专利名称：一种突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因及其表达的制作方法
技术领域：
本发明属基因生物工程领域，具体涉及一种突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因及其表达。
背景技术：
乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)主要存在于多细胞动物的神经元间、神经元与肌肉细胞间的化学突触上，是生物神经传导中的一种关键酶，是主要的信号传递分子。乙酰胆碱酯酶AChE行使水解神经递质乙酰胆碱Ach的功能，从而终止Ach对胆碱能受体的兴奋作用，保持神经冲动传导的灵敏性。 研究表明，多种化合物可抑制AChE的活性，导致有机体类胆碱代谢途径过度，胆碱酯不能被有效水解，大量积累于神经末梢，有机体表现出肌肉抽搐，中枢神经系统功能紊乱等症状，严重者甚至死亡。在众多抑制剂中，有机磷和氨基甲酸酯类农药被认为是AChE的专性抑制剂，他们可使昆虫神经系统中的AChE的丝氨酸羟基基团发生磷酸化或甲氨酰化，使AChE失去活性，不能迅速水解乙酰胆碱，致使昆虫死亡。 我国是蔬菜生产大国，目前我国蔬菜农业上滥用高毒、高残留农药的现象屡禁不止。有的不按规范要求使用农药，有的甚至严重违反农药安全使用标准而使用高毒农药，致使相当部分农产品农药残留明显超标，食用后在人体内积累，引发疾病，有时甚至发生急性中毒，严重危及人们健康和生命安全。与此同时，农药残留问题也给农产品生产和正常贸易带来了许多负面影响。近年来，我国农产品因农药残留超标而被进口国拒绝、扣留、退货、索赔和中止合同的事件时有发生。如2002年上海出口到韩国的紫菘因农药残留超标问题而遭到退货，造成直接经济损失达500多万元。 一些国家更是利用国际贸易技术壁垒，人为地对我国农产品出口设置障碍，使我国蔬菜出口屡屡受阻。如何快速、灵敏、准确地检测出农产品及其加工产品中的残留农药，是解决上述问题的关键。 目前农药残留检测主要有两大类方法色谱检测法和快速检测法。色谱检测法因为其监测数据的精确性和准确性可为农药残留执法提供有力的参考依据。但其操作程序复杂、需要高技术专业检测人员，检测仪器和费用都相当昂贵，不利于大众化。快速检测法操作简便、不需要昂贵仪器，适合于现场检测及大批样品的筛选检测，主要用来防止有机磷和氨基甲酸酯类农药残留严重超标的蔬菜和水果流入市场。快速检测法中应用最为广泛的是酶抑制法，酶抑制法检测农产品中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留是根据有机磷农药的毒理特性对酶分解底物的抑制作用而建立起来的，其中使用较多的是乙酰胆碱酯酶(简称AChE)。 近年来，我国在利用乙酰胆碱酯酶进行农药残留检测方面的研究取得了一定的成果，并研发出了相应的试剂盒、速测卡和速测仪。无论采用何种方法，酶是决定检测方法灵敏度和可靠性的最关键因子。目前采用的酶原料主要有两类一是从国外进口乙酰胆碱酯酶纯酶制剂，如电鳗和牛血清来源的酶，但价格较高，而且对有机磷及氨基甲酸酯类农药缺乏敏感性；二是直接从昆虫体内提取粗酶液，但该类酶产品的纯度及稳定性较差，影响了检测结果的重复性。国际上先进的农药残留速测技术是利用基因工程技术获得高热稳定性胆碱酯酶，并制备速测试纸条，克服了胆碱酯酶易失活、不稳定等缺点，使检测效率大幅度提高。 自上世纪90年代起，多种来源(包括线虫、果蝇、电鳗、鼠类、人等)的乙酰胆碱酯酶基因在昆虫细胞、爪蟾卵母细胞、哺乳动物细胞甚至植物株系中成功获得了表达Moreland Massouli6，1997 ;Simon and Massouli6，1997 ;Mendelson et al，1998 ;Hussein etal，1999,2000 ;Mor et al，2001 ;Uccelletti etal，2002 ;0vadia Lazari et al，2003。研究者利用这些重组蛋白注射老鼠、豚鼠和灵长类，证明在有机磷中毒时间中取得了良好的预防与治疗效果。不同生物来源的AChE对抑制剂的敏感程度不同。蝇类的AChE发生磷酸化与甲氨酰化的速度高于其它生物的酶，也就是说，此类酶对有机磷和氨基甲酸酯类农药是最为敏感的。因此，是农药残留检测的理想生物学材料。 因此，通过基因工程手段在酵母中大量表达家蝇的AChE则会避免上述农药残留检测中存在的问题。通过分子生物学手段克隆到家蝇AChE基因后，对其进行定点突变可以显著地提高酶的活性和稳定性，并在酵母表达系统中快速高效地获得表达。用此种方法获得的活性蛋白经过纯化之后便可以获得纯的AChE，避免了昆虫体内多种蛋白的干拢，不仅可以进一步用于农药残留的快速检测，在农药设计和筛选方面也有广泛的用途。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于通过分子生物学手段克隆到家蝇乙酰胆碱酯酶基因后，对现有的家蝇乙酰胆碱酯酶进行氨基酸定点取代，提供一种突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，以显著地提高该酶的活性和稳定性，克服农残检测中现有技术的不足，使改造后的家蝇乙酰胆碱酯酶对有机磷和氨基甲酸酯类农药更敏感。 本发明所要解决的又一技术问题在于将上述定点突变后的家蝇家蝇乙酰胆碱酯
酶基因在酵母表达系统中快速高效地获得表达。用此种方法获得的活性蛋白经过纯化之后
便可以获得纯的家蝇乙酰胆碱酯酶，最终达到工业化生产的要求，为开发农药生物学检测
产品及农药设计和筛选提供有用的蛋白材料。 为达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现 —种突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，它是在现有的家蝇乙酰胆碱酯酶基因其表达的成熟蛋白由612个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO. 1所示，其编码的核苷酸序列如SEQID NO. 2的基础上，对其进行氨基酸定点突变。所得突变后的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
所述突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，其氨基酸定点突变是指在序列SEQ IDNO. 1的第180、327和374位发生氨基酸定点取代。即在第180位用缬氨酸(V)取代脯氨酸(P)，在第327位用天冬氨酸(D)取代酪氨酸(Y)，在第374位用天冬氨酸(D)取代异亮氨酸(I)。
本发明还提供一种载体，含有如前所述SEQ ID N0.4核苷酸序列的载体，包括pPIC9K或本领域已知的各种载体，如市售的载体。 所述突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因表达的蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)、利用反向PCR法依次对序列SEQ ID NO. 1的第180位、327位和374位3个位
4点进行突变，得到突变后的乙酰胆碱酯酶基因序列并测序验证； 2)、将编码具有突变乙酰胆碱酯酶基因的核苷酸序列连接于表达载体pPIC9K中，形成家蝇乙酰胆碱酯酶表达载体； 3)、将上述表达载体转入酵母宿主细胞中，形成家蝇乙酰胆碱酯酶的重组细胞；
4)、在适合乙酰胆碱酯酶表达的条件下，培养上述的重组细胞；
5)、分离出具有家蝇乙酰胆碱酯酶蛋白活性的多肽。 所述的酵母宿主细胞含有如前所述的SEQ ID NO. 4核苷酸序列分子，或者含有如前所述的SEQ ID NO. 3的氨基酸序列的载体。 所述的酵母宿主细胞包括真核细胞或原核细胞，优选真核细胞，如酵母细胞，昆虫细胞核哺乳动物细胞等。所述的原核细胞为大肠杆菌或枯草杆菌。 所述的突变的家蝇乙酰胆碱酶基因在酵母表达系统中快速高效地获得表达，其该
突变的家蝇乙酰胆碱酶基因可应用于有机磷和氨基甲酸酯类农药检测中。 本发明还提供了一种DNA分子，其含有SEQ ID NO. 4的核苷酸序列，编码如前所述
的乙酰胆碱酯酶。所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体中，再
转入到所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以在宿主细胞中进行表达。 在众多表达系统中，酵母表达系统具有繁殖迅速、营养要求简单和便于工业化大
规模发酵生产的优点。此外，酵母表达系统克服了大肠杆菌表达系统的缺点，不产生毒素，
安全可靠；具有分泌功能，使蛋白分泌到胞外，利于纯化；可对蛋白进行多种翻译后的修
饰，利于保持生物产品的活性和稳定性。 本发明通过人工分子进化获得新型基因资源，并利用基因工程手段在酵母细胞中高效表达突变基因，获得大量有活性的乙酰胆碱酯酶。通过该方法获得的乙酰胆碱酯酶比直接从昆虫体内提取的粗酶液纯度更高，对低浓度的有机磷及氨基甲酸酯类农药具有更显著的敏感性，可用于农产品中农药残留的检测，为发展新型酶法检测农药残留技术以及农药的设计和筛选提供了高效的酶源，具有很大的应用价值。
图1为本发明的技术流程图。 图2为重组表达质粒的酶切鉴定图，其中M1为DNA分子量标准DL15000 ;M2为DNA分子量标准DL2000 ;1、2为载体pPIC9K ;3为pPIC9K-AChE-EcoRI/Not I ;4为pPIC9K-VDD-EcoR I/Not I ;5为AChE的PCR产物。 图3为乙酰胆碱酯酶在毕赤酵母中的SDS-PAGE检测，其中M为蛋白质分子量标准；1为阴性对照；2为转入pPIC9K-AChE的酵母重组子；3为转入pPIC9K_VDD的酵母重组子。
具体实施例方式
下面结合实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。 实施例1 家蝇乙酰胆碱酯酶(AChE)基因序列的获得
提取家蝇总RNA，通过反转录获得家蝇总cDNA的第一条链。然后采用正向引物 Ace-F :5，AAAGGATCC(BamH I)ATGGCTAGATCCGTCAG-3，和反向引物Ace-R :5，-AAAGAGCTC(Sac I) TTACTGGAAGATAGAG-3'进行PCR扩增，获得家蝇AChE基因的cDNA扩增产物，并进行电泳 回收。用限制性内切酶BamHI和Sac I分别双酶切回收的PCR产物和pBbluScipt SK+载 体，连接两者酶切后的片段，转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH5 a ，获得含AChE cDNA基 因序列的大肠杆菌克隆，将大肠杆菌中含AChE cDNA序列的质粒命名为PBSK-AChE。
实施例2 家蝇乙酰胆碱酯酶(AChE)基因的突变 根据蛋白结构与功能的关系，对AChE蛋白的结构进行模拟分析，最终确定对以下
位点的氨基酸进行定点突变改造 对于第180位氨基酸突变，设计如下引物P180V-up :5' -￡lCGGTGCTTTCGGTTTCCTGCATC-3， 突变位点P180V-dn :5' -TCTGTACTGGAACGAGGCAACGATC-3，
对于第327位氨基酸突变，分别设计如下引物
Y327D-up :5' -^ATCCCTCGGCTCCAACCATCGAT-3'
突变位点Y327D-dn :5' ACTTAAAATTCCAGAATACGAGTTC3'
对于第374位氨基酸突变，设计如下引物
I374D-up :5' -^ATGATTATTTCGATAAGGATGATG-3'
突变位点 I374D-dn :5' AAAGTCGTAGAGCAGAAAATATGTGC3' 利用反向PCR法依次对上述位点进行突变，具体操作步聚按TOYOBO定点突变试剂
盒说明书进行(购自TOYOBO公司)，并进行测序验证，最终获得含有预期突变位点的AChE
基因序列。 实施例3 家蝇乙酰胆碱酯酶(AChE)基因表达载体的构建 根据酶母表达载体pPIC9K(购自Invitrogen公司)的多克隆位点，设 计并合成 一 对引物PI :5' AAAAGAATTC(EcoRI)ATGACAGATCATCTAACGGTTC3'禾P P2 : 5' AAAAGCGGCCGC (Notl) TTACTGGAAGATAGAGTTGAC3'，在5'端分别弓|入酶切位点EcoR I和 Not I。以含有AChE基因的质粒为模板进行PCR扩增，扩增的产物采用EcoR I和Not I进 行双酶切，酶切产物与同样进行双酶切后的载体pPIC9K连接，转化大肠杆菌感受态细胞， 挑取阳性克隆进行酶切鉴定并测序，图2为重组表达质粒的酶切鉴定图。构建得到的载体 分别命名为pPIC9K-AChE和pPIC9K-VDD(突变位点为P180V， Y327D和I374D)。
实施例4 线性化质粒电转化毕赤酵母 在50ml三角瓶中加入5mlYPD，将毕赤酵母(Pichia pastoris) SMD1168单菌落接 种其中，振荡培养过夜(3(TC，200rpm)。取0. 1_0. 5ml菌液，接种在100ml新鲜培养液中，再 次剧烈振荡培养过夜，至0D6。。 = 1. 3-1. 5。离心(4。C，5000rpm，5min)，用100ml预冷的无菌水重悬细胞沉淀。离心(4t:，5000rpm，5min)，用50ml预冷的无菌水重悬细胞沉淀。离心 (4°C ， 5000rpm， 5min)，用4ml预冷的1M山梨醇重悬细胞沉淀。离心(4°C ， 5000rpm， 5min)， 用200ul预冷的1M山梨醇重悬细胞沉淀。 取80ul经上述处理的酵母细胞悬液，与线性化质粒(5-20ug)混合。将混合物转 移至预冷的电转化杯中。冰上放置5min。用电转化仪(购自E卯endorf公司)进行电转 化(参数2KV， 200 Q ， 25uF)。在电转化杯中迅速加入lml预冷的1M山梨醇，颠倒数次，以 混合细胞，冰浴数分钟，取250 ii 1等份，涂布于MD平板，温育(30°C ， 3-4d)至菌落出现。
实施例5 诱导甲醇酵母细胞表达家蝇乙酰胆碱酯酶(AChE)蛋白 即使在同一个转化事件中，外源基因也可能以多种形式发生重组，不同的重组子 表达外源蛋白的效率不同。实验中，挑选1000个酵母重组子，诱导其表达AChE，筛选表达水 平高的重组子。为保证表达活力，从平板上挑选新鲜的单菌落，或从-7(TC冻存的菌种中挑 取一部分培养，诱导外源蛋白表达过程如下 从MD平板上挑取单菌落，接种于25ml的BMGY中，振荡培养(28 °C ， 250rpm)，至 0D6。。 = 2 (约18h)，细胞处于对数增长期。离心(室温，5000rpm， 5min)，收集细胞。用50ml B匪Y重悬细胞沉淀，至ODe。。二 1。将菌液转移至另一个三角瓶，用两层纱布盖住瓶口，继续 振荡培养。为持续诱导表达，每2处补充甲醇，使其终浓度为0.5%。为确定最佳诱导时间， 分别在诱导后第48、72、96、 120、 144小时，收集500ul培养物，转入1. 5ml离心管，离心(室 温，13000rpm，2min)，将上清转移至另一离心管，取出一部分用于SDS-PAGE电泳分析蛋白 表达情况，结果表明，含有AChE或突变AChE基因的重组酵母在67kD左右出现特异性表达 条带，与预期蛋白大小相符(参见图3)。
实施例6 家蝇乙酰胆碱酯酶(AChE)酶活的测定 吸取20 ii 1酵母培养液，加入96孔酶标板的对应微孔中，25°C ，放置5min。在孔中 加入180 ii 1 Ellman试剂(20mM ATChI， 20mM DTNB， 0. 1M磷酸钠缓冲液)，混匀，立即将96 孔板置于酶标仪中，测定405nm波长下3min的吸光值。每个时间点的收集样品平行测定3 次。测定的结果表明工程菌株中表达的乙酰胆碱酯酶都具有较高的活性，突变后的乙酰胆 碱酯酶比突变前的活性高，对低浓度的有机磷和氨基甲酸酯类农药更敏感，可以用来对蔬 菜、瓜果中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留进行检测。 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。 附本发明所涉及的核苷酸/氨基酸序列表
〈110〉上海市农业科学院 〈120〉 一种突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因及其表达
〈160>4 〈170>PatentIn version 3. 3
7
〈210>SEQ IDNO. 1〈211>612〈212>PRT〈213>家虫虽(Musca domestica)〈220〉〈221>CHAIN〈22:..(612)〈400>1MetThrAspHisLeuThrValGinThrThrSerGlyProValArgGly151015ArgSerValThrValGinGlyArgAspValHisValPheThrGlylie202530ProTyrAlaLysProProValAspAspLeuArgPheArgLysProVal354045ProAlaGluProTrpHi s Gly Val Leu Asp Ala Thr Arg Leu Pro Ala
505560ThrCysValGinGluArgTyrGluTyrPheProGlyPheSerGlyGlu65707580GluMetTrpAsnProAsnThrAsnValSerGluAspCysLeuPheMet859095AsnlieTrpAlaProAlaLysAlaArgLeuArgHisGlyArgGlyThr100105110AsnGlyGlyGluHisSerSerLysThrAspGinAspHisLeulieHis115120125SerAlaThrProGinAsnThrThrAsnGlyLeuProlieLeulieTrp130135140lieTyrGlyGlyGlyPheMetThrGlySerAlaThrLeuAsplieTyr145150155160AsnAlaGlulieMetSerAlaValGlyAsnVallieValAlaSerPhe165170175GinTyrArgProGlyAlaPheGlyPheLeuHisLeuSerProValMet180185190ProGlyPheGluGluGluAlaProGlyAsnValGlyLeuTrpAspGin195200205AlaLeuAlaLeuArgTrpLeuLysGluAsnAlaArgAlaPheGlyGly210215220AsnProGluTrpMetThrLeuPheGlyGluSerAlaGlySerSerSer225230235240ValAsnAlaGinLeuMetSerProValThrArgGlyLeuValLysTrp
8
245250255 [o川]GlyMetMetGin 260SerAlaThrMetAsn 265AlaProTrpSerHis 270MetThrSerGluLysAlaValGlulieGlyLysAlaLeuValAsnAspCysAsn275280285CysAsnAlaSerLeuLeuProGluAsnProGinAlaValMetAlaCys290295300MetArgGinValAspAlaLysThrlieSerValGinGinTrpAsnSer305310315320TyrSerGlylieLeuSerTyrProSerAlaProThrlieAspGlyAla325330335PheLeuProAlaAspProMetThrLeuLeuLysThrAlaAspLeuSer340345350GlyTyrAsplieLeulieGlyAsnValLysAspGluGlyThrTyrPhe355360365LeuLeuTyrAspPhelieAspTyrPheAspLysAspAspAlaThrSer370375380LeuProArgAspLysTyrLeuGlulieMetAsnAsnliePheGinLys385390395400AlaSerGinAlaGluArgGluAlalieliePheGinTyrThrSerTrp405410415GluGlyAsnProGlyTyrGinAsnGinGinGinlieGlyArgAlaVal420425430GlyAspHisPhePheThrCysProThrAsnGluTyrAlaGinAlaLeu435440445AlaGluArgGlyAlaSerValHisTyrTyrTyrPheThrHisArgThr450455460SerThrSerLeuTrpGlyGluTrpMetGlyValLeuHisGlyAspGlu465470475■lieGluTyrPhePheGlyGinProLeuAsnAsnSerLeuGinTyrArg485490495ProValGluArgGluLeuGlyLysTrpMetLeuAsnSerVallieGlu500505510PheAlaLysSerGlyAsnProAlaValAspGlyGluGluTrpProAsn515520525PheSerLysGluAspProValTyrTyrValPheSerThrAspGluLys530535540lieGluLysLeuGinArgGlyProLeuAlaLysTrpCysSerPheTrp545550555560
Asn Asp Tyr Leu Pro Lys Val ArgSer Trp lie Gly Ser Glu Cys Glu565570575Asn Lys Ser Ser Thr Ser Ala Ser Ala Ala lie Tyr Glu Met Lys Met580585590Gin Gin Leu Thr Leu Leu Ala ValAla lie lie Leu Thr Met Val Asn595600605Ser lie Phe Gin610〈210>2〈211>1839〈212>DNA〈213>Muscadomestica〈220〉〈221>gene〈222〉 (1) (1839)〈400>2atgacagatcatcteacggttcaaacgaccagcggtccagteagagg朋g atcggttecc60gttcagggtegagatgtecacgtcttteccggcattccgtatgccaagcc tcctgttgat120gatttgagattcag朋朋cctgtecctgctgaaccttggcatggtgtcct agatgcaact1803g3CtgCC3gcaacatgcgttetgagtecttccctggctt ttccggtgaa240g卿tgtgg3atccteacacaaatgtetctg朋gattgtttgtttetgaa tetctgggct300cctgcteaggc朋gattgag3catggteg3gg朋cc朋tggtggtgagca ttcatcte朋3603CCg3tC3ggaccattteatccategcgcaactccacagaacaccaccaa cggtttgcct420atctteatctggatttetggcggtggctttatgactggctcagccacatt ggacatttec■朋CgC3g3g3ttetgtcggccgtgggc朋tgtgatcgttgcctcgttcca gtecagaccc540ggtgctttcggtttcctgcatctttcacctgttetgccaggttttg朋ga ag朋gctccc600ggc雄gtgggcctttgggatcaggccttggccttgagatggctc朋gga g朋tgCC3g3660gcctttggtggcaatcctga3tgg￡ltg￡lCgctgtttggtgaatcggctgg ttcgagttcc720gtgaatgctcaactgatgtctcctgtcacg卿ggcctggtcaaatgggg tetgatgcag780tcggccacaatgaatgctccctggagccac3tg3C3tC3g卿郷ctgt tg卿ttggt840朋ggctttggtcaacgactgteactgteatgcctcattgttecctgagaa tccacaagct■gtcatggcttgtetgagacaggtcgatgctaagaccatctctgtccaaca atggaactcg960tettctggaatttteagttetccctcggctccaaccatcg atggagcatt cttgcctgca1020gatcc朋tgaccctgttgaagaccgcagaccttegtggtt acgatettct gattggaaat1080gtte朋gatg朋ggcacatettttctgctctecgacttte ttgattettt cgataaggat1140gatgctecatccttgccaagagac朋gtecctggagatca tg朋C朋C3t CttCC3g3朋1200gccagtc朋gagcaattetcttccagteca c朋gttggga gggteatcca1260ggcteccaga3tC3gC朋C3gatcggtega gctgtgggtg atcacttttt cacctgtccc1320atgcccaggcattggctgaa agaggtgcttctgttcacte ctectecttc1380
3cccateg朋ccagcacctcattgaatatttcttcggtcag3gtteggc3朋tggatgctgttgatggcg朋g朋tggcc朋attg朋朋aacgactacctgccteaagtacatccgcttccgcagctetgcaatcatcttgaccatggt〈210>3〈211>612〈212>PRT〈213>Muscadomestica〈220〉〈221〉MUTAGEN
〈222〉 (180) . (180)〈223>P-V〈220〉〈221〉MUTAGEN
〈222〉 (327) . (327)〈223>Y-D〈220〉〈221〉MUTAGEN
〈222〉 (374) . (374)〈223>I-DMet Thr Asp His Leu
15
0213: 0214: 0215: 0216: 0217: 0218: 0219: 0220: 0221: 0222: 0223: 0224: 0225'
attgtggggc gaatggatgg gtgtcttgca cggcgatgaa 1440
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Thr Val Gin Thr
Arg Ser Val Pro
Tyr
Pro
Thr 65 Glu
Ala 35 Glu
Thr
20
Lys
Pro
Ala 50
Cys Val Gin
Met
Trp Asn lie Trp Asn Gly Gly
Asn
Ala 100 Glu
Val
Pro
Trp
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Pro
85
Pro
His
Gin Gly
Pro Val
His Gly
55 Arg Tyr 70
Asn Thr Ala Lys Ser Ser
Arg
Asp
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Ala
Lys
Asp
25
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Leu
Tyr
Val
Arg 105 Thr
Thr
10
Val
Leu
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Phe
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90
Leu
Asp
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60 Pro Gly 75
Glu Asp Arg His Gin Asp
Pro
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Arg
45
Arg
Phe
Cys
Gly
His
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Thr Gly lie 30
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Leu Pro Ala
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Leu Phe Met 95
Arg Gly Thr 110
Leu lie His
115120125SerAlaThrProGinAsnThrThrAsnGlyLeuProlieLeulieTrp130135140lieTyrGlyGlyGlyPheMetThrGlySerAlaThrLeuAsplieTyr145150155160AsnAlaGlulieMetSerAlaValGlyAsnVallieValAlaSerPhe165170175GinTyrArgValGlyAlaPheGlyPheLeuHisLeuSerProValMet180185190ProGlyPheGluGluGluAlaProGlyAsnValGlyLeuTrpAspGin195200205AlaLeuAlaLeuArgTrpLeuLysGluAsnAlaArgAlaPheGlyGly210215220AsnProGluTrpMetThrLeuPheGlyGluSerAlaGlySerSerSer225230235240ValAsnAlaGinLeuMetSerProValThrArgGlyLeuValLysTrp245250255GlyMetMetGinSerAlaThrMetAsnAlaProTrpSerHisMetThr260265270SerGluLysAlaValGlulieGlyLysAlaLeuValAsnAspCysAsn275280285CysAsnAlaSerLeuLeuProGluAsnProGinAlaValMetAlaCys290295300MetArgGinValAspAlaLysThrlieSerValGinGinTrpAsnSer305310315320TyrSerGlylieLeuSerAspProSerAlaProThrlieAspGlyAla325330335PheLeuProAlaAspProMetThrLeuLeuLysThrAlaAspLeuSer340345350GlyTyrAsplieLeulieGlyAsnValLysAspGluGlyThrTyrPhe355360365LeuLeuTyrAspPheAspAspTyrPheAspLysAspAspAlaThrSer370375380LeuProArgAspLysTyrLeuGlulieMetAsnAsnliePheGinLys385390395400AlaSerGinAlaGluArgGluAlalieliePheGinTyrThrSerTrp405410415GluGlyAsnProGlyTyrGinAsnGinGinGinlieGlyArgAlaVal420425430
12
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GGCATTCCGT ATGCCAAGCC TCCTGTTGAT 120GAACCTTGGC ATGGTGTCCT AGATGCAACT 180TATGAGTACT TCCCTGGCTT TTCCGGTGM 240GAAGATTGTT TGTTTATGAA TATCTGGGCT 300GGAACCAATG GTGGTGAGCA TTCATCTAAA 360ACTCCACAGA ACACCACCAA CGGTTTGCCT 420ATGACTGGCT CAGCCACATT GGACATTTAC 480GTGATCGTTG CCTCGTTCCA GTACAGACCC 540GTTATGCCAG GTTTTGAAGA AGAAGCTCCC 600GCCTTGAGAT GGCTCAAGGA GAATGCCAGA 660CTGTTTGGTG AATCGGCTGG TTCGAGTTCC 720AGAGGCCTGG TCAAATGGGG TATGATGCAG 780ATGACATCAG AGAAGGCTGT TGAGATTGGT 840GCCTCATTGT TACCTGAGAA TCCACAAGCT 900AAGACCATCT CTGTCCAACA ATGGAACTCG 960CCMCCATCG ATGGAGCATT CTTGCCTGCA 1020CTTAGTGGTT ACGATATTCT GATTGGAMT 1080TACGACTTTG ATGATTATTT CGATMGGAT 1140CTGGAGATCA TGMCMCAT CTTCCAGAM 1200TTCCAGTACA CMGTTGGGA GGGTMTCCA 1260GCTGTGGGTG ATCACTTTTT CACCTGTCCC 1320AGAGGTGCTT CTGTTCACTA CTACTACTTC 1380GMTGGATGG GTGTCTTGCA CGGCGATGM 1440MTTCACTGC MTACAGACC TGTGGAMGA 1500ATTGMTTTG CCAMTCTGG CMCCCTGCC 1560MGGMGATC CCGTTTACTA TGTCTTCAGT 1620GGTCCATTGG CCAMTGGTG CTCATTCTGG 1680ATTGGTTCCG MTGTGMM CMMGCTCA 1740MGATGCMC AGCTGACCTT GCTGGCTGTG 1800TTCCAGTM 1839
权利要求
一种突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，其特征在于，它是在现有的家蝇乙酰胆碱酯酶基因的基础上，对其进行氨基酸定点突变而得，所述突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2. 根据权利要求1所述的突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
3. 根据权利要求1所述的突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，其特征在于，所述的氨基酸定点突变发生在序列SEQ ID NO. 1的第180、327和374三个位点。
4. 根据权利要求1所述的突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，其特征在于，所述的氨基酸定点突变如下在第180位用缬氨酸V取代脯氨酸P，在第327位用苯丙氨酸F取代酪氨酸Y，在第327位用天冬氨酸D取代酪氨酸Y，在第374位用天冬氨酸D取代异亮氨酸I 。
5. 包含权利要求1所述突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因的载体。
6. 根据权利要求5所述的载体，其特征在于，该载体为pPIC9K。
7. 权利要求1所述的突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因表达的蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1) 、利用反向PCR法依次对序列SEQ ID NO. 1的第180位、327位和374位3个位点进行突变，得到突变后的乙酰胆碱酯酶基因序列并测序验证；2) 、将编码具有突变乙酰胆碱酯酶基因的核苷酸序列连接于表达载体pPIC9K中，形成家蝇乙酰胆碱酯酶表达载体；3) 、将上述表达载体转入酵母宿主细胞中，形成家蝇乙酰胆碱酯酶的重组细胞；4) 、在适合乙酰胆碱酯酶表达的条件下，培养上述的重组细胞；5) 、分离出具有家蝇乙酰胆碱酯酶蛋白活性的多肽。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的酵母宿主细胞含有如权利要求2所述的SEQ ID NO. 4核苷酸序列分子，或者含有权利要求1所述具有SEQ ID NO. 3的氨基酸序列的载体。
9. 根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述的酵母宿主细胞包括真核细胞或原核细胞。
10. 根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的真核细胞为酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
11. 根据权利要求io所述的制备方法，其特征在于，所述的原核细胞为大肠杆菌或枯草杆菌。
12. 权利要求1所述的突变的家蝇乙酰胆碱酶基因在酵母表达系统中的应用。
13. 权利要求1所述的突变的家蝇乙酰胆碱酶基因在有机磷和氨基甲酸酯类农药检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因及其表达。所述基因是在现有的家蝇乙酰胆碱酯酶基因的氨基酸序列SEQ ID NO.1的第180、327和374三个位点发生氨基酸定点突变而得。所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该基因能在酵母表达系统中快速高效地获得表达。本发明的突变的乙酰胆碱酯酶基因对低浓度的有机磷及氨基甲酸酯农药具有显著的敏感性，可以用于农产品中农药残留的检测，为研制农药生物学检测产品提供更为灵敏的蛋白酶材料，具有很大的应用价值。
文档编号C12N15/55GK101712963SQ20091020068
公开日2010年5月26日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者刘华, 吴潇, 唐雪明, 朱宏, 王利刚, 王金斌, 蒋玲曦, 谭芙蓉, 赵凯, 陶世如 申请人:上海市农业科学院