专利名称：rpsL基因和多克隆位点融合的新型克隆载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一个rpsL基因和多克隆位点融合的新型 克隆载体pLS975。
背景技术：
基因克隆是分子生物学，生物化学研究的虽基本操作之一，保证高效的克隆效率 是后续实验的基础。 目前最为常用的克隆载体如pUC系列和pBluescript系列，所采用的筛选克隆 的方法为蓝白斑筛选。蓝白斑筛选的原理是，载体含有的LacZa片段可以和菌株LacZ
基因c-端互补而得到功能性的e-半乳糖苷酶，e-半乳糖苷酶可被培养基中添加的
IPTG (异丙基硫代-13 —D-半乳糖苷)所诱导，催化分解生色底物X-gal (5-溴-4氯-3-吲 哚-P-D-半乳糖苷)，所得菌落为蓝色。而克隆了外源片段后，LacZa的读码框被破坏，这 样就不能和宿主菌中LacZ基因C-端互补，LacZ基因失活，不能表达功能性的P -半乳糖 苷酶。此时，IPTG和X-gal不起作用，所得菌株为白色。然而由于种种原因，蓝白斑筛选并 不能完全反应克隆的情形，即白斑有时并非重组克隆，有时需要筛选许多菌落才能得到重 组克隆，而这在需要克隆效率的构建文库实验中尤为不利。 另夕卜，IPTG和X-gal是价格昂贵的生化试剂，这也是限制pUC系列和pBluescript 系列广泛应用的原因之一。 rpsL基因(也称strA基因，大肠杆菌Escherichia coli MG1655基因组GanBank 登录号为U00096)是大肠杆菌等细菌的核糖体蛋白S12基因，为链霉素的作用位点。链霉 素和rpsL基因编码的核糖体蛋白S12结合后，起到抑制菌株生长的作用。菌株的rpsL基 因发生无义突变(即突变后失去功能而不能编码功能性的活性蛋白)，则表现链霉素抗性。
rpsL基因具有克隆实验中的负筛选标记功能，其作用原理是rpsL基因是显性基 因，当含有功能性rpsL基因的质粒载体转化至染色体上rpsL基因突变的菌株(如常用的 基因克隆宿主菌DH10B，是链霉素抗性)后，所得菌株表现功能性rpsL基因的表型，即对链 霉素敏感。rpsL基因的序列中含有Hpal，PvuII，Sphl，Pstl，Smal位点，当在这些位点插入 外源DNA片段后，几乎无例外地引起rpsL基因的失活，这样所获得菌株表现为链霉素抗性。
Dean(文献Dean D. A plasmid cloning vector for the direct selection of strainscarrying recombinant plasmids. Gene 1981 ;15(1) :99-102)首先利用rpsL基 因的负筛选功能，构建了质粒pN01517及其衍生的、去除部分片段的质粒pN01523。此类质 粒的缺点在于1.可供选择的克隆位点较少(pN01517只有Smal， Hpal， BamHI， BstEII和 SacII等少数几个位点，pN01523减少了一个BstEII位点);2.除克隆至Smal和Hpal位 点可以用链霉素抗性进行重组克隆的筛选外，克隆至其他的克隆位点没有筛选指征(如区 分克隆重组与否的颜色，抗性等)；3.克隆位点均相距较远，这样DNA片段克隆在这些位点 后，如再以其他的酶切出来，将带入较大的载体的片段，这样不利于进一步的克隆；4.没有 M13F， M13R， T7， T3等通用的测序引物序列，这样对克隆片段的测序造成困难；5.质粒较大(pN01523为52kb， pN01517则大于70kb)，拷贝数较低，操作不简便。 Hashimoto-Gotoh等(文献Hashimoto-Gotoh T， Kume A， Masahashi W et al.Improved vector, pHSG664， for direct streptomycin—resistance selection : cDNAcloning with G :C—tailing procedure and subcloning of double—digest DNA fragments. Gene 1986 ;41 (1) :125-8)扩展了此运用，他们构建了含rpsL基因、pUC9质粒 氨苄青霉素抗性基因和复制子的载体pHSG664(2. 7kb)。此质粒rpsL基因上的Hpal，Pvu11， Sphl， Pstl， Smal位点以及载体上的EcoRI， BamHI， SaII， Xbal， Hindlll共10个位点可用 于外源DNA的克隆。但pHSG664仍有着pN01517和pN01523的一些缺点，如没有rpsL基 因之外的克隆位点的筛选指征；没有多克隆位点序列，克隆位点的选择还不够多样化；除 BamHI， Sail, Xbal， Hindlll位点外，其他的克隆位点距离均较远；没有通用的测序引物序 列。 正是由于这些因素的制约，尤其是缺乏利用rpsL基因的负筛选标记的功能进行 克隆的多克隆位点，使得含有rpsL基因的克隆载体一直没有得到广泛的使用。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一个rpsL基因和多克隆位点融合的新型克隆载体 pLS975。 pLS975的结构如图2所示，它是对pN01517、pN01523和pHSG664的大幅改进。首 先通过重叠延伸PCR手段将一个多克隆位点序列插入至rpsL基因的启动子和开放阅读 框之间，再将此DNA片段克隆至去除了多克隆位点序列的高拷贝质粒pBluescript KS(-) 而获得了新型的克隆载体pLS975。在pLS975中，多克隆位点序列的序列和rpsL基因的 序列是在读码框内融合，融合基因保留了 rpsL基因的负筛选标记的功能。pLS975保留了 pBluescript KS(-)的优点，共用18个酶切位点可用于外源DNA片段的克隆，以氨苄青霉素 抗性和和lmg/ml的链霉素抗性进行重组克隆的筛选。以本载体进行基因克隆操作简便，重 组效率高(96% 100% )，可成为通用的克隆载体。 pLS975和同类型的pN01517， pN01523和pHSG664相比较，其突出的优点在于 1.含众多可供选择的多个克隆位点，即rpsL基因上的Hpal， Sphl， Pstl和Smal位点以及 多个克隆位点序列的Sacl， SacII， Notl， Xbal， Spel， BamHI， EcoRI， EcoRV， HindIII， Clal， HincII， SaII， Xhol和Kpnl共18个克隆位点。尽管和pHSG664相比，缺少PvuII位点，但 Smal， EcoRV和HincII均可以提供钝端克隆。2.克隆至每个位点均可用链霉素抗性进行 筛选；3.为高拷贝载体，大小适中，操作简便；4.原载体上的M13F，M13R，T7和T3等通用测 序引物仍然可以使用，相比较原pBluescript KS(-)载体，左右两侧引入的片段大小分别为 123bp和367bp，鉴于目前测序水平的大大提高，增加这些片段没有明显的影响。在克隆片 段较大的情况下，可从右侧设计一个测序引物或在测出一段序列后，再进行步移法测序。步 移法测序也是目前大片段克隆至通用载体的测序策略。 与目前最为常用的克隆载体如pUC系列和pBluescript系列相比，pLS975保留了 pBluescript系列的优点，其突出的改进是重组效率高，易于筛选重组克隆。在本专利申请 中，克隆1 3kb的片段的重组率为100% ，克隆较大的4 7kb片段的重组率也大于96% ， 只要筛选少数几个菌落就可得到重组克隆。构建DNA片段的基因文库时也确保有着很高的效率。 pLS975另外一个显著的优点是作为筛选试剂的链霉素价格低廉(加拿大BBI公司 的250克优质链霉素的价格是400元，链霉素的使用浓度为lmg/ml)，相比目前最为常用的 克隆载体如pUC系列和pBluescript系列所采用的筛选试剂IPTG和X-gal价格昂贵(25 克IPTG的价格是750元，1克X-gal的价格是400元，二者的使用浓度均为40 y g/ml)。按 每个筛选平板20ml培养基来计算，使用链霉素的价格还不到使用IPTG和X-ga的1/10。
图1是重叠延伸PCR的结果 其中 1. DL2000DNA分子量标准2. 0， 1. 0， 0. 75， 0. 5， 0. 25， 0. lkb 2.以RMP1和RMP2为引物，大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，PCR扩增得到
190bp ; 3.以RMP3和RMP4为引物，大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，PCR扩增得到
436bp ; 4.以RMP1和RMP4为引物，190bp和436bp为模板，PCR扩增得到596bp。 图2是rpsL基因和多克隆位点融合的新型克隆载体pLS975的质粒图谱 其中 600-616是测序引物M13F ; 626-645是T7启动子； 654-778是rpsL基因的启动子PrpsL ; 779-781是rpsL基因的起始密码子ATG ; 782-877是多克隆位点； 878-124是rpsL基因的开放阅读框； 1648-2315是3'端至5'端方向的载体复制子区域colEl ; 2463-33233'端至5'端方向的氨苄青霉素抗性基因的开放阅读框。 图3是雷帕霉素产生菌的基因组以BamHI酶切所得l 3kb DNA片段克隆至
pLS975的BamHI位点后，随机挑选的20个克隆，提取质粒后，以BamHI酶切与pLS975以
BamHI酶切的琼脂糖凝胶电泳图。 其中 1-10， 14-23. 20个随机克隆所得质粒以BamHI酶切 11. pLS975以BamHI酶切 12. DL2000DNA分子量标准2. 0， 1. 0， 0. 75， 0. 5， 0. 25， 0. lkb 13. ADNA/HindlIIDNA分子量标准23. 1，9. 4，6. 6，4. 4，2. 3，2. Okb 图4是雷帕霉素产生菌的基因组以BamHI酶切所得4 7kb DNA片段克隆至 pLS975的BamHI位点后，所得到的20个克隆重组克隆以BamHI酶切与pLS975以BamHI酶
切的琼脂糖凝胶电泳图。
其中 1-10， 14-23. 20个克隆重组克隆以BamHI酶切
11. pLS975以BamHI酶切 12. DL2000DNA分子量标准2. 0， 1. 0， 0. 75， 0. 5， 0. 25， 0. lkb 13.入DNA/Hindl11 DNA分子量标准23. 1， 9. 4， 6. 6， 4. 4， 2. 3， 2. Okb
具体实施例方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。 下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施 例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。 在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相 同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。 实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒 I.Escherichia coli MG155。原始大肠杆菌基因组测序菌株，基因型F—， LAM—， rph—。文献Blattner FR，Pl皿kett G，3rd，Bloch CA et al. The completegenome sequence of Escherichia coli K-12. Science 1997 ;277 (5331) :1453-62. 2. Escherichia coli DH10B。 基因型F—mcrA A (mrr-hsdRMS-mcrBC) 小80dlacZAM15 AlacX74 deoR recAl araD 139 A (ara， leu) 7697galU galK rpsL endAl皿pG.。文献:Life Technologies, Inc. Focus (1990) 12， 19。购自美国Invitrogen公司。 3. pBluescript KS (_)。 文献Alting-Mees， M. A. and Short, J. M. (1989) pBluescript II :gene mapping vectors. Nucleic Acids Res， 17， 9494。购自美国Novagen 公司。 实施例1 本发明所述rpsL基因和多克隆位点融合的新型克隆载体pLS975的构建过程如 下 1.大肠杆菌DH10B的电转化感受态的制备和DNA转化 自平板上接种新鲜划线培养的单菌落至2ml LB液体培养基中37。C振荡过夜，以 1/50体积转至50ml LB，振荡培养至菌体0D6。。约为0. 6。将菌液倒入预冷的离心管，冰浴10 分钟，4t:，5，000rpm离心5分钟，弃上清。以10%的甘油洗涤沉淀两次，最后悬浮于200 的10X甘油中，50ia每管分装。 将DNA加至50 ii 1冰上融化的DH10B的电转化感受态细胞中，轻弹混匀。将混 合液转移至冰上预冷的1mm电转杯中，电击转化。电转化条件1mm电转杯，200Q ， 1800V, Bio-Rad公司Gene Pulser IIK电转化仪。加lml LB液体培养基至电转杯，吹打混匀，将 溶液转移至一个无菌的1.5ml印pendorf管中，37t:振荡培养60分钟后，转化液涂布在含 100 g/ml氨苄青霉素的LB平板上，37t:培养。挑取单菌落，在含100 y g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中培养，提取质粒，酶切和测序鉴定。 LB培养基(每升)蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠NaCl 10克，加去离子 水至1升。固体培养时加1.5%的琼脂。
2.大肠杆菌中质粒提取和酶切鉴定 自含100 g/ml氨苄青霉素的LB平板接种单菌落至3ml含100 y g/ml氨苄青霉素 的LB液体培养基中，37。C振摇过夜，取1. 5ml至印pendorf管，13， 200rpm离心30秒，弃上 清，再短时离心，去除液滴。加入含RNase 100 y g/ml的溶液1100 yl，振荡悬浮，加入溶液 II 200iil，轻轻颠倒3 6次，加入溶液ni 150iil，颠倒混匀，13，200rpm离心5分钟，上 清转移至印pendorf管中，加入异丙醇300 y 1颠倒混匀，13， 200rpm离心10分钟，弃上清， 沉淀以500 ii 1的70%乙醇颠倒数次洗涤，13， 200rpm离心5分钟，再短时离心，吸除液滴， 室温10分钟至干，溶于50 ii 1 ddH20， 1 ii 1电泳检测，-20。C保存。
溶液I :25mM pH 8. OTris. Cl， 10mM pH8. OEDTA， 50mM葡萄糖；
溶液II :0. 2M NaOH， 1 % SDS ; 溶液III :49. 1克醋酸钾溶于ddH20后，加冰醋酸11. 5ml至总体积100ml。 质粒的酶切鉴定10iU反应体系中，加入酶切缓冲液liU，限制性内切酶
0. 3 iil， DNA若干ii l，加ddH20至10 yl。 37。C水浴1 2小时。点样电泳检测。 3.重叠延伸PCR法将多克隆位点序列插入至rpsL基因的启动子和开放阅读框之
间,获得融合DNA片段 设计引物RMP1:5' -TGGCGGGATCGTTGTATATTTC-3' (SEQ ID NO. 1)
TCCATTAAATAGCTCCTGGTTTTAG-3' (SEQID NO. 2)
TACCGCAACAGTTAACCAGCTGGTAC-3' (SEQ ID NO. 3)RMP4:5' -TTAAGCCTTAGGACGCTTCAC-3' (SEQ ID NO. 4) 以大肠杆菌MG155基因组为模板，RMP1和RMP2为引物PCR扩增出190bp，序列SEQ ID NO. 5所示。 在此扩增的190bp序列中，1-125为rpsL基因的启动子区域；126-128为rpsL基 因的起始密码子；129-190为多克隆位点中的SacI，SacII，NotI，XbaI，SpeI，BamHI，EcoRI， EcoRV， HindIII，以及Clal位点的前面的AT两个碱基序列。 以大肠杆菌MG155基因组为模板，RMP3和RMP4为引物PCR扩增出436bp，序列如 SEQ ID NO. 6所示。 在此扩增的436bp序列中，1-30为190bp和436bp的重复序列，即重叠延伸PCR的 重叠区域；31-64为Clal位点后面的CGAT四个碱基序列和HincII， Sail, Xhol和Kpnl基 因克隆位点；45-436为rpsL基因除起始密码子外的开放阅读框。 以190bp和436bp为模板，RMP1和RMP4为引物PCR扩增出596bp，序列如SEQ ID NO. 7所示。 在此扩增的(也是pLS975中的克隆片段)596bp序列中，1-125为rpsL基因的启动 子区域；126-128为rpsL基因的起始密码子；129-224为多克隆位点区域，含Sacl， SacII， Notl， Xbal， Spel， BamHI， EcoRI， EcoRV， HindIII， Clal， HincII， Sail, Xhol和Kpnl基因克 隆位点；225-596为rpsL基因除起始密码子外的开放阅读框。这样多克隆位点区域就插入 到了 rpsL基因的启动子和开放阅读框之间。
以上50uL PCR反应体系 38. 2 ii L dd H20 5iiL IOXPCR反应缓冲液 1. 3ii L 10mM dNTP 1. 5 ii L上游引物(终浓度0. 75mM) 1. 5 ii L下游引物(终浓度0. 75mM) 2 ii L模板(基因组DNA 200ng， DNA片段 10ng) 0. 5 ii L pfu聚合酶(5U/ ii L) PCR反应条件95。C变性5分钟，循环条件为95°C 30秒，60°C 45秒，72。C延伸lkb 每分钟，共30个循环，最后于72t:延伸10分钟。使用仪器为美国Bio-Rad公司的PTC-200 型号的PCR仪。 反应结束后，以加入20 g/ml的溴化乙锭(EB)的1 %的琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR的结果见图l。
4. pLS975的构建 首先将pBluescript KS(-)以Sacl和Kpnl双酶切后，以T4DNA聚合酶(大连宝 生物公司)处理成平末端载体，取50ng载体与50ng 596bp的PCR片段在10 体系中以 T4DNA连接酶进行连接，0. 8iU转化E. coli DHIOB的电转化感受态细，在含100 y g/ml氨 苄青霉素的LB平板上进行筛选。将所得酶切正确的克隆测序，选取正确方向的克隆，命名 为pLS975。 pLS975的质粒图谱见图2。
5. E. coli DH10B/pLS975的表型验证将菌株E. coli DH10B/pLS975分别划线至含100 ii g/ml， 200 ii g/ml， 500 ii g/ml或 lmg/ml链霉素的LB平板上，37。C培养过夜。结果发现，菌株在lmg/ml链霉素的LB平板上 完全不能生长。
实施例2 为检测pLS975作为克隆载体的效率，将pLS975以BamHI酶切，回收3. 5kb作为载 体；将免疫抑制剂雷帕霉素产生菌的基因组以BamHI酶切，回收1 3kbDNA作为外源片段。
将50ng的载体和150ng的外源片段在10 体系中以T4DNA连接酶进行连接， 0. 8 ill转化E. coli DHIOB的电转化感受态细胞，在含100 y g/ml氨苄青霉素和lmg/ml链 霉素的LB平板上进行筛选，约长出200个菌落。随机挑取40个菌落，提取质粒后，电泳检 测，再以BamHI酶切。结果显示40个均为重组克隆，克隆效率达100% 。图3显示的是20 个克隆的BamHI酶切结果，可见插入片段在1 3kb之间，且片段大小随机分布。这就达到 了文库构建所需的高效率，随机克隆的要求。
实施例3 为检测pLS975作为克隆载体的效率，如实施例2所述，制备pLS975以BamHI酶切 的载体；将雷帕霉素产生菌的基因组以BamHI酶切，回收4 7kb DNA作为外源片段。
将50ng的载体和150ng的外源片段在10 体系中以T4DNA连接酶进行连接， 0. 8 ill转化E. coli DHIOB的电转化感受态细胞，在含100 y g/ml氨苄青霉素和lmg/ml链 霉素的LB平板上进行筛选，约长出200个菌落。随机挑取55个菌落，提取质粒后，电泳检 测，再以BamHI酶切。结果显示53个为重组克隆，克隆效率达96% 。其他2个克隆显示为原载体大小，推测原因可能是随机出现的链霉素抗性突变体。图4显示的是20个克隆的 BamHI酶切结果，可见插入片段在4 7kb之间，且片段大小随机分布。这就达到了文库构 建所需的高效率，随机克隆的要求。 SEQUENCE LISTING 〈110〉南京师范大学 〈120〉rpsL基因和多克隆位点融合的新型克隆载体 〈130〉 〈160〉7 〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211>22 〈212>DNA 〈213>人工序列 <400>1 tggcgggatc gttgtatatt tc 22 〈210>2 〈211>85 〈212>DNA 〈213>人工序列〈400>2 ateagcttga tatcgaattc ggatccacta gttctagagc ggccgccacc gcggtggagc 60 tccattaaat agctcctggt tttag 85 〈210>3 〈211>86 〈212>DNA 〈213>人工序列 <400>3 tegtggatcc gaattcgate tcaagcttat cgateccgtc gacctcgagg gggggcccgg 60 taccgcaaca gttaaccagc tggtac 86 〈210>4 〈211>21 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈400〉4 ttaagcctta ggacgcttca c 21 〈210>5 〈211>190 〈212>DNA 〈213>Escherichi coliv0131]〈400〉5
0132]tggcgggatcgttgtetetttcttgacacc
0133]tcatettgtgttettecgtg
0134]attteatggagctccaccgcggtggcggcc
0135]tcaagcttet
0136]〈210〉6
0137]〈211〉436
0138]〈212〉DNA
0139]〈213〉Escherichia coli
0140]〈400〉6
0141]tegtggatccg皿ttcgatetcaagcttet
0142]teccgcaacagtteaccagctggtecgc皿
0143]cgtgcctgcgctgg皿gcatgcccgc皿皿
0144]cactccteaaa皿ccg皿ctccgcgctgcg
0145]tttcgaagtgacttcctecatcggtggtga
0146]cctgatccgtggcggtcgtgtteaagacct
0147]tgcgcttgactgctccggcgtte皿gaccg
0148]gcgtccteaggcttea
0149]〈210〉7
0150]〈211〉596
0151]〈212〉DNA
0152]〈213〉Escherichia coli
0153]〈400〉7
0154]tggcgggatcgttgtetetttcttgacacc
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0156]attteatggagctccaccgcggtggcggcc
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tttecgaagc3CC3gg3gCt120
gctctegaactegtggatccg皿ttcgate180
190
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436
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gctctegaactegtggatccg皿ttcgate180
gggggcccggteccgcaacagtteaccagc240
cg皿皿gc皿cgtgcctgcgctgg皿gcat300
tetetecteccactccteaaa皿ccg皿ct360
tgacteacggtttcgaagtgacttccteca420
actccgtgatcctgatccgtggcggtcgtg■
ccgtecgtggtgcgcttgactgctccggcg540
atggcgtg皿gcgtccteaggcttea59权利要求
一个rpsL基因和多克隆位点融合的新型克隆载体pLS975，其结构如图2所示。
2. 如权利要求1所说的新型克隆载体pLS975，其特征在于，是通过重叠延伸PCR手段 将一个多克隆位点序列插入至rpsL基因的启动子和开放阅读框之间，再将此DNA片段克隆 至去除了多克隆位点序列的高拷贝质粒pBluescriptKS(-)而获得。
3. 如权利要求2所说的新型克隆载体pLS975，其特征在于多克隆位点序列包含Sacl， SacII， Notl， Xbal， Spel， BamHI， EcoRI， EcoRV， HindIII， Clal， HincII， Sail, Xhol和Kpnl 基因克隆位点。
全文摘要
本发明涉及一个rpsL基因和多克隆位点序列融合的新型克隆载体pLS975。该载体是首先通过重叠延伸PCR手段将一个多克隆位点序列插入至rpsL基因的启动子和开放阅读框之间，再将此DNA片段克隆至去除了多克隆位点序列的高拷贝质粒pBluescript KS(-)而获得。在pLS975中，多克隆位点序列和rpsL基因是在读码框内融合，此融合基因保留了rpsL基因的负筛选标记的功能。pLS975为高拷贝的氨苄青霉素抗性载体，共有18个酶切位点可用于外源DNA片段的克隆，以氨苄青霉素抗性和和1mg/ml的链霉素进行重组克隆的筛选。以本载体进行基因克隆操作简便，重组效率高(96％～100％)，可成为通用的克隆载体。
文档编号C12N15/63GK101696416SQ20091020627
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月16日 优先权日2009年10月16日
发明者任杰, 尚广东, 马超 申请人:南京师范大学;