半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的诱导方法

专利名称：：半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的诱导方法
技术领域：
：本技术属于鱼类生物
技术领域：
，获得卵裂雌核发育二倍体鱼苗的方法。是一种抑制半滑舌鳎雌核发育卵第一次卵裂
背景技术：
：半滑舌鳎(Cynoglossussemiliaevis)是我国特有的一种名贵经济海水鱼类，属于近海温水性底层鱼类，我国沿海均有分布，以黄海、渤海为多。半滑舌鳎是目前海水鱼类养殖的主要品种之一，由于其味道鲜美、肉质细嫩、营养丰富，深受广大消费者欢迎，其市场价值极高，养殖前景非常广阔。鉴于半滑舌鳎的养殖潜力和潜在的经济社会效益，近年来，我国科技工作者对半滑舌鳎生殖调控和自然产卵技术进行了大量研究工作，主要采用人工控制光照和水温的方法剌激半滑舌鳎亲鱼成熟和自然产卵，该项技术于2002年获得成功。在人工养殖条件下，通过控制亲鱼养殖池的水温和光照时间，诱导半滑舌鳎亲鱼成熟并自然产卵，获得了半滑舌鳎受精卵，并生产出了半滑舌鳎苗种(中国水产科学研究院黄海水产研究所，姜言伟等，海洋水产研究，1993;柳学周等，海洋水产研究，2006)。不过半滑舌鳎雌、雄个体生长差异巨大，其雌性个体比雄性个体大2-4倍(中国水产科学研究院黄海水产研究所，孟田湘等，海洋水产研究，1988)，半滑舌鳎鱼苗经过l年养殖后，雌性个体可长到500-750克，而雄性个体则只有50-150克。由于雄性个体生长过慢，影响了商品鱼的质量，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的发展。因此，对半滑舌鳎开展雌核发育技术的研究、研制全雌育种技术，培育和推广半滑舌鳎全雌苗种，对于提高半滑舌鳎的养殖产量和产品质量非常重要。如果研制出半滑舌鳎全雌苗种，进行大面积推广后，将提高半滑舌鳎养殖产量80-100%，每年将增加10多亿元的经济社会效益。雌核发育是生产鱼类全雌苗种的重要途径。这条技术途径在其它淡水鱼类和少数海水鱼类上有过一些研究，并生产出了一些单性苗种。我国最早在鲤鱼上建立了人工减数雌核发育技术(中国科学院水生生物研究所，吴清江，遗传学报1981);随后，在鲢鱼也建立了减数雌核发育诱导方法(中国水产科学研究院长江水产研究所，潘光碧等，淡水渔业1995);同时，一些学者也开展了海水鱼类牙鲆减数雌核发育技术的研究(中国科学院海洋研究所刘静等，海洋与湖沼1999)。不过，上述鱼类的性别决定机制均为XY型，即雄性为XY型、雌性为XX型性别决定，雌鱼只产生一种卵子，即X卵子，而雄鱼则产生XY型2种精子。最近，国内一些学者开展了半滑舌鳎性别相关分子标记筛选的研究，以及半滑舌鳎性腺发育和性别转换技术的研究等项工作，成功地筛选到半滑舌鳎雌性特异AFLP分子标记，建立了半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR技术(黄海水产研究所陈松林等，MarBiotechnol，2007)，发现半滑舌鳎雌性个体存在异型性W染色体(黄海水产研究所周丽青等，水产学报，2005)。AFLP分子标记和染色体分析研究表明，半滑舌鳎为ZW型性别决定机制，即雌鱼产生Z型和W型两种卵子，而雄鱼只产生一种Z型精子。这种zw型雌鱼产生的卵子，经雌核发育后将产生zz型雄鱼和ww型超雌鱼两种类型。ww型超雌鱼与zz型雄鱼交配后将产生全雌苗种。鱼类雌核发育包括减数雌核发育和卵裂雌核发育2种类型。减数雌核发育是采用紫外线照射过的鱼类精子剌激卵子的发育，形成单倍体胚胎，然后在第二次减数分裂时期采用温度休克或压力休克抑制第二极体的排出，从而使雌核发育胚胎进行染色体加倍，形成雌核发育二倍体；由于染色体之间的交换重组，这样形成的雌核发育二倍体为杂合二倍体，很难获得纯合的雌核发育二倍体；而卵裂雌核发育(又称有丝分裂雌核发育)则是通过抑制雌核发育单倍体胚胎的第一次卵裂而达到染色体加倍的目的，这样获得的雌核发育二倍体为同质雌核发育二倍体，纯合度很高，理论上可以得到每个基因位点都纯合的雌核发育二倍体，因此卵裂雌核发育在遗传连锁图谱构建、快速建立纯系和隐性有害基因的剔除等方面具有重要应用价值，是制备鱼类克隆系和获得WW超雌半滑舌鳎鱼的有效途径。因此鱼类卵裂雌核发育研究受到了国际上的高度重视，由于卵裂雌核发育的诱导难度大、二倍体成活率低，尽管已经开展了近20年的研究，但有关鱼类卵裂雌核发育的研究目前只在真鲷(日本Katoetal.，2002Aquaculture)、牙鉀(日本Yamamoto，1999Aquaculture)和舌齿鱼卢(意大利Francesconetal.，2004Aquaculture)等几种鱼类上有过报道，而这几种鱼类都是XY性别决定类型的鱼类。而有关ZW性别决定类型的半滑舌鳎卵裂雌核发育的研究，迄今国内外均未见报道。
发明内容本发明的目的是建立人工诱导半滑舌鳎卵子进行卵裂(有丝分裂)雌核发育的技术方法，获得卵裂雌核发育二倍体鱼苗。本发明技术内容包括二个方面一、鱼类精子的遗传失活和剌激卵子雌核发育方法；二、卵裂雌核发育二倍体鱼苗的诱导和鉴定方法—、鱼类精子的遗传失活和剌激卵子雌核发育方法它的技术内容包括l.雄鱼培育和精子的采集；2.精子的冷冻保存与解冻；3.精子的紫外线照射；4.未受精卵的采集及与紫外线照射精子的受精。1.雄鱼培育和精子的采集选择体表无损伤的半滑舌鳎雄性成鱼作为亲鱼，体重为150-500g/尾，按每平方米一雌二雄的密度进行室内流水养殖，投喂贝类、野杂虾和活沙蚕等新鲜活饵料，每天的投饵量为鱼体重的2_4%。对达到性成熟年龄(雄性2年)的亲鱼，共选择了400尾亲鱼，在繁殖前2-3个月进行控温控光；在此期间，水温按每10天升高0.5-rC从17-19°C逐步升高到21-23°C，并维持在此温度；光照时间按每IO天延长1小时由每天8小时逐渐延长到16小时，并维持在16小时。自人工控光、控温的亲鱼培育池中选取达到性成熟的半滑舌鳎雄鱼，采用腹部挤压法采集精液，先将雄鱼泄殖孔周围腹部的水分用毛巾擦干，用玻璃吸管吸取乳白色的精液。将采集的精液盛入25ml的干燥玻璃瓶中，将装有精液的玻璃瓶置于冰上。精液在运送途中避免光线直射。精子活力在70%以上者用于冷冻保存。2.精子的冷冻保存与解冻采用精子冷冻保存液MPRS(NaCl60.05-60.65mM，NaH2P041.7_1.9mM;NaHC032.5—3.5mM，KC15.1—5.3mM，CaCl2.2H201.0—1.2mM，MgCl2.6H2O1.0—1.2mM，D-Glucose55-56mM)进行精子的冷冻保存。向上述冷冻保存液中添加20%的抗冻剂DMSO(二甲亚砜)，置于4t:冷却，将半滑舌鳎新鲜精液与上述冷却的冷冻保存液-DMSO混合液按l:l比例混合，然后分装到2.0ml的冷冻保存管中，在4。C平衡5min后，采用三步冷冻法将精子放入液氮中冷冻保存。冷冻精子解冻时，先将盛冻精的冻存管从液氮中(-196°)提到液氮蒸汽中(约-160-180度)平衡5分钟，然后将冻存管放在38-40°水浴中进行快速解冻。3.精子的紫外线照射剌激半滑舌鳎卵子进行卵裂雌核发育的精子可用新鲜的或冷冻保存的同源精子或异源精子。当精子活力达到60%以上者均可用于紫外线灭活处理。精子的紫外照射条件为将50iiL新鲜的或100iiL冷冻解冻的精液用1-1.2mL精子稀释液MPRS(配方为KC10.39g/L，CaCl22H200.17g/L，NaHCO30.25g/L，NaCl3.59g/L，NaH2PO40.22g/L，MgCl20.23g/L，Glucosel.Og/L)稀释，平铺于培养皿中，将培养皿置于紫外交联仪(UVC500)中，用40-70mJ/cm2紫外线照射，照射后精子的活力保持在20-35%。然后与半滑舌鳎卵"授精"，剌激卵子进行雌核发育。4.半滑舌鳎未受精卵的采集及与紫外线照射精子的授精选择性成熟的半滑舌鳎雌鱼，在产卵前lh采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入250-500ml干燥的烧杯中，置于20-23。C室温下。将以上经过紫外线照射的精液加入半滑舌鳎卵中，轻轻摇动混匀，然后加入温度为20-23t:的2倍于卵量的海水完成"受精"过程。授精后将卵置于20-23度海水中进行孵化。二、卵裂雌核发育二倍体鱼苗的诱导和鉴定方法方法包括(一)、静水压诱导卵裂雌核发育鱼苗的方法；(二)、卵裂雌核发育鱼苗的微卫星鉴定方法。(—)、静水压诱导卵裂雌核发育鱼苗的方法；它的技术内容包括1、雌核发育胚胎染色体加倍起始时间的确定；2、静水压压力和处理持续时间的确定。1.雌核发育胚胎染色体加倍起始时间的确定染色体加倍采用静水压方法进行。在"授精"后不同时间(15.5_42.5min)，将卵倒入静水压机的压力缸中，采用60-70Mpa的压力进行压力休克处理，处理时间为4-6分钟。休克处理完毕后将卵移入21-23t:海水中培养，统计雌核发育二倍体率。结果发现雌核发育卵在"授精"后21-25min进行静水压休克处理都能够诱导产生雌核发育二倍体，且以"授精"后21.5-24.5min的诱导率最高。因此，卵裂雌核发育诱导的静水压休克处理的有效起始时间确定为授精"后21.5-24.5min。2.静水压压力和处理持续时间的确定在确定了静水压休克起始时间后，需要确定静水压压力和和休克持续时间。将与紫外失活精子"授精"的卵，在授精后4-6分钟，分别采用50、60、70和80Mpa压力进行处理，在每个压力下分别处理2min，4min和6min。统计雌核发育鱼苗的孵化率。结果表明在休克压力60-70Mpa，处理4-6min条件下都可以诱导雌核发育二倍体，其中在65—70Mpa处理4-6min的雌核发育诱导率最高。因此确定半滑舌鳎卵裂雌核发育诱导的静水压有效压力为65-70Mpa，有效处理持续时间为4_6分钟。(二)、卵裂雌核发育鱼苗的微卫星鉴定方法。采取高盐法和E.Z.N.AMicroEluteGenomicDNA试剂盒(Omega)提取半滑舌鳎雌核发育鱼和正常鱼苗基因组DNA，采用我们筛选到的半滑舌鳎多态性微卫星标记进行雌核发育鱼苗鉴定。共使用10对微卫星引物Cysel47(5-ACCCAAAGCAAACACAAAGG-3';5'-GATCGATGGGTGGATAGCAC-3')，Cysel7(CTTGGGGGCTTAGCTCTTCT;ACTCACTCCGCTGAGGTTTG)，Cysel49(CGTCTCTGCGCCTCTTAGTT;CGTCTCTGCGCCTCTTAGTT)，Cyse215(AATGCAGACGGACAAACAAA;GGCCTGGTGAACAAAACATC)，Newcyse18(TCACCATCTCTGTCCCTGTG;CATTGAAACAAGCCCTGAAA)，Newcyse56(TAGCACTACCCCAGGTCCAG;TTGAAAACACGCCAACAGTC)，Newcyse91(GCTGCCTTCAAATGACACAA;TCACCACTGTTCTGCTCCAC)，Newcyse97(CCATGTCGTGTGCAAATGTT;TTTTCAGGAAATGCAGCACA)，Newcyse104(TGCACCAGTCTGAGGAAGTG;CCCAGTCTCCCTACGATGAA)，Newcyse105(CCCAGTCTCCCTACGATGAA;CGATCTTCGCATCGCTACTT)。然后进行PCR扩增，PCR扩增条件为94t:热变性5min，然后进行38个循环，每个循环包括94。C变性30s，58-60。C退火30s，72。C延伸30s，最后在72。C延伸7min。PCR扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，采用银染法染色。采用上述10对微卫星标记分析表明，24个卵裂雌核发育鱼苗有效等位基因数为1.31-2.08，观测杂合度为Ho0.1250-0.304，期待杂合度为He0.2406_0.5293。24尾后代中纯合子比例73.91-87.50，平均纯合子比例为80.54%，杂合子比例仅为19.46%。同时，采用上述引物对我们获得的24尾减数雌核发育鱼苗进行分析表明，平均纯合子比例仅为13.35%，而杂合子比例高达86.65%。由此表明，当雌核发育鱼苗的平均纯合度达到80%左右时，可认为是卵裂雌核发育鱼苗。本发明与已有技术对比其特点是本发明建立了半滑舌鳎精子冷冻保存技术，突破了半滑舌鳎卵裂(有丝分裂)雌核发育难关，获得了卵裂雌核发育鱼苗，采用微卫星标记证明卵裂雌核发育鱼苗的平均纯合率达到80%以上，而减数雌核发育鱼苗的平均纯合率只有13%左右。本发明建立的半滑舌鳎精子冷冻保存和卵裂雌核发育二倍体鱼苗诱导方法，技术先进，操作方便，方法高效、实用、可靠，其诱导半滑舌鳎卵裂雌核发育二倍体的百分率为0.25%左右；采用这项技术可以培育出高度纯合的卵裂雌核发育鱼苗，而以前建立的的减数雌核发育技术只能获得纯合度不高的减数雌核发育个体，很难获得高度纯合的纯系。该项发明为半滑舌鳎苗种生产和全雌苗种研制提供了技术手段，在半滑舌鳎性别控制、全雌鱼苗培育以及纯系建立等方面具有重大应用价值和广阔的推广应用前景。图！半滑舌鳎精子在不同冷冻保存液中冷冻保存后的活力比较；图2:卵裂雌核发育鱼苗微卫星分析代表性照片，示纯合子比例为87.5%，杂合子比例为12.5%;图3:减数雌核发育鱼苗微卫星分析代表性照片，示纯合子比例为25%，杂合子比例为75%;具体实施例方式下面以半滑舌鳎为例，对本发明的技术内容进行详细说明本发明技术内容包括二个方面一、鱼类精子的遗传失活和剌激卵子雌核发育方法；二、抑制第一次卵裂诱导雌核发育胚胎染色体加倍的方法。—、鱼类精子的遗传失活和剌激卵子雌核发育方法它的技术内容包括l.雄鱼培育和精子的采集；2.冷冻保存液的筛选和精子的冷冻保存与解冻；3.精子的紫外线照射；4.未受精卵的采集及与紫外照射精子的授精1.雄鱼培育和精子采集研究用半滑舌鳎亲鱼为山东海阳黄海水产有限公司和山东莱州明波水产有限公司人工培育的半滑舌鳎亲鱼，雌核发育诱导实验也是在上述两个公司进行。选择体表无损伤的半滑舌鳎雄性成鱼作为亲鱼，体重为150-500g/尾，按每平方米一雌二雄的密度进行室内流水养殖，投喂贝类、野杂虾和活沙蚕等新鲜活饵料，每天的投饵量为鱼体重的2-4%。对达到性成熟年龄(雄性2年)的亲鱼，共选择了400尾亲鱼，在繁殖前2-3个月进行控温控光；在此期间，水温按每10天升高0.5-rC从17-l『C逐步升高到21-23°C，并维持在此温度；光照时间按每10天延长1小时由每天8小时逐渐延长到16小时，并维持在16小时。通过观察和手摸检查选择性成熟的雄鱼，雄性亲鱼要选择轻挤性腺部位，可以看到精液流出者进行使用。采用腹部挤压法采集精液，事先将雄鱼泄殖孔周围腹部的水分用毛巾擦干，用玻璃吸管吸取乳白的精液，注意不要吸取排出的黄色尿液。将采集的精液全部盛入25ml的干燥的玻璃瓶中，将装有精液的玻璃瓶置于冰上。精液在运送途中避免光线直射。用显微镜观察精子活力在70%以上者用于冷冻保存。2.冷冻保存液的筛选和精子的冷冻保存与解冻采用代号为MPRS和TS-2的鱼类冷冻保存稀释液进行半滑舌鳎精子的冷冻保存。冷冻保存液MPRS的配方为NaCl60.05-60.65mM，NaH2P041.7_1.9mM;NaHC032.5—3.5mM，KC15.1_5.3mM，CaCl2.2H201.0—1.2mM，MgCl2.6H201.0—1.2mM，D-Glucose55-56mM。冷冻保存液TS-2的配方为Tris-Cl9-1lmM，pH8.0，蔗糖105-115mM，KHCO395-105mM，9-11%胎牛血清(体积比)。向上述冷冻保存液中分别添加20X的抗冻剂DMSO(二甲亚砜)，然后置于4t:冷却，将半滑舌鳎新鲜精液与上述冷却的冷冻保存液-DMSO混合液按l:l比例混合，然后分装到2.0ml的冷冻保存管中，在4t:平衡5min后，采用三步冷冻法将精子放入液氮中冷冻保存。冷冻精子解冻时，先将盛冻精的冻存管从液氮中(-196°)提到液氮蒸汽中(约-160-180度)平衡5分钟，然后将冻存管放在38-40°水浴中进行快速解冻。解冻后观察精子活力，比较2种冷冻保存液的效果。结果表明，半滑舌鳎精子在MPRS中冷冻保存后的活力为53.50士6.69X，明显高于在TS-2中冷冻保存的精子(45±4.71%)^<0.05)(见图1)，由此筛选出适合半滑舌鳎精子冷冻保存的稀释液为MPRS。3.精子紫外线照射剂量的筛选剌激半滑舌鳎卵子进行卵裂雌核发育的精子可用新鲜的或冷冻保存的同源精子或异源精子。当精子活力达到50%以上者均可用于紫外线灭活处理。精子的紫外线照射条件为将50iiL新鲜的或100iiL冷冻解冻的精液用1-1.2mL精子稀释液MPRS(配方为KC10.39g/L，CaCl22H200.17g/L，NaHCO30.25g/L，NaCl3.59g/L，NaH2PO40.22g/L，MgCl20.23g/L，Glucosel.Og/L)稀释，平铺于培养皿中，将培养皿置于紫外交联仪(UVC500)中，分别用2，5，10，15，20，30，50mJ/cm2紫外线照射，照射后的精液分别和5-10mL半滑舌鳎卵受精，在22-23°。恒温培育，在囊胚期和鱼苗孵出期，分别计算受精率、单倍体率和二倍体率。选择能产生100%的单倍体的最低紫外线剂量作为雌核发育诱导的有效剂量。实验表明用50mJ/cm2的紫外线照射后的精子剌激卵雌核发育的效果较好，胚胎单倍体率达到100%(表l)，因此选择50mJ/cm2作为半滑舌鳎精子遗传失活的有效紫外线照射剂量。表1:半滑舌鳎精子紫外照射有效剂量的筛选UV剂量(mjcm-2)受精率(%)单倍体比率(%)二倍体比率(%)0(control)85.83.7a0.0±0.0a100.0±0.0a281.6±2.5ab52.9±4.4b47.0士4.5b577,6±6.5ab56.0±3.6b44.0±3.6b1073.6±3.2C86.5±1.3C13.3±1.4C1563.06.2d90.7±2.2cd9.2±2.2cd2061.610.9d96,6±2.3de3.3±2,3de3058.05.2d97.2±1.9de2.7±1.9de5055,26.5d100±0.0e0.0±0.oe4.半滑舌鳎未受精卵的采集及与紫外照射精子的授精从温光调控的半滑舌鳎亲鱼池中选取达性成熟的雌性亲鱼，通过观察和手摸检查选择性腺明显隆起、用手轻压性腺上下两侧有明显的充实感且性腺前端有一定的柔软度的雌鱼，用于注射激素进行人工催产。催产激素为HCG40-60IU+LRH-A30.4-1.5yg/kg;或LRH_A30.4-l.8iig/kg+DOMl_2mg/kg雌鱼。注射上述激素后的效应时间为35-42小时。到达效应时间以后，要每30-60min检查一次，当雌鱼性腺由硬明显变软时，可进行挤卵和人工授精。挤卵时的操作和注射催产激素时一样进行。当雌鱼从水中捞起后，要注意用手按住生殖孔部位，以防卵流出或喷出并迅速用毛巾包好鱼体，生殖孔一侧露在外侧并擦去海水。在产卵前lh采用人工挤压腹部法采卵，用手在上下两侧从后到前轻压性腺部位，即可将卵挤出，将卵采入250-500ml干燥的烧杯中，置于20-23°C室温下。将以上经过紫外线照射的精液加入半滑舌鳎卵中，轻轻摇动混匀，然后加入温度为20-23t:的2倍于卵量的海水完成"受精"过程。授精后将卵置于20-23度海水中进行孵化。二、卵裂雌核发育二倍体鱼苗的诱导和鉴定方法。包括(一)、静水压诱导卵裂雌核发育鱼苗的方法；(二)、卵裂雌核发育鱼苗的微卫星标记鉴定方法。(—)、静水压诱导卵裂雌核发育鱼苗的方法；它的技术内容包括1、雌核发育胚胎染色体加倍起始时间的确定；2、静水压压力和处理持续时间的确定。1.卵裂雌核发育胚胎染色体加倍起始时间的确定染色体加倍采用静水压方法进行。在"授精"后不同时间(15.5，18.5，21.5，24.5，27.5，30，33，36，39和42min)，将卵倒入静水压机的压力缸中，采用60-70Mpa的压力进行压力休克处理，处理时间为4-6分钟。休克处理完毕后将卵移入21-23t:海水中培养。在鱼苗孵化出膜时，统计雌核发育诱导率。结果发现雌核发育卵在"授精"后21-25min进行静水压休克处理都能够诱导产生雌核发育二倍体，且以"授精"后21.5-24.5min的诱导率最高(表2)。因此，卵裂雌核发育诱导的静水压休克处理的有效起始时间确定为授精"后21.5-24.5min。表2:半滑舌鳎卵裂雌核发育静水压休克起始时间的确定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.静水压压力和处理持续时间的确定在确定了静水压休克起始时间后，需要确定静水压压力和和休克持续时间。将与紫外失活精子"授精"的卵，在授精后4-6分钟，分别采用50、60、70和80Mpa压力进行处理，在每个压力下分别处理2min，4min和6min。在鱼苗孵化出膜时，统计雌核发育鱼苗的孵化率。结果表明在休克压力60-70Mpa，处理4-6min条件下都可以诱导雌核发育二倍体，其中在65—70Mpa处理4-6min的雌核发育诱导率最高。因此确定半滑舌鳎卵裂雌核发育诱导的静水压有效压力为65-70Mpa，有效处理持续时间为4_6分钟(见表3)。表3:半滑舌鳎卵裂雌核发育静水压休克压力和处理时间的确定<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(二)、卵裂雌核发育鱼苗的微卫星标记鉴定方法采取高盐法和E.Z.N.AMicroEluteGenomicDNA试剂盒(Omega)提取半滑舌鳎雌核发育鱼和正常鱼苗基因组DNA，采用我们筛选到的半滑舌鳎多态性微卫星标记进行雌核发育鱼苗鉴定。共使用10个微卫星标记Cysel47(5-ACCCAAAGCAAACACAAAGG-3';5'-GATCGATGGGTGGATAGCAC-3')，Cysel7(5'-CTTGGGGGCTTAGCTCTTCT-3';5-ACTCACTCCGCTGAGGTTTG-3)，Cysel49(5-CGTCTCTGCGCCTCTTAGTT-3;5-CGTCTCTGCGCCTCTTAGTT-3)，Cyse215(5-AATGCAGACGGACAAACAAA-3;5-GGCCTGGTGAACAAAACATC-3)，Newcyse18(5-TCACCATCTCTGTCCCTGTG-3;5-CATTGAAACAAGCCCTGAAA-3)，Newcyse56(5-TAGCACTACCCCAGGTCCAG-3;5_TTGAAAACACGCCAACAGTC_3)，Newcyse91(5-GCTGCCTTCAAATGACACAA-3;5-TCACCACTGTTCTGCTCCAC-3)，Newcyse97(5-CCATGTCGTGTGCAAATGTT-3;5-TTTTCAGGAAATGCAGCACA-3)，Newcyse104(5-TGCACCAGTCTGAGGAAGTG-3;5-CCCAGTCTCCCTACGATGAA-3)，Newcyse105(5-CCCAGTCTCCCTACGATGAA-3;5-CGATCTTCGCATCGCTACTT-3).这10个微卫星标记的编号、核心序列、引物序列、退火温度及其扩增片度大小等信息见表4.采用上述微卫星标记引物进行PCR扩增的条件为94t:热变性5min，然后进行38个循环，每个循环包括94。C变性30s，58-6(TC退火30s，72t:延伸30s，最后在72t:延伸7min。PCR扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，采用银染法染色。采用上述10对微卫星标记分析表明，24个卵裂雌核发育鱼苗有效等位基因数为1.31-2.08，观测杂合度为Ho0.1250-0.304，期待杂合度为He0.2406-0.5293。24尾后代中纯合子比例73.91-87.50，平均纯合子比例为80.54%，杂合子比例仅为19.46%(表5)(见图2)。同时，采用上述引物对我们获得的24尾减数雌核发育鱼苗进行分析表明，平均纯合子比例仅为13.35%，而杂合子比例高达86.65%(见表6)(图3)。由此证明卵裂雌核发育鱼苗确实是通过抑制第一次卵裂产生的。表4:10个微卫星标记的引物序列、片段大小及退火温度微卫星位引物序列(5'-3)核心序列片段大小Tm(。C)序列号点(bp)Cysel47FACCCAMGCAAACACAAAGG(CCAT)5n(242-25060EU907018RGATCGATGGGTGGATAGCACCCAT)3Cysel7FCTTGGGGGCTTAGCTCTTCT(AC)6192-19858EF363815RACTCACTCCGCTGAGGTTTGCysel49FCGTCTCTGCGCCTCTTAGTT(GM)7194-20260EU907020RACAGAGGGGCAGGTCACTTACyse215FMTGCAGACGGAC嵐C嵐(CA)5CG(191-19860EU907081RGGCCTGGTGMCMMCATCCA)IONewcyselFTCACCATCTCTGTCCCTGTG(TC)7T(T242-24858GQ4267688RCATTGAMCMGCCCTGAMC)12Newcyse5FTAGCACTACCCCAGGTCCAG(TC)13(A238-24458GQ4268006RTTGAAMCACGCCMCAGTCC)llNewcyse9FGCTGCCTTCAAATGACACM(GA)33204-21058GQ4268331RTCACCACTGTTCTGCTCCACNewcyseFCCATGTCGTGTGC嵐TGTT(GT)18230-23858GQ42683797RTTTTCAGGAMTGCAGCACANewcyseFTGCACCAGTCTGAGGMGTG(AC)11192-19858GQ426843104RCCCAGTCTCCCTACGATGMNewcyselFGAMTATGGCTCCGACTGGA(GT)12234-24058GQ42684405RCGATCTTCGCATCGCTACTT表5:半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗微卫星分析结果汇总表微卫星位点样品杂合子杂合子纯合子纯合子平均纯合数数量比例数:比例子比例(%)(%)(%)Cysel4724520.831979.17Cysel724416.672083.33Cysel4923626.091773.91Cyse21523730.431669.57Newcyse1824312.502187.5080.54Newcyse5623313.042086.96Newcyse9124520.831979.17Newcyse9724312.502187.50Newcyse10424625.001875.00Newcyse10524416.672083.33表6:半滑舌鳎减数雌核发育鱼苗微卫星分析结果汇总表微卫星位点样品数杂合子杂合子纯合子纯合子平均纯合数量比例(％)数量比例子比例(%)(%)Cysel7242187.50312.50Cysel49241979.17520.83Cyse21524241000013.35Newcyse18242410000Newcyse97242410000〖0127〗Newcyse104242410000Newcyse105241458.331041.67〖0129〗NewcysellO221568.18731.83根据上述研究，本发明将半滑舌鳎卵裂雌核发育的诱导技术条件确定为采用MPRS冷冻保存稀释液进行半滑舌鳎精子的冷冻保存，50-100iiL新鲜或冷冻解冻精子利用MPRS稀释10倍后，利用50mj/cm2紫外线照射对精子遗传物质进行灭活，紫外线照射后的精子与半滑舌鳎卵"授精"，受精卵在21-23度海水中培育21-25分钟后进行静水压休克处理，静水压力采用65-70Mpa，处理4_6分钟，然后将胚胎置于21-23。C海水中培育，这样即可获得半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗，雌核发育鱼苗可采用8-10对多态性半滑舌鳎微卫星标记引物进行鉴定，当20多尾雌核发育鱼苗的平均纯合度达到80%左右时，可认为是卵裂雌核发育鱼苗。该技术已在山东海阳黄海水产有限公司和莱州明波水产有限公司等半滑舌鳎育苗场进行了示范和应用，证明该技术可稳定、批量制作半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗。0131]序列表0132]<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所0133]<120>半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的诱导方法0134]<160>10135]<170>PatentInversion3.10136]<210>10137]<211>4000138]<212>DNA0139]<213>半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)0140]<400>10141]ACCCAAAGCAAACACAAAGGGATCGATGGGTGGATAGCACCTTGGGGGCTTAGCTCTTCT600142]ACTCACTCCGCTGAGGTTTGCGTCTCTGCGCCTCTTAGTTACAGAGGGGCAGGTCACTTA1200143]AATGCAGACGGACAAACAAAGGCCTGGTGAACAAAACATCTCACCATCTCTGTCCCTGTGCATTGAAACAAGCCCTGAAATAGCACTACCCCAGGTCCAGTTGAAAACACGCCAACAGTCGCTGCCTTCAAATGACACAATCACCACTGTTCTGCTCCACCCATGTCGTGTGCAAATGTT300TTTTCAGGAAATGCAGCACATGCACCAGTCTGAGGAAGTGCCCAGTCTCCCTACGATGAA360权利要求一种半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的诱导方法，其特征在于它的技术方法包括二个方面(1)、鱼类精子的遗传失活和刺激卵子雌核发育方法；(2)、卵裂雌核发育鱼苗的诱导和鉴定方法；(1)、鱼类精子的遗传失活和刺激卵子雌核发育方法它的技术内容包括A.雄鱼培育和精子的采集；B.精子的冷冻保存与解冻；D.精子的紫外线照射；D.未受精卵的采集及与紫外线照射精子的受精；A.雄鱼精子的采集自人工控光、控温的亲鱼培育池中选取达到性成熟的半滑舌鳎雄鱼，采用腹部挤压法采集精液，先将雄鱼泄殖孔周围腹部的水分用毛巾擦干，用玻璃吸管吸取乳白色的精液；将采集的精液盛入25ml的干燥玻璃瓶中，将装有精液的玻璃瓶置于冰上；精液在运送途中避免光线直射。精子活力在70％以上者用于冷冻保存；B.精子的冷冻保存与解冻采用精子冷冻保存液MPRS进行半滑舌鳎精子的冷冻保存，向MPRS冷冻保存液中添加20％的抗冻剂二甲亚砜DMSO，置于4℃冷却，将半滑舌鳎新鲜精液与上述冷却的冷冻保存液-DMSO混合液按1∶1比例混合，然后分装到2.0ml的冷冻保存管中，在4℃平衡5min后，采用三步冷冻法将精子放入液氮中冷冻保存。冷冻精子解冻时，先将盛冻精的冻存管从-196°液氮中提到-160--180度的液氮蒸汽中平衡5分钟，然后将冻存管放在38-40°水浴中进行快速解冻；C.精子的紫外线照射刺激半滑舌鳎卵子进行卵裂雌核发育的精子可用新鲜的或冷冻保存的同源精子或异源精子；当精子活力达到60％以上者均可用于紫外线灭活处理。精子的紫外照射条件为将50μL新鲜的或100μL冷冻解冻的精液用1-1.2mL精子稀释液MPRS稀释，平铺于培养皿中，将培养皿置于紫外交联仪(UVC500)中，用40-70mJ/cm2紫外线照射，照射后精子的活力保持在20-35％。然后与半滑舌鳎卵“授精”，刺激卵子进行雌核发育；精子稀释液MPRS的配方为KCl0.39g/L，CaCl22H2O0.17g/L，NaHCO30.25g/L，NaCl3.59g/L，NaH2PO40.22g/L，MgCl20.23g/L，Glucose1.0g/L；D.半滑舌鳎未受精卵的采集及与紫外线照射精子的授精选择性成熟的半滑舌鳎雌鱼，在产卵前1h采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入250-500ml干燥的烧杯中，置于20-23℃室温下；将以上经过紫外线照射的精液加入半滑舌鳎卵中，轻轻摇动混匀，然后加入温度为20-23℃的2倍于卵量的海水完成“受精”过程；授精后将卵置于20-23度海水中进行孵化；(2)、卵裂雌核发育鱼苗的诱导和鉴定方法包括A、静水压诱导卵裂雌核发育鱼苗的方法；B、卵裂雌核发育鱼苗的微卫星鉴定方法；A、静水压诱导卵裂雌核发育鱼苗的方法；它的技术内容包括a、雌核发育胚胎染色体加倍起始时间的确定；b、静水压压力和处理持续时间的确定；a.雌核发育胚胎染色体加倍起始时间的确定染色体加倍采用静水压方法进行；在“授精”后15.5-42.5min，将卵倒入静水压机的压力缸中，采用60-70Mpa的压力进行压力休克处理，处理时间为4-6分钟；休克处理完毕后将卵移入21-23℃海水中培养，统计雌核发育二倍体率；结果发现雌核发育卵在“授精”后21-25min进行静水压休克处理都能够诱导产生雌核发育二倍体，且以“授精”后21.5-24.5min的诱导率最高；因此，卵裂雌核发育诱导的静水压休克处理的有效起始时间确定为授精”后21.5-24.5min；b.静水压压力和处理持续时间的确定在确定了静水压休克起始时间后，需要确定静水压压力和和休克持续时间；将与紫外失活精子“授精”的卵，在授精后4-6分钟，分别采用50、60、70和80Mpa压力进行处理，在每个压力下分别处理2min，4min和6min；统计雌核发育鱼苗的孵化率；结果表明在休克压力60-70Mpa，处理4-6min条件下都可以诱导雌核发育二倍体，其中在65--70Mpa处理4-6min的雌核发育诱导率最高；因此确定半滑舌鳎卵裂雌核发育诱导的静水压有效压力为65-70Mpa，有效处理持续时间为4-6分钟；B、卵裂雌核发育鱼苗的微卫星鉴定方法采取高盐法和Omega公司的E.Z.N.A.TMMicroEluteGenomicDNA试剂盒提取半滑舌鳎雌核发育鱼和正常鱼苗基因组DNA，采用我们筛选到的半滑舌鳎多态性微卫星标记进行雌核发育鱼苗鉴定；共使用10对微卫星引物Cyse147(5-ACCCAAAGCAAACACAAAGG-3‘；5’-GATCGATGGGTGGATAGCAC-3‘)，Cyse17(CTTGGGGGCTTAGCTCTTCT；ACTCACTCCGCTGAGGTTTG)，Cyse149(CGTCTCTGCGCCTCTTAGTT；CGTCTCTGCGCCTCTTAGTT)，Cyse215(AATGCAGACGGACAAACAAA；GGCCTGGTGAACAAAACATC)，Newcyse18(TCACCATCTCTGTCCCTGTG；CATTGAAACAAGCCCTGAAA)，Newcyse56(TAGCACTACCCCAGGTCCAG；TTGAAAACACGCCAACAGTC)，Newcyse91(GCTGCCTTCAAATGACACAA；TCACCACTGTTCTGCTCCAC)，Newcyse97(CCATGTCGTGTGCAAATGTT；TTTTCAGGAAATGCAGCACA)，Newcyse104(TGCACCAGTCTGAGGAAGTG；CCCAGTCTCCCTACGATGAA)，Newcyse105(CCCAGTCTCCCTACGATGAA；CGATCTTCGCATCGCTACTT)。采用上述引物进行PCR扩增的条件为94℃热变性5min，然后进行38个循环，每个循环包括94℃变性30s，58-60℃退火30s，72℃延伸30s，最后在72℃延伸7min。PCR扩增产物在6％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，采用银染法染色；采用上述10对微卫星标记分析表明，24个卵裂雌核发育鱼苗有效等位基因数为1.31-2.08，观测杂合度为Ho0.1250-0.304，期待杂合度为He0.2406-0.5293；24尾后代中纯合子比例73.91-87.50，平均纯合子比例为80.54％，杂合子比例仅为19.46％；同时，采用上述引物对我们获得的24尾减数雌核发育鱼苗进行分析表明，平均纯合子比例仅为13.35％，而杂合子比例高达86.65％；由此表明，当雌核发育鱼苗的平均纯合度达到80％左右时，可认为是卵裂雌核发育鱼苗。全文摘要一种半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的诱导方法，包括半滑舌鳎精子冷冻保存、精子的紫外照射、卵裂雌核发育鱼苗的诱导及鉴定方法。本发明建立了半滑舌鳎精子冷冻保存方法，建立了采用静水压抑制第一次卵裂诱导半滑舌鳎雌核发育胚胎染色体加倍的方法，筛选到半滑舌鳎精子冷冻保存的有效稀释液和冷冻方法，筛选到适合半滑舌鳎卵裂雌核发育的静水压休克起始时间、静水压力和处理时间，建立了半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗的鉴定方法。本方法首次获得了半滑舌鳎卵裂雌核发育鱼苗，雌核发育鱼苗诱导率可达0.25％；本发明具有先进、高效、实用、可靠的特点，可用于解决半滑舌鳎雄性生长慢、雌性比例低、养殖成本高的问题，在半滑舌鳎苗种繁育、性别控制、全雌苗种培育以及纯系建立等方面具有重大应用价值和广阔的推广应用前景。文档编号C12Q1/68GK101690469SQ20091020655公开日2010年4月7日申请日期2009年10月14日优先权日2009年10月14日发明者季相山,徐亘博,杨景峰,田永胜,邵长伟,陈松林申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所