专利名称：一种来源于拟南芥的抗盐、抗干旱的cpk蛋白激酶基因的制作方法
技术领域：
本发明属作物遗传育种领域，具体涉及一种来源于拟南芥的抗盐、抗干旱的CPK 蛋白激酶基因。
背景技术：
高等植物与动物不同，其中最重要的一点是它们更容易受到外界环境的影响。 在长期的进化与驯养中，植物渐渐形成了一套适应环境变化的机制。这些机制涉及到解 剖学、生理学、生化学、遗传学、发育学、进化学、分子生物学等许多范畴，其中分子生物学 在植物应对环境变化的机制中是最重要的，这个多维的网络调控系统涉及到基因表达与 调控的各个水平，包括环境信号的识别、信号转导、信号输出、信号响应和表型变化等。 生物体内普遍存在的信号转导调节方式是蛋白激酶(protein kinase)和蛋白磷酸酶 (proteinphosphatase)催化蛋白质磷酸化与去磷酸化，这一过程几乎涉及所有的生理及病 理过程，如糖代谢、光合作用、细胞的生长发育、基因表达、神经递质的合成与释放，甚至癌 变等等，在细胞信号转导过程中占有极其重要的位置。拟南芥(Arabidopsis thaliana)，十字花科植物。因其植株小、生长发育周 期短、种子多、基因组小、自花授粉、基因高度纯合等优点，被选作模式植物，是植物生理 研究中的重要试才。常用的生态型有三种Landsberg erecta(Ler)，Columbia(Col)， Wassilewak(Ws)，其中Col的全基因组测序已经完成，所以，对它的各种宏观生理研究都可 以十分方便地与微观的分子水平的研究相联系。钙依赖型蛋白激酶(Ca2+-cbpendent Protein Kinase, CPK)是植物蛋白激酶的研 究热点，它广泛分布于植物、藻类和一些原生动物中，但在细菌、真菌和高等动物中尚未发 现。CPKs在植物体内分布广泛在器官水平上，根、茎、叶、花、果实和种子中无处不在；在 细胞水平上，分生细胞、木质部细胞、花粉细胞、保卫细胞和胚细胞中均有发现；在亚细胞水 平上，质膜、液泡膜、线粒体外膜、叶绿体类囊体膜、内质网膜等膜系统和胞质、核质中均有 踪迹。CPKs在植物钙信号转导过程中具有非常重要的作用。植物细胞在外界(非生物和 生物)刺激下，细胞内Ca2+浓度发生瞬间、持续或振荡变化。细胞内Ca2+浓度的变化通过 Ca2+结合蛋白(CPK)进行识别、放大和向下游传导。通过一系列的级联传导，从而出现细胞 分裂、细胞伸长、气孔运动、各种胁迫反应以及生长发育等过程。参与环境胁迫信号的转导 是CPKs的重要作用之一。干旱、冷害、盐害、营养饥饿、光、低渗透等多种环境因子都能引起 CPKs基因的特异性表达和CPKs mRNA的特异性积累。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于拟南芥的抗盐、抗干旱的CPK蛋 白激酶基因，进一步将其应用于植物转化，以提高植物对盐、干旱的耐受性。本发明采用以下技术方案来实现上述目的—种来源于拟南芥的抗盐、抗干旱的CPK蛋白激酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo 1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。所述CPK蛋白激酶基因的制备方法如下设计一对引物(AtCPK6-F:5，-AAGGATCCATGGGCAATTCATGTCGTGG-3，和 AtCPK6_R 5，-AAGAGCTCTA CACATCTCTCATGCTG-3，)，为了克隆鉴定等构建需要，引物两端分别引入Bam H I和Me I的酶切位点。PCR反应体系10XPCR buffer 5. 0 μ 1 ；dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ 1 ；拟南芥 cDNA模版 1 μ 1 (20ng)；引物 AtCPK6-F 0· 5 μ 1 ；引物 AtCPK6_R 0. 5 μ 1 ；Εχ-TaqO. 4 μ 1 (预变性后加 入)；加无菌水定容至50 μ 1。PCR反应程序94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸2min，共扩增30个循环，再 72°C延伸 IOmin0所得PCR产物经琼脂糖凝胶回收后，克隆到大连宝生物工程有限公司的 pMD-18-Simple T载体上进行克隆鉴定和序列测定。结果发现该基因为CPK蛋白激酶 AtCPK6基因，长1635bp，编码的蛋白质含544个氨基酸。转AtCPK6基因的拟南芥植株与野生型植株相比，前者对盐、干旱的耐受性明显提 高。盐处理后，转AtCPK6基因的拟南芥植株平均成活率为78.8%，野生型植株为12.3% ； 干旱处理后，转AtCPK6基因的拟南芥植株平均成活率为70. 8 %，野生型植株为14. 1 %。有益效果本发明克隆了拟南芥CPK蛋白激酶基因，S卩AtCPK6基因。对该转AtCPK6基因的拟 南芥植株和野生型拟南芥植株盐、干旱胁迫的耐受性试验结果表明野生型和转AtCPK6基 因拟南芥植株在存活率上有明显的差异，转基因植株比野生型有明显的抗盐、抗干旱能力， 这也表明本发明的AtCPK6基因的转入提高了拟南芥植株的抗盐、抗干旱的能力。
图1为琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物的结果。图2为PCR扩增所得序列为SEQ ID No 1的AtCPK6基因电泳图，其中1为PCR扩 增得到的CPK蛋白激酶基因，2为DNA Marker。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括WMJ^· (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)白勺禾中〒(ν/ν)罾自 粉消毒后种植在黑土 珍珠岩蛭石(3 1 9)混合基质中，22°C、IMi光照培养(1 光 照，8h黑暗，冷光源)生长20d。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a由上海市农业科学院生物技术研究所植物基 因工程研究室保存。植物RNA小量抽提试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司。克隆载 体Rnd-18-Simp 1 e T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTPUOXPCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国 药化学试剂公司购买。ABI PRIAM Bio-DyeTerminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统 公司。
下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行Sambook J, FretsE F， Mannsdes T et al. In :Molecular Cloning. 2nd ed.Cold Spring HarborLaboratory Press,1989。实施例1拟南芥幼苗RNA的抽提和cDNA合成(一 )试验方法1. RNA抽提及基因组DNA的去除称取0. Ig植物材料倒入液氮使材料保持冻结和易碎的状态，研磨。研磨后的细粉转移至试剂盒中的缓冲液中，并按试剂盒操作说明提取RNA。RNA沉淀用50 μ 1 DEPC处理的去离子水轻柔溶解，用氯仿-异戊醇混合液抽提，以 除去残留的少量基因组DNA，4°C，12000g离心30min。上清液转移至另一新的管子，加入2倍体积_20°C冰冷的无水乙醇，充分混合，放 置在_20°C条件下2h，沉淀总RNA。12000g，4°C离心30min，用75wt%乙醇漂洗两次，保留RNA，真空风干。用20 μ IDEPC处理的去离子水重新熔解，取少量用于RNA质量和浓度的检测，其余 储存与_70°C，备用。2. cDNA 合成加入Oligo (dT) 20 (IOpmol/μ 1)1μ 1 ；总 RNA IO-IOOng ；补足 RNase Free H2O 至Ij 12μ 1。65°C，5min后，立即置于冰上。再力口入 5 X RT Buffer 4 μ 1 ；dNTP Mixture (各 IOmM) 2 μ 1 ；RNase Inhibitor (10U/μ 1) 1 μ 1 ；反转录酶 1μ 1。反转录反应程序为30°CIOmin ；42°C 20min ；85°C 5min ；4°C 5min。瞬间离心，保存。( 二)试验结果采用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物的结果见图1，图中可见明显的RNA条带。实施例2PCR方法获得拟南芥抗盐、抗干旱的CPK蛋白激酶(AtCPK6)基因片段(一 )试验方法本发明设计一对引物(AtCPK6_F和AtCPK6_R)，为了克隆鉴定等构建需要，引物两 端分别引入Bam H I和Mc I的酶切位点。PCR 反应体系10 X PCR buffer 5. 0 μ 1 ；dNTPs (各 2. 5mM)4y 1 ；拟南芥 cDNA 模版 1 μ 1 (20ng)；引物 AtCPK6-F 0· 5 μ 1 ；引物 AtCPK6_R 0. 5 μ 1 ；Εχ-TaqO. 4 μ 1 (预变性后加 入)；加无菌水定容至50 μ 1。PCR反应程序94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸2min，共扩增30个循环，再 72°C延伸 IOmin0( 二)试验结果经过1. 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约1600bp的片段(参见图 2)。
实施例3克隆鉴定、序列测定(一 )试验方法扩增片段采用杭州维特洁生化技术有限公司DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后 克隆到大连宝生物工程有限公司的pMD-18-Simple T载体上进行克隆鉴定和序列测定。本发明通过核苷酸序列测定分析，最终获得拟南芥抗盐、抗干旱蛋白激酶AtCPK6 基因，其碱基和氨基酸序列信息如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示。( 二)试验结果测序分析结果显示拟南芥抗盐、抗干旱的AtCPK6蛋白激酶基因编码阅读框长 163^p，编码的蛋白质含544个氨基酸。实施例4拟南芥转化(一 )试验方法1.农杆菌的准备1)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250转/分钟培养20h。2)取ImL菌液转接入20_30mL LB液体培养基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250 转 / 分钟培养约 12h，测 OD 600 ^ 1. 5。3)8000转/分钟，4°C，IOmin离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5wt%蔗 糖，0. 05wt% Silwet L-77)并稀释至 OD 600 ^ 0. 8。2.拟南芥蘸花法转化1)将拟南芥的花薹浸入渗透液中，轻轻搅动约IOs后取出，全部转化完毕后，托盘 中加入水，用保鲜膜罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置22°C避光培养，24h后去掉保
鲜膜直立培养。2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花 序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。3)生长约两个月后，收集种子，4°C冰箱储存待用。( 二)试验结果经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。实施例5拟南芥种子的筛选(一 )试验方法1)称25-30mg种子放入1. 5ml离心管。2) Iml 75wt%乙醇消毒Imin (不停摇晃振荡)，8000转/分钟离心5s，去上清。3)加入Iml过滤后的漂白粉(5wt% )消毒15min (不停摇晃振荡，充分消毒)， 8000转/分钟离心5s，去上清。4)无菌水洗涤3-4次。5)将种子均勻的播撒到V2MS平板(潮霉素50μ g/mL)上，Paraf i Im膜封口，4°C 冰箱放置两天，220C，16h光照培养6天。
将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(Ttl)培 养至开花结实，收集Ttl植株上所结T1种子。实施例6CPK蛋白激酶(AtCPK6)转化植株后的抗逆分析(一 )试验方法将转基因拟南芥自交纯和两代，获得3个纯化转化株系，收取种子。播种后，幼苗 生长10-20天，分别用NaCl、PEG处理，观察植株的耐盐，耐干旱效果。(二)试验结果结果表明野生型和转AtCPK6基因拟南芥再存活率上有明显的差异，转基因植株 比野生型拟南芥抗盐和干旱能力有明显提高。经过盐、干旱处理的转基因与野生型拟南芥 的存活率如表1所示。表1转基因与野生型拟南芥的盐、干旱处理后存活率
权利要求
1.一种来源于拟南芥的抗盐、抗干旱的CPK蛋白激酶基因，其特征在于，其核苷酸序列 如SEQ ID No 1所示。
2.根据权利要求1所述的CPK蛋白激酶基因，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序 列如SEQ ID No 2所示。
3.根据权利要求1所述的CPK蛋白激酶基因，其特征在于，所述CPK蛋白激酶基因是 AtCPK6 基因。
4.权利要求1至3任一项所述的CPK蛋白激酶基因在制备抗盐、抗干旱的转基因植物 中的应用。
5.权利要求1至3任一项所述的CPK蛋白激酶基因在植物转化中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种来源于拟南芥的抗盐、抗干旱的CPK蛋白激酶基因。所述CPK蛋白激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。该基因长1635bp，含544个氨基酸，是AtCPK6基因。本发明的CPK蛋白激酶基因用于植物转化，以提高植物对盐、干旱的耐受性。
文档编号C12N15/54GK102108364SQ200910200679
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 彭日荷, 熊爱生, 田永生, 许晶, 赵伟, 高峰 申请人:上海市农业科学院