专利名称：：骨桥蛋白三个转录本快速诊断试剂盒及其使用方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及骨桥蛋白三个转录本快速诊断试剂盒。
背景技术：
：选择性剪接(Alternativesplicing)是基因的一种基本而又重要的调控机制；基因选择性剪接与许多人类疾病密切相关，目前对基因选择性剪接现象的研究已经成为后基因组研究的重要组成部分。人类基因组中有70%以上的基因存在不同剪接变异体，即同一个基因由于选择性剪接机制作用产生不同mRNA，这些mRNA表达的蛋白或者缺失或增加某一段氨基酸，导致某些功能区域丢失或增加，使得不同剪接变异体具有不同的功能。例如，p63转录本(亚型)ANP63主要参与肿瘤的发生发展；TAP63通过激活p53诱导细胞周期阻遏和引发细胞凋亡。可见需要对基因尤其是疾病相关基因各个转录本进行特异性检测分析，才能精确判断与疾病相关的转录本，真正对疾病诊断和治疗提供准确、精细的基因靶标。骨桥蛋白(osteopontin，0PN)是一种分泌性钙结合糖磷酸化蛋白，通过与与整合素、CD44等多种受体因子结合进而促进细胞趋化、粘附、迁移、增殖和血管生成。研究均表明在乳腺癌、胶质瘤、肝癌等多种人类恶性肿瘤中0PN呈现高表达。OPN被RNA干扰沉默后肿瘤细胞生长和侵袭能力明显减弱，说明OPN在肿瘤发生发展中扮演着重要的角色。另外发现OPN在人体内的功能呈"双刃剑"即可诱导巨噬细胞发挥抗肿瘤免疫作用同时又可抑制巨噬细胞而抑制抗肿瘤免疫作用。究其原因可能是由于OPN基因不同剪接变异体(转录本)存在所致。NCBI上报道OPN含有三个转录本OPN-a(版本l，NMJ)01040058.1)涵盖全部的6个外显子；OPN-b(版本2，NM_000582.2)第4个外显子缺失，缺少72个氨基酸，216个核苷酸；OPN-c(版本3，NM_001040060.1)第3个外显子缺失，缺失58个氨基酸，175个核苷酸。在乳腺癌组织中发现OPN-c呈现高表达，且其表达量与病人愈后呈现负相关。再次表明基因转录本的研究对于肿瘤的精确诊断、治疗均具有重大的价值和意义。针对转录本的特异抗体制备无论在技术和时间上均受到限制，而Real-timePCR技术是基因mRNA进行定量的快速方法，而且能间接反映蛋白水平。近年来Real-timePCR技术被用于肿瘤检测，敏感性比免疫组化提高10100倍，在基因表达水平分析和定量检测等方面被广泛应用。该技术的关键是要获得特异性引物，由于基因不同转录本之间核苷酸差异不会很大，所以设计针对不同转录本的引物，获得特异性强的引物相对困难。我们实验室通过专业软件和丰富的real-timePCR引物设计经验获得针对OPN三个转录本的特异性引物。结合SYBR-Green法获得特异检测OPN三个转录本的real-timePCR试剂盒，SYBR-Green是一种荧光染料，溶液中的SYBR-Green几乎不发任何荧光，但它嵌入到双链DNA分子中，构象发生变化，能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光。SYBR-Green几乎不影响PCR反应，它在延伸阶段嵌合到DNA上，由于每个双链DNA分子能够结合的数目是一定的，所以通过荧光的增加可以反映PCR产物的增加。
发明内容本发明的目的在于提供一套快速定量检测肿瘤0PN三个转录本的诊断试剂盒，通过对OPN三个转录本的定量，鉴定不同肿瘤中OPN三个转录本的表达水平，既为肿瘤早期诊断和愈后提供重要的辅助指标，又可根据肿瘤当前的主要生物特征指导肿瘤用药，提高药效、减少毒副作用。本发明的另外目的在于提供OPN三个转录本定量检测试剂盒的使用方法及其应用。本发明一方面提供了一种OPN三个转录本快速定量试剂盒，包括OPN三个转录本的特异性引物组。所述OPN三个转录本的特异性引物组包括OPN三个转录本OPN-a、OPN-b和OPN-c的特异性引物。所述OPN-a的特异性引物优选正向引物5'-GCTTTACAACAAATACCCAGATGC-3'(SEQIDN0:1);反向引物5'-TGGACTTACTTGGAAGGGTCTC-3'(SEQIDNO:2)。所述OPN-b的特异性引物优选正向引物5'-AGGCTGATTCTGGAAGTTCTG-3'(SEQIDN0:3);反向引物5'-TGGACTTACTTGGAAGGGTCTG-3'(SEQIDNO:4)。所述OPN-c的特异性引物优选正向引物5'-TGAGGAAAAGCAGAATGCTG-3'(SEQIDN0:5);反向引物5'-GTCAATGGAGTCCTGGCTGT-3'(SEQIDNO:6)。OPN三个转录本的特异性引物组是本发明试剂盒的关键，基于试剂盒采用的是实时定量PCR来进行定量检测，所以试剂盒中还可以包括其他一些试剂，如总RNA抽提试剂、RNA逆转录试剂、标准品、内参基因引物以及以SYBR-Green为染料的Real-timePCR反应试剂中的一种或多种。具体需要将那些试剂装配入试剂盒，可以根据实际需要配置。所述总RNA抽提试剂可采用各种常规的抽提RNA的试剂，优选Trizol总的RNA抽提液，该抽提液可市购获得。所述RNA逆转录试剂可选用常规的用于RNA逆转录的试剂，包括逆转录酶、逆转录引物、dNTP、RNasin等，所述逆转录酶优选M-MLV，该酶可市购获得。所述逆转录引物优选OligodT。所述以SYBR-Green为染料的Real-timePCR反应试剂主要包括Taq酶、缓冲体系及Sybr-Green荧光染料，此类反应试剂为已知技术，如可采用SYBRpremixexTag，此产品可由TAKARA公司购得。所述内参基因引物为任一管家基因的引物，内参基因引物的设计可采用公知技术，如人的P-Actin的引物正向引物5'-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3'(SEQIDNO:7);反向引物5'-AAGGTAGTTTCGTGGATGCC-3'(SEQIDNO:8)。所述标准品包括分别用OPN三个转录本质粒配置的不同稀释浓度的溶液。标准品还可包括用内参基因质粒配置的不同稀释浓度的溶液。优选的，标准品的浓度为1X1(^-1X1(T拷贝/ml。OPN三个转录本质粒可经市购途径获得，如由上海吉盛生物科技有限公司购得。所述试剂盒中还含有阴性对照。阴性对照为不含OPN任何转录本的样品(标准品的空载体)。本发明第二方面，公开了上述试剂盒的使用方法，包括下列步骤1)采用总RNA抽提液抽提样本总RNA;2)以步骤1)获得的样本总RNA为模板，用逆转录酶及逆转录引物逆转录获得cDNA;3)Real-timePCR:分别以步骤2)获得的cDNA及标准品为模板，分别加入0PN三个转录本的特异性引物及内参基因引物后，再与以SYBR-Green为染料的Real-timePCR反应试剂混合进行Real-timePCR及检测；4)对步骤3)的检测结果进行数据分析。根据绘制的标准曲线得到OPN三个转录本及内参对应管家基因表达的相对浓度，以OPN三个转录本和管家基因的相对浓度的比值反映OPN三个转录本的相对表达量。较佳的，上述步骤3Real-timePCR的反应条件为95。C变性15秒；95°C5秒；60°C，30秒，共40循环；每个循环后自动读数1次，72t:30秒处采集荧光信号。较佳的，上述步骤3Real-timePCR的反应体系为SYBRpremixextag10ii1;正反引物各0.25;模板1.0;总体积201;其余用灭菌双蒸水补平。较佳的，步骤4采用2-AACt分析；制图软件为Gr即hPadPRISM4.0。所述样本可为人的组织、血液或细胞。OPN在大多数肿瘤中高表达，通过对肿瘤患者的外周血、肿瘤组织、分泌液等标本进行OPN三个转录本的表达检测，结合随访资料获得三个转录本与肿瘤生物特征的相关性，可以辅助肿瘤的诊断和愈后治疗。本发明优点1、本试剂盒具有极高的特异性2、可以对肿瘤生物特性进行辅助鉴别(肿瘤生物特征与OPN三个转录本表达量相关)3、该检测方法灵敏度高、定量准确4、该检测方法步骤简单、耗时短5、用于检测的样品量极少6、可检测多种样品(肿瘤组织、外周血、分泌液等均适用)7、可同时高通量对样品进行检测图1为0PN三个转录本mRNA的差异比较图图2为0PN三个转录本对应引物PCR产物琼脂糖电泳图标注为1.opn-a扩增产物；2.opn-b扩增产物；3.opn-c扩增产物；M.DNAmarker图3为0PN三个转录本对应引物溶解曲线图图4为试剂盒制备及使用流程具体实施例方式以下列举具体实例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。实施例1:OPN三个转录本定量检测试剂盒制备1、0PN三个转录本特异引物设计、合成、检测针对0PN三个转录本mRNA的差异序列(图1及下表)进行引物设计及合成；<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述引物合成后，分别置于密闭容器中或配对混合后分别置于密闭容器中即获得OPN三个转录本的特异性引物组，装配获得试剂盒。也可按需要与其他独立置于密闭容器中的试剂一起装配入试剂盒。内参Actin引物信息<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>针对OPN三个转录本的三对引物和针对内参基因如P-Actin-的一对引物分别进行PCR。以待测样品的cDNA和标准品为模板分别进行PCR。反应条件循环1:(IX)步骤195.0。C时间15s循环2:(40X)步骤1:95.0°C时间5s步骤2:60.0°C时间30s收集数据并进行分析[ooee]制作熔解曲线(结果如图3所示)循环3:(IX)步骤1:95.0°C时间lmin循环4:(IX)步骤1:55.0°C时间lmin步骤2:,60.0。C时间10s循环5:(81X)步骤1:55.0-95.0°C时间..30s每个循环升高0.5"C实施例2:OPN三个转录本快速定量试剂盒检测组织样本1、样品准备微量样品即可，可以是新鲜肿瘤组织或液氮保存的肿瘤组织，也可以是外周血；每次均设阴性对照组和阳性对照组，标准品用灭菌双蒸水稀释为1X1021X109拷贝/ml。待测样本组织样品阴性对照质粒空载体阳性对照标准品2、总RNA抽提(根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行)1)将全部组织块用机械匀浆器彻底匀浆，溶解于Trizol中，室温静置5min，然后转移至新的1.5ml印pendorf管中2)每管加入200ii1氯仿，用手上下颠倒印pendorf管15s，室温静置lOmin3)4°C，12000rpm，离心15min4)吸取上清移至新的1.5ml印pendorf管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4°C沉淀lOmin5)4°C，12000rpm离心lOmin后，去上清6)加入至少1ml75%乙醇(用DEPC处理过的水新鲜配制)，洗涤沉淀7)4°C，10000rpm离心5min，弃去大部分上清88)4°C，lOOOOrpm再次离心5min，吸去上清9)室温干燥10)待RNA基本透明时，加入20ii1RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度3、cDNA获得(逆转录反应)RNA逆转录获得cDNA(根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行)M-MLV逆转录酶和dNTP购自Promega公司，OligodT购自上海生工，RNase-free的物品都购自Axygen，具体步骤如下l)将lylOligodT(O.5iig/ii1)禾P2.OilgTotalRNA加入到PCR小管中，补充RNase-freeH20至9ul;混匀后离心，70。C温浴lOmin;之后立即置于(TC冰水混合物中冰浴，使01igodT和模板退火2)按下表的比例配制反应体系(冰上进行)，混匀，短暂离心试剂每管加入量5XRTbuffer4ii110mMd證s2ii1RNasin0.5ii1M-MLV-RTase1ii1RNA-freeH203.5ii13)上述体系在42t:反应lh，然后在7(TC水浴锅中水浴lOmin使RT酶失活4)将得到的RT产物一cDNA置于-8(TC保存备用4、SYBRGreenReal-timePCR(按实施例1中的"OPN三个转录本检测试剂盒反应体系和条件确定"中的反应体系及方法进行)5、统计方法Real-timePCR数值分析采用2_AACt分析法制图软件GraphPadPRISM4.06、0PN三个转录本表达的相对定量分析标准品的制备将从吉盛生物技术有限公司购得的质粒用灭菌双蒸水稀释为1X1021X1()9拷贝/ml。每次使用1份标准品分别对OPN三个转录本和Actin进行定量扩增，制作标准曲线。根据绘制的标准曲线回归公式得到OPN三个转录本及Actin基因表达的相对浓度，以二者的比值来反映OPN转录本的表达量，每个样品均设3个复孔。检测结果9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例3试剂盒特异性检验以实施例2中的组织样本cDNA为模板，用opn三转录本引物PCR扩增opn三转录本片段，扩增产物琼脂糖电泳，结果见图5:(标注说明1.opn-a扩增产物；2.opn-b扩增产物；3.opn-c扩增产物。)该结果说明，在opn三个转录本都有表达的组织样本中(参照实施例2的结果)，三个转录本引物只能特异性扩增出对应转录本的片段，而不能扩增出其他2个转录本的片段，表明该试剂盒对opn三转录本的表达是特异性的。0105]序列表0106]<110>上海吉凯基因化学技术有限公司0107]〈120〉骨桥蛋白三个转录本快速诊断试剂盒及其使用方法0108]〈130>0811820109]〈160〉80110]<170>PatentInversion3.30111]〈210>10112]〈211>240113]〈212>DNA0114]〈213>artificialsequence0115]〈220〉0116]〈223〉引物0117]〈400>1:0118]gctttacaacaaatacccagatgc:0119]〈210>2:0120]〈211>22:0121]〈212>DNA:0122]〈213>artificialsequence:0123]〈220〉:0124]〈223〉引物:0125]〈400>2:0126]tggacttacttggaagggtctc:0127]<210>3:0128]〈211>21:0129]〈212>DNA〈213〉artificialsequence<220>〈223〉引物〈400>3aggctgat.tctggaagttctg〈210>4〈211>22〈212>DNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400>4tggacttacttggaagggtctg〈210>5〈211>20〈212>DNA〈213>artificialsequence〈220>〈223〉引物〈400>5tg3gg朋3agcag朋tgctg〈210>6〈211>20〈212>DNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400>6gtcaatggagtcctggctgt<210〉7〈211>20〈212>DNA〈213>artificialsequence〈220>〈223〉引物〈400>7tcgtgcgtgacattaaggag〈210>8〈211>20〈212>DNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400>8aaggtagtttcgtggatgcc权利要求一种OPN三个转录本快速定量试剂盒，包括OPN三个转录本的特异性引物组。2.如权利要求1所述OPN三个转录本快速定量试剂盒，其特征在于，所述OPN三个转录本的特异性引物组包括OPN三个转录本OPN-a、OPN-b和OPN-c的特异性引物。3.如权利要求2所述0PN三个转录本快速定量试剂盒，其特征在于，所述OPN-a的特异性引物为正向引物5'-GCTTTACAACAAATACCCAGATGC-3';反向引物5'-TGGACTTACTTGGAAGGGTCTC-3';所述OPN-b的特异性引物为正向引物5'-AGGCTGATTCTGGAAGTTCTG-3';反向弓|物5'-TGGACTTACTTGGAAGGGTCTG-3';所述OPN-c的特异性引物为正向引物5'-TGAGGAAAAGCAGAATGCTG-3';反向引物5，-GTCAATGGAGTCCTGGCTGT-3，。4.如权利要求1-3任一所述OPN三个转录本快速定量试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括总RNA抽提试剂、RNA逆转录试齐U、标准品、内参基因引物、阴性对照以及以SYBR-Green为染料的Real-timePCR反应试剂中的一种或多种。5.如权利要求4所述0PN三个转录本快速定量试剂盒，其特征在于，所述总RNA抽提试剂为Trizol总的RNA抽提液。6.如权利要求4所述OPN三个转录本快速定量试剂盒，其特征在于，所述RNA逆转录试剂包括逆转录酶M-MLV，及逆转录引物01igodT。7.如权利要求4所述0PN三个转录本快速定量试剂盒，其特征在于，所述以SYBR-Green为染料的Real-timePCR反应试剂为SYBRpremixexTag。8.如权利要求4所述0PN三个转录本快速定量试剂盒，其特征在于，所述内参基因引物为人的P-Actin的引物。9.如权利要求1-8中任一权利要求所述OPN三个转录本快速定量试剂盒的使用方法，包括下列步骤1)采用总RNA抽提液抽提样本总RNA;2)以步骤1)获得的样本总RNA为模板，用逆转录酶及逆转录引物逆转录获得cDNA;3)Real-timePCR:分别以步骤2)获得的cDNA及标准品为模板，分别加入OPN三个转录本的特异性引物及内参基因引物后，再与以SYBR-Green为染料的Real-timePCR反应试剂混合进行Real-timePCR及检测；4)对步骤3的检测结果进行数据分析，根据绘制的标准曲线得到OPN三个转录本及内参基因表达的相对浓度，以OPN三个转录本和内参基因的相对浓度的比值反映OPN三个转录本的相对表达量。10.如权利要求9所述的OPN三个转录本快速定量试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤3)Real-timePCR的反应条件为95。C变性15秒；95。C5秒；60。C，30秒，共40循环；每个循环后自动读数1次，72t:30秒处采集荧光信号。11.如权利要求9所述的OPN三个转录本快速定量试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤4)采用2-AACt分析；制图软件为Gr即hPadPRISM4.0;所述样本为人的组织、血液或细胞样本。全文摘要本发明公开一种特异快速检测OPN三个转录本的试剂盒，包括试剂盒制备、组成及使用方法。该试剂盒能精确对OPN三个转录本进行定量，1.5h即可出结果。该试剂盒适用于临床及科研中对各种标本包括外周血、肿瘤组织、分泌液等进行OPN三个转录本的快速定量检测；以期通过此试剂盒检测结果判断肿瘤的生物特性，指导肿瘤诊断和治疗及愈后判断。文档编号C12N15/11GK101787393SQ20091020072公开日2010年7月28日申请日期2009年12月24日优先权日2009年12月24日发明者曹跃琼,杨敏,逄淑召,郑梅珍,高博申请人:上海吉凯基因化学技术有限公司