4_D 2mg/L, 植物凝胶2. 5g/L，pH5. 8)；培养4-7天后取愈伤组织进行转化。农杆菌培养0D0. 8-1. O后 离心5000g离心8分钟，DDH2O清洗一次，等体积MS培养液悬浮侵染8分钟后，吸干放置在 MS0+NAA1+BA2的培养基中，22度共培养3天。然后转入筛选培养基(加入头孢Cb (500ug/ ml)和潮霉素HAT (50ug/ml)，转化后的愈伤在含有和的抗性培养基上培养3 4代，转入分 化培养基中Omg/L KT)；幼芽长至2mm转移到生根培养基(1/2MS+0. 5mg/L IBA)。以上培养基中分别加入500mg/L酶水解乳蛋白(CH)，0 700mg/L谷氨酰胺或精氨酸，蔗糖30 80g/L，琼脂6g，pH 5.8。继代周期为25d。将淡黄色的胚性愈伤组织转入分化培养基中， 30d左右分化出芽。光照强度1500 20001x，12 14h/d。从获得的抗性植株中取一部分叶子，侵入含有X-GLUC的染色液中，筛选叶片变蓝 的转基因植株进行分子检测，提取叶片总DNA，参照《分子克隆》的方法，以tmrZ和tmrF为引 物对对转基因植株进行PCR检测，扩增条件为94°C预热Imin ；94°C，30s，60°C，30s，72°C， lmin。共25个循环。从分子水平上证明目的基因是否导入。实施例4优化的三苯甲烷还原酶基因转化植物后对染料的降解分析将转基因拟南芥自交纯合3代，获得3个纯合转化株系(tmr-l、-5、-7)的种子。 直接铺种到含有-g/L结晶紫或孔雀石绿的MS培养基中培养，观察植物的萌发、根长和表 型情况。转基因植物在含有结晶紫或孔雀石绿的平板上，种子的发芽率比非转基因植物提 高3. 0倍。转基因植物在含有结晶紫或孔雀石绿的平板上，转基因植株根长比野生型植株 提高近100%倍，野生型植株根长生长受抑制，几乎不再生长(图4)。实施例5液相色谱-串联质谱分析优化的三苯甲烷还原酶对结晶紫的降解产物称取液体培养的拟南芥样品5. OOg于50mL离心管内，加入1. 5mL 20%的盐酸羟胺 溶液、2. 5mL 1. Omol/L的对-甲苯磺酸溶液、5. OmL乙酸盐缓冲溶液，用勻浆机以IOOOOr/ min的速度均质30s，加入IOmL乙腈剧烈震摇30s。加入5g酸性氧化铝，再次震荡30s。 3000r/min离心lOmin。把上清液转移至装有IOmL水和2mL 二甘醇的IOOmL离心管中。然 后在50mL离心管中加入IOmL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层。在离心管中加入15mL 二 氯甲烷，振荡10s，3000r/min离心lOmin，将二氯甲烷层转移至IOOmL的梨形瓶中，再用5mL 乙腈、IOmL 二氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于IOOmL梨形瓶中。45°C旋转蒸 发至约lmL，用2. 5mL乙腈溶解残渣。将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中 的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤瓶两次，每次2. 5mL,把洗涤液依次通过柱，控制流速不 超过0. 6mL/min，收集全部流出液，45°C旋转蒸发至近干，残液准确用0. 5mL乙腈溶解，过 0. 45 μ m滤膜，滤液供液质色谱测定，测定结果如图5所示。附本发明所涉及的核苷酸/氨基酸序列表<110>上海市农业科学院<120> 一种优化的三苯甲烷还原酶基因及其表达和应用<160>3<210>SEQ ID NO 1<211>864<212>DNA<213> 柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)<400>1atggctatcg ctgtcactgg tgctactggt caactcggtg gtcttgtcat ccaacacttg 60ctgaagaagg tccctgcctc tcagatcatt gccatcgttc gtaacgtcga gaaagcctcc 120actcttgctg atcaaggtgt cgaagttcgt catggtgact acaatcaacc tgagtctctt 1800120] 0121] 0122]
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Pro 115 Asn
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Ser Gly Ala
Thr Arg Asn 175
240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 8400159]GluLeuAlaLeu Ala Ala Ala ThrValLeu Thr Glu Glu Gly HisGlu0160]180185 1900161]AsnLysThrTyr Asn Leu Val SerAsnGln Pro Trp Thr Phe AspGlu0162]1952002050163]LeuAlaGlnlie Leu Ser Glu ValSerGly Lys Lys Val Val HisGln0164]2102152200165]ProValSerPhe Glu Glu Glu Lys AsnPhe Leu Val Asn Ala GlyVal0166]2252302350167]ProGluProPhe Ala Glu lie ThrAlaAla lie Tyr Asp Ala lieSer0168]2402452502550169]LysGlyGluAla Ser Lys Thr Ser AspAsp Leu Gln Lys Leu lieGly0170]260265 2700171]SerLeuThrPro Leu Lys Glu Thr ValLys Gln Ala Leu Lys Met-k -k0172]27528028权利要求
1.一种优化的三苯甲烷还原酶基因，其特征在于，它将柠檬酸杆菌中的三苯甲烷还原 酶基因经采用植物偏爱密码进行改造后制备而成的，该基因序列全长864bp，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO I0
2.根据权利要求1所述的优化的三苯甲烷还原酶基因，其特征在于，其编码的蛋白质 序列如SEQ ID NO 2。
3.包含权利要求1所述的优化的三苯甲烷还原酶基因的植物表达载体。
4.根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于，为pYPXtmr植物表达载体。
5.根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于，在所述植物表达载体的BamHI和 McI酶切位点之间插入三苯甲烷还原酶合成基因编码序列。
6.根据权利要求3所述的植物表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤(1)权利要求1所述的优化的三苯甲烷还原酶基因的合成；(2)pYPXtmr表达载体的构建；(3)获得pYPXtmr表达载体。
7.权利要求1所述的优化的三苯甲烷还原酶在促使降解结晶紫和孔雀石绿染料中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种优化的三苯甲烷还原酶基因及其表达和应用。将柠檬酸杆菌中的三苯甲烷还原酶基因经采用植物偏爱密码进行改造后，得到本发明的优化的到三苯甲烷还原酶基因，全长864bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO 2。将本发明优化的三苯甲烷还原酶基因构建到植物载体并进行农杆菌转化，转化的拟南芥植物能持续表达三苯甲烷还原酶，并促使植物参与结晶紫和孔雀石绿的降解，从而为植物修复三苯甲烷类染料污染提供了广阔的应用前景。
文档编号C12N15/82GK102108362SQ200910200678
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 熊爱生, 田永生, 赵伟, 高峰 申请人:上海市农业科学院