专利名称：一种用于环介导等温扩增技术的反应管及其使用方法
技术领域：
本发明涉及环介导等温扩增技术，具体涉及一种可用于环介导等温扩增技术的反
应管及其使用方法。
背景技术：
PCR技术的出现使核酸水平的医学检测进入了一个全新的阶段，然而随着PCR技 术的越来越广泛应用，它也面临着严峻的考验，由于核酸扩增技术的高灵敏度，使PCR出现 了严重的气溶胶污染问题，从而使得PCR检测结果假阳性率增高，经过多年的努力，科研工 作者发明了荧光定量PCR，彻底解决了 PCR气溶胶污染的问题。然而荧光定量PCR的仪器成 本太高，不适合现场快速检测，因此这项技术无法进行大规模的推广。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术将核酸 检测技术推向了一个新的高度。LAMP是一种快速、灵敏、准确的核酸检测方式，其检测设备 要求简单，只需有水浴锅即可，大大降低了设备成本的投入。此外，LAMP的扩增效率超强， 表现在两个方面(l)灵敏度比PCR高出的是数量级的差异；(2)扩增产物的DNA数量，也 比PCR产物高出太多，能够达到几个ug，因此LAMP产物可以用荧光染料进行终点检测。虽 然LAMP因为检测快速、简便、准确、不依赖仪器设备等优点越来越被推广使用，但是太过于 灵敏和产物量的巨大，使得LAMP极易容易污染，尤其是在LAMP扩增反应后需要反应管开盖 加入显色剂，就很容易出现气溶胶污染，而气溶胶污染会使得检测结果假阳性率高，并且污 染其他样品，污染检测区域，同时还难以去除，因此如何解决LAMP所面临的气溶胶污染，是 本领域技术人员当前急需解决的一个技术难题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种成本增加量不到3%，且能解决 LAMP反应气溶胶污染问题，保证LAMP检测准确性、快速性的，用于环介导等温扩增技术的
反应管。 本发明的另一个目的在于提供上述反应管的使用方法。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的 —种用于环介导等温扩增技术的反应管，该反应管由管体和管盖两部分组成，管
体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。 上述用于环介导等温扩增技术的反应管，其管体和隔板为一体成型。 上述用于环介导等温扩增技术的反应管，其隔板的高度为管体高度的1/4 1/3。 上述用于环介导等温扩增技术的反应管，其A、 B两个空腔中分别装有环介导等温
扩增反应工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由石蜡封存，所述环介导等温扩增反
应工作液为环介导等温扩增反应液和Bst DNA聚合酶的混合。 上述用于环介导等温扩增技术的反应管，石蜡选择熔点小于l(TC的石蜡品种，如 广州市德隆化工贸易有限公司生产的巴拿芬蜡，可以在l(TC以下将两个空腔内的液体有效
3封存，使两个空腔内的液体在受到机械震荡时不会泄露，又能使移液器的枪头轻易剌破而 不影响样品的加入。 上述反应管的制备方法，包括如下步骤 (1)取加工成型的反应管，该反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设 有将其分隔成A、 B两个空腔的纵向延伸的隔板； (2)将环介导等温扩增反应工作液(LAMP反应液)和Bst DNA聚合酶，放入空腔
A(或者B)中，LAMP反应液和Bst DNA聚合酶的合称环介导等温扩增反应工作液，工作液上
层用石蜡密封；将LAMP显色液放入空腔B(或者A)中，显色液上层用石蜡密封。 本发明的反应管主要是针对需要做大批量LAMP反应时，可简化操作步骤，解决气
溶胶污染等问题，按照实际反应需要，确定LAMP反应液配方，以及Bst DNA聚合酶的用量，
然后制备大量相应的反应管，使用的时候只需将适量的样品加入管底空腔A的工作液中，
进行LAMP反应即可。 上述反应管的使用方法，具体包括如下步骤 (1)先打开反应管的管盖，选择装有LAMP工作液的那个空腔，将待测样品加入 LAMP工作液中；因为加样通常是采用微量进样器加样，进样器的枪头在通过液封的石蜡时 并不会对其造成太大的影响，当加样结束，取出枪头的时候，石蜡会自动愈合，从而实现对 反应体系的有效封存； (2)加样结束后，将反应管水浴中进行LAMP反应，LAMP反应的常用反应温度为
63 65°C。在反应过程中，由于空腔A和空腔B均分别被石蜡密封又有隔板分隔，因此是
两个相对独立的小室，工作液和显色液之间不会发生任何形式的相互渗漏； (3) LAMP反应结束后，将反应管倒置甩动两次，再正放甩动两次，使显色液与工作
液能够充分混合，室温放置，观察LAMP反应产物与管底显色液的显色结果。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果 1.本发明的反应管通过隔板和石蜡的设计，有效地将显色液和工作液分隔开来， 不仅能保证在储运过程中相对保持完整封闭性，而且无需打开管盖，就可以实现显色反应， 大大降低气溶胶的污染； 2.本发明不但保证了 LAMP的检测快速、高效性，而且成本低廉、可在不开盖的情 况下完成整个LAMP检测。
图1为本发明反应管开盖时的工作状态示意图； 其中，1为管体，2为管盖，3为空腔B，4为空腔A，5为隔板； 图2为本发明反应管合盖时的工作状态示意图； 其中，1为管体，2为管盖，3为空腔B，4为空腔A，5为隔板； 图3为本发明反应管制作过程示意图； 其中，1为空腔A， 2为空腔B， 3为石蜡，4为LAMP反应工作液，5为LAMP反应显色 液，6为待测样品。 图4为本发明反应管的LAMP反应使用过程示意图； 其中，1为空腔A， 2为空腔B， 3为石蜡，4为LAMP反应工作液，5为LAMP反应显色液，6为待测样品； 图5为实施例3中特异性检测试验的结果图； 其中，1为阳性对照，2为阴性对照，3 8是李斯特氏菌、大肠杆菌0157、金黄色葡
萄球菌、志贺氏菌和变形杆菌，9为沙门氏菌； 图6为实施例3中灵敏度检测试验的结果图； 其中，1为阳性对照，2为阴性对照；3 10分别为10—1 10—8浓度级的沙门氏菌。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任 何限定。 本发明的反应管，如图1和图2所示，由管体1和管盖2两部分组成，管体1内腔 的下部设有将其分隔成A、 B两个空腔的纵向延伸的隔板5。
实施例1 如图3所示，本实施例的反应管，由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有 将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板，其中空腔A内装有22. O微升的LAMP反应液 和0. 5微升的Bst DNA聚合酶，液体上层由石蜡封存；空腔B内装有2. 0微升的LAMP反应 显色液，液体上层也由石蜡封存，将该反应管-2(TC保存。
实施例2结核分歧杆菌的检测 本实施例采用实施例1制备所得反应管(反应液中的引物选择已知的结核分歧杆 菌检测用引物组)，对结核分歧杆菌进行LAMP检测，同时设有阳性对照组和阴性对照组，其 过程如图4所示，具体包括如下步骤 取实施例1制备的反应管三支，分别加入阴性对照样品、阳性对照样品和待检测 样品各2. 5ii L，加样时枪头穿透保护液层，样品加至华峰管大腔内，盖紧管盖并做好标记， 移至反应区。 将上述反应管均于65t:恒温反应lh。 反应结束，将反应管倒置甩动1次，再正置甩动1次，使工作液与显色液充分混合 均匀后观察。 若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现 橙色则为阴性。 观察反应结果，检测准确率高，而且LAMP反应过程中，显色液与工作液密封状态 好，没有发生互相泄露的情况，后期显色反应时，倒置甩动操作使得显色液和工作液混合， 显色结果清晰。 实施例3沙门氏菌的检测 本实施例采用实施例l制备所得反应管(反应液中的引物选择已知的沙门氏菌检 测用引物组)，对沙门氏菌进行LAMP检测，同时设有阳性对照组和阴性对照组，其过程如图 4所示，具体包括如下步骤 取实施例1制备的反应管三支，分别加入阴性对照样品、阳性对照样品和待检测 样品各2. 5ii L，加样时枪头穿透保护液层，样品加至华峰管大腔内，盖紧管盖并做好标记， 移至反应区。
将上述反应管均于65°。恒温反应lh。 反应结束，将反应管倒置甩动1次，再正置甩动1次，使工作液与显色液充分混合 均匀后观察。 若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现 橙色则为阴性。 观察反应结果，检测准确率高，而且LAMP反应过程中，显色液与工作液密封状态 好，没有发生互相泄露的情况，后期显色反应时，倒置甩动操作使得显色液和工作液混合， 显色结果清晰。 本实施例还进行了特异度试验，采用实施例1制备所得反应管对1株沙门氏菌和 6株非沙门氏菌进行检测，结果发现沙门氏菌的检测结果为阳性，6株非沙门氏菌的检测结 果均为阴性，说明本发明的反应管能够保证LAMP所需的高特异性，检测结果如图5所示。
本实施例还进行了灵敏度试验，制备沙门氏菌10—1 10—8共7个浓度的样品，采用 实施例1制备所得反应管进行检测，结果发现7个浓度的沙门氏菌均能被检测出来，由此说 明本发明的反应管能够保证LAMP反应所需的灵敏度，检测结果如图6所示。
权利要求
一种用于环介导等温扩增技术的反应管，其特征在于该反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。
2. 根据权利要求1所述反应管，其特征在于所述管体和隔板为一体成型。
3. 根据权利要求1所述反应管，其特征在于所述隔板的高度为管体高度的1/4 1/3。
4. 根据权利要求1所述的反应管，其特征在于所述A、B两个空腔中分别装有环介导等 温扩增反应工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由石蜡封存，所述环介导等温扩增 反应工作液为环介导等温扩增反应液和Bst DNA聚合酶的混合。
5. 根据权利要求4所述的反应管，其特征在于所述石蜡为熔点低于l(TC的石蜡。
6. 权利要求4所述反应管的使用方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1) 打开反应管管盖，选择装有环介导等温扩增反应工作液的空腔，将待测样品加入到 环介导等温扩增反应工作液中；(2) 加样结束后，将反应管进行环介导等温扩增反应；(3) 环介导等温扩增反应结束后，将反应管倒置甩动使显色液与工作液充分混合，室温 放置，观察显色结果。
全文摘要
本发明公开一种用于环介导等温扩增技术的反应管，该反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板，A、B两个空腔中分别装有环介导等温扩增反应工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由石蜡封存。本发明的反应管通过隔板和石蜡的设计，有效地将显色液和工作液分隔开来，不仅能保证在储运过程中相对保持完整封闭性，而且无需打开管盖，就可以实现显色反应，大大降低气溶胶的污染。本发明的反应管保证了环介导等温扩增的检测快速、高效性，成本低廉，有利于大规模推广。
文档编号C12M1/24GK101712924SQ20091021398
公开日2010年5月26日 申请日期2009年12月18日 优先权日2009年12月18日
发明者曹以诚, 李晓娜, 杜正平, 谢丽丽, 郭庆辉, 陈洵 申请人:广州华峰生物科技有限公司