专利名称：一种长pcr步移试剂盒及其使用方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及已知DNA片段侧翼未知序列的克隆领域，具体涉及一种长PCR步移试 剂盒及其使用方法和应用。
背景技术：
对于遗传及分子生物学相关研究而言，获取已知DNA序列侧翼未知序列是一项经 常面临的重要任务。比如在植物功能基因组学中分析T-DNA插入位点；了解细菌转座子 插入位点及携带的外源基因；根据已知的部分基因片段获取全长的基因；功能基因启动子 分析等。传统的获取已知DNA序列侧翼未知序列的方法是构建文库，然后对文库进行大量 筛选。这种方法不仅费时、费力、成本高，而且最终的结果依赖于构建文库的质量。因此，基 于PCR技术的基因组步移(PCR步移)成为人们感兴趣的目标。目前已经被使用的方法包 括反向PCR、接头PCR、热不对称交错PCR(Tail-PCR)。尽管这些方法在各自领域都有比较 广泛的使用，但是这些方法在实际应用中都具有各自的缺陷。在PCR操作前，反向PCR、接头 PCR需先对基因组进行酶切，然后进行连接(分子内成环或酶切片段与接头引物连接)，两 种方法对提取基因组的质量要求很高。由于侧翼序列的未知性通常需要对多个内切酶进行 筛选，因此具有盲目性；分子内成环以及接头连接效率也是构建能用于下一步PCR步移模 板的制约因素。因此实际操作中，一个设计合理的实验方案，往往并不能得到预期的结果， 反而增加了操作时间和耗费。源于半随机引物PCR方法的Tail-PCR是目前在植物基因组应 用非常广泛的扩增未知侧翼片段的方法。但是Tail-PCR设置程序复杂，为了得到持续稳定 且正确的PCR产物，需要对程序条件进行反复设置。此外采用有简并碱基末端的引物以及 Tail-PCR设置程序本身固有的限制，都致使这种方法不能获得长的侧翼未知片段并且产物 具有较多的假阳性。总概上述方法，均存在操作繁琐、非特异性片段较多、一次步移片段短 (小于1.5Kb)的缺陷。这些缺陷均限制了其更为广泛的应用，尽管获取侧翼未知序列是经 常面临的工作。因此十分有必要探索新的简单、快速、高效PCR步移方法，并开发成商业化 的试剂盒，广泛应用于各类分子生物学实验室。
发明内容
本发明目的在于根据现有技术的不足，提供一种简单、快速、高效的长PCR步移试剂盒。本发明另一目的在于提供上述长PCR步移试剂盒的使用方法。本发明还有一个目的在于阐明上述长PCR步移试剂盒的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现一种长PCR步移试剂盒，包括(1)试剂A 其中，每9. 25 12. 5μ L试剂A中包含 IOmmol/L 的 dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) 1 3 μ L，25mmol/LMgCl23 4 μ L，10 X PCR 缓冲液 5 μ L 及 LA Taq 酶 0· 25 0· 5 μ L ； (2)试剂 B ddH205 20mL ； (3)试剂 C 琼脂糖 5 20g ； (4)试 剂D :6XPCR上样缓冲液1 5mL ； (5)试剂E 核酸染料20 100 μ L ； (6)试剂F :50Χ电泳缓冲液l(T20mL ； (7)引物11条，序列如SEQ ID NO:广11所示，每条各10^50 μ L0上述6 XPCR上样缓冲液的成分为EDTA2(T30mmOl/L，甘油30 40体积％，二甲苯青 0. 0004 0. 0008g/ml 和溴酚蓝 0. 0004 0. 0006g/ml。上述50X电泳缓冲液中，每IL 50 X电泳缓冲液中含三羟甲基氨基甲烷242g， EDTA37. 2g，醋酸 57. lmL。本发明长步移试剂盒的使用方法由两轮PCR及后续的测序组成，具体步骤如下
(1) DNA提取，提取方法为常规方法，对基因组的完整性和纯度没有严格要求，对基 因组的物种来源没有限制；(2)第一轮长PCR步移根据已知的DNA序列设计与其互补的上游引物P，长 18 22bp，浓度为Γ2 μ mol/L,当反应体系为25 μ L时，加入试剂Α4. 2 6. 25 μ L，上游引物 Ρ0. 5 1. 0 μ L，DNA模板0. 5 2. OyL,余量为试剂B ；(3)第一轮长PCR步移扩增程序92 94°C预变性2 5min，92 94°C变性15 30s， 56 60°C退火3(T60s，68 72°C延伸3 lOmin，共进行30个循环后，将反应体系降温到 4 12°C，维持5 30min，在维持期间，迅速加入引物各0. 5 1. 0 μ L，引物序列如SEQ ID NO Γ10所示；加入引物后再进行一个循环，该循环程序为8(T86°C变性15、08，36 431变性 广3min，68 72°C延伸3 lOmin，68 72°C延伸5 8min ；所得PCR产物取1 μ L，加入试剂B，稀 释10 30倍，作为第二轮长PCR的DNA模板；(4)第二轮长PCR步移根据已知的DNA序列设计与其互补的上游引Q，长 26 29bp，浓度为10 20 μ mol/L,当反应体系为25 μ L时，加入试剂Α4. 2 6. 25 μ L，上游引物 Q0. 5 1.0 μ L，序列如SEQ ID NO :11所示的引物0. 5 1. 0 μ L，步骤(3)稀释得到的DNA模 板0. 5 2 μ L，余量为试剂B ；PCR反应对照组中，加入试剂Α4. 2 6. 25 μ L，序列如SEQ ID NO 11所示的引物0. 5^1. 0 μ L，步骤(3)稀释得到的DNA模板0. 5^2 μ L，余量为试剂B ；(5)第二轮长PCR步移扩增程序92 94°C预变性2 5min，92 94°C变性15 30s， 68°C变性并延伸3 lOmin，共30个循环，最后68°C延伸5 8min ；(6) PCR步移产物检测取第二轮长PCR步移产物及对照组PCR产物各3飞μ L，加 入0. 5^1 μ L试剂D混合，上样琼脂糖凝胶，将试剂F用去离子水稀释50倍用作电泳缓冲液， 电压10(T140V，电泳2(T40min ；电泳结束后紫外成像，胶样中，实验组出现而对照组中不出 现的条带即为阳性的PCR步移片段。其中，步骤(6)中，每IOOmL琼脂糖凝胶含有试剂ΕΓ5 yL ；所述阳性PCR步移片 段用于下游PCR产物测序或克隆测序。上述长步移试剂盒的原理如图1所示，在第一轮PCR中，上游引物P长2(Γ22碱 基，与已知序列特异互补，下游复合引物(如SEQ ID Ν0:广10所示)长39 40碱基，其5， 端包含29个固定碱基，3’端包含6 7个随机设计的碱基(GC ^50%)，中间区域为4个完 全简并的碱基(NNNN)。3’端及中部区域形成一个实际的退火位点，其退火温度相对较低 (38^430C )。引物P首先被加入反应体系，在较高的退火温度下(56飞4°C )进行线性特异 性扩增。然后下游复合引物(如SEQ ID N0:广10所示)加入快速冷却的反应系统，只进行 一个较低退火温度的循环。在这个循环中，变性温度改为8(T86°C。在这种变性温度下，原 始的模板DNA部分解链，从而减少下游复合引物与原始模板结合的机会，而增加其与新合 成的单链DNA结合引发延伸的机会。同时，下游复合引物浓度远大于引物P，因此在最后一轮PCR中，下游复合引物有更多的机会竞争结合模板，在唯一的一轮低严谨退火温度循环中，有效减少引物P与模板的非特异性结合。第一轮PCR最后一个循环实际起到将前面线 性扩增产生的单链DNA互补成双链DNA的作用。第一轮PCR产物经纯化并适当稀释后，用作第二轮PCR的模板。第二轮PCR上游 弓丨物Q与已知序列特异互补，位于引物P内侧；下游引物(如SEQ IDN0:11所示)与下游 复合引物(如SEQ ID NO:广10所示)的5，端完全相同。二条引物同时加入反应体系，进 行常规的长距离PCR即可。在第二轮PCR中，采用高严谨的退火温度(68°C，远高于第一轮 PCR退火温度)，第一轮反应中可能剩余的少量下游复合引物和P，不会产生干扰作用，因此 第一轮PCR产物不需要单独纯化去除引物。第二轮长PCR步移结束后，切胶回收阳性片段， 用于直接测序或克隆测序，即可获得已知DNA序列侧翼长片段未知序列。与现有技术相比，本发明长PCR步移试剂盒具有如下有益效果(1)本发明长PCR步移试剂盒简单、快捷。本发明对基因组的质量没有严格要求， 既可以采用试剂盒或传统的酚/氯仿提取方法，又可以使用最简单的水煮法；本发明无需 建库，也无需耗时较长的酶切、连接和固定步骤即可直接进行PCR反应；(2)本发明长PCR步移试剂盒高效、可靠。本发明只需两次长PCR过程即可特异性 地将所需的长翼片段扩增出来，且非特异性片段少，较之传统操作繁琐、非特异性片段多、 产物片段短的方法明显高效；(3)本发明长PCR步移试剂盒的成本大大降低。本试剂盒及使用方法不需要精提 模板DNA，也不需要酶切筛选、连接或对第一轮PCR产物进行纯化，摒除了常用方法中需要 多种酶切的寻找合适内切酶的过程，因此在实际操作中，实验耗费大大降低；(4)本发明长PCR步移试剂盒的应用前景广阔。由于本发明采用引物3’端碱基 随机配置，因此没有使用物种范围的限制，微生物、动物、植物均可使用。常规方法扩增片段 短，在实际应用中一次步移达不到需要了解的序列长度范围，本发明一次就可以获得长的 片段(大于3Kb)，减少了步移操作，用于分子生物学实验室中可以加快科研速度；用于商业 化生产中，可以提高生产效率，具有十分广阔的应用前景。
图1是本发明长PCR步移试剂盒的原理图；图2是实施例1中的PCR产物凝胶电泳图，其中，A是引物1 (SEQ ID NO 1)参与 扩增产生的条带，B是引物5 (SEQ ID NO 5)参与扩增产生的条带；图3是实施例2中的PCR产物凝胶电泳图，其中，A、B和C是引物10 (SEQID NO: 10)参与扩增产生的三条阳性条带。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1长PCR步移用于扩增获得溶藻弧菌E0601类霍乱弧菌转座子valT侧翼未知DNA 序列。按以下配方配制试剂。
试剂盒组成1)试剂 A 为反应预混体系 500 μ L。每 10. 5 μ L 包含 1 μ L dNTP (dATP、dTTP、dGTP、 dCTP 各 10mmol/L)，4 μ L MgCl2 (25mmol/L)，5 μ L IOXPCR buffer, 0. 5 μ LLA Taq 酶；2)试剂 B 为 IOmL ddH20 ；3)试剂C:为琼脂糖，6g;4)试剂D :6XPCR产物上样缓冲液lmL，其成份为30mmol/L EDTA,36% (V/V)甘 油、0.05% (ff/V) 二甲苯青、0.05% (W/V)溴酚蓝。5)试剂 E 为 Goldview 核酸染料，40 μ L ；6)试剂F 为50 X TAE缓冲液10mL，每IL含三羟甲基氨基甲烷242g、ETDA37. 2g、 醋酸 57. lmL。7)引物系列，浓度ΙΟμ θΙ/L，各10 μ L0序列如SEQ ID NO :1 10所示；8)引物一条，10 μ L，浓度 10 μ mol/L，其序列如 SEQ ID N0:11 所示。按以下程序进行操作(1)根据已知的溶藻弧菌E0601类霍乱弧菌转座子valT部分序列，设计特异性引 物VapFl及VapF2，配制浓度分别为1 μ mol/L、10 μ mol/L。其序列如下VapFl :GTTCTATCCGACCATAGATG(SEQ ID NO 12)；VapF2 TGGGCTAACCTCGGATAGACAGGATTACT(SEQ ID NO 13)；(2)模板DNA提取最简单的水煮法进行。取过夜培养溶藻弧菌E06011mL，5000g 离心5min取沉淀，加入100 μ L ddH20，100°C水浴lOmin，IOOOOg离心5min，取上清即为模 板 DNA ；(3)取10个PCR反应管，分别加入试剂A 4. 75 μ L、0. 5 μ L引物VapFl、上述稀释 之DNA模板各1 μ L、18. 75 μ L试剂B，混勻；(4)第一轮长PCR步移反应条件92°C预变性2min，92°C变性15s，58°C退火30s， 68°C延伸5min，共进行30个循环；然后反应体系降温到4 12°C维持lOmin，在低温维持期 间，迅速在PCR反应管中各加入引物系列(SEQ IDNO 广10)各0.5 μ L。引物加入后，跳过低 温维持步骤。再进行一个循环，该循环包括84°C变性30s，4(TC变性2min，68°C延伸5min。 最后68°C延伸8min ；取上述PCR产物各1 μ L，加入试剂B 10 μ L，成稀释模板；(5)取10个PCR反应管，分别加入引物VapF2、引物(SEQ ID NO :11) 0. 5 μ L、上述 稀释模板1 μ L、试剂A 4. 75 μ L、试剂B 18. 25 μ L0另取10个PCR反应管，加入引物(SEQ ID NO 11)1 μ L、上述稀释模板1 μ L、试剂A 4. 75 μ L、试剂B 18. 25 μ L，分别用作上述各实 验管的对照管；(6)第二轮长PCR步移程序92°C预变性2min，92°C变性15s，68°C变性并延伸 5min，共进行30个循环，最后68°C延伸8min ；(7)取第二轮长PCR步移产物及对照管PCR产物各5 μ L与1 μ L试剂D混合，上 样0.7%琼脂糖凝胶(每IOOmL凝胶含试剂E 2 μ L)。将试剂F用去离子水稀释50倍，用 作电泳缓冲液。电压120V，电泳30min ；(8)电泳结束后，紫外成像。胶样中，凡实验管中PCR产物出现而相应对照管PCR产物不出现的条带即为阳性的PCR步移片段。在本实例的10条引物系列中，引物1 (SEQ ID NO 1)和5(SEQ ID NO 5)分别产生了长度约2. OKb,4. OKb的阳性片段，而对照均没有条带产生(见附图2，A、B 二个条带。只显示引物广6所产生的结果)。将使用引物5所产生第 二轮PCR步移产物(长约4. OKb)克隆测序，测序结果证明其为已知序列部分正确的延伸， 第二轮长PCR步移获得了长达3820bp的片段(序列见Genbank数据库，登录号EU787499)， 引物5及VapF2均正确地参入到PCR产应中。该结果证实了方法的可靠性和有效性。实施例2根据部分创伤弧菌1. 1758rpoB基因部分序列，采用长PCR步移扩增rpoB近全长 基因。按以下配方配制试剂1)试剂 A 反应预混体系 300 μ L0 每 11. 4 μ L 试剂 A 包含 2 μ L dNTP (dATP、dTTP、 dGTP、dCTP 各 10mmol/L)，4μ L MgCl2 (25mmol/L)，5 μ L 10XPCR buffer，。· 4μ L LATaq 酶；2)试剂 B 为 20mL ddH20 ；3)试剂C:为琼脂糖，IOg ；4)试剂D :6XPCR产物上样缓冲液lmL，其成份为25mmol/L EDTA,30% (Υ/Υ)甘 油、0.06% (ff/V) 二甲苯青、0.04% (W/V)溴酚蓝；5)试剂 E 为 Goldview 核酸染料，30 μ L ；6)试剂F 为50XTAE缓冲液30mL，每lL含三羟甲基氨基甲烷242g、ETDA 37. 2g、 醋酸 57. ImL ；7)引物系列，浓度15ymol/L，各10μ L。序列如SEQ ID NO:广10所示；8)引物一条，15 μ L，浓度15 μ M，其序列如SEQ ID Ν0:11所示。按以下程序进行操作(1)根据已知的创伤弧菌1. 1758rpoB基因部分序列，设计特异性引物rpoFl及 rpoF2,配制浓度分别为2 μ mol/L、15 μ mol/L。其序列如下rpoFl :TGGTTTACTCTTATACCGAG(SEQ ID NO 14)；rpoF2 TATACCGAGAAAAAGCGCATCCGTAAGGA(SEQ ID NO 15)；(2)模板DNA提取最简单的水煮法进行。取过夜培养创伤弧菌1. 17581mL,6000g 离心3min取沉淀，加入80 μ L ddH20,100°C水浴lOmin，IOOOOg离心4min，取上清即为模板 DNA ；(3)取10个PCR反应管，分别加入试剂A 5. 7 μ L、0. 5 μ L引物rpoFl、上述DNA模 板各1 μ L、17. 8 μ L试剂B，混勻；(4)第一轮长PCR步移反应条件94°C预变性2min，94°C变性15s，60°C退火30s， 68°C延伸3min，共进行30个循环；然后反应体系降温到12°C维持lOmin，在低温维持期间， 迅速在PCR反应管中各加入引物系列(SEQ IDNO 广10)各0.5 μ L。引物加入后，跳过低温 维持步骤。再进行一个循环，该循环包括86°C变性30s，43°C变性2min，68°C延伸4min。最 后68 °C延伸8min ；(5)取上述PCR产物各1 μ L，加入试剂B 15 μ L,成稀释模板；(6)取10个PCR反应管，分别加入rpoF2、引物(SEQ ID NO 11)0. 5 μ L、上述稀释 模板1 μ L、试剂A 5. 7 μ L、试剂B 17. 3yL。另取10个PCR反应管，加入引物(SEQ ID NO: 11) 1 μ L、上述稀释模板1 μ L、试剂A 5. 7 μ L、试剂B 17. 3 μ L，分别用作上述各实验管的对眧管.
/、、、Izzt 9(7)第二轮长PCR步移程序92°C预变性3min，92°C变性20s，68°C变性并延伸3min，共进行30个循环，最后68°C延伸8min ；(8)取第二轮长PCR步移产物及对照管PCR产物各3μ L与0.5μ L试剂D混合，上 样0.8%琼脂糖凝胶(每IOOmL凝胶含试剂E 2 μ L)。将试剂F用去离子水稀释50倍，用 作电泳缓冲液。电压100V，电泳30min ；(9)电泳结束后，紫外成像。胶样中，凡实验管中PCR产物出现而相应对照管PCR 产物不出现的条带即为阳性的PCR步移片段。在本实例的10条引物系列中，引物10(SEQ ID NO 10)产生了长度约0. 9Kb,3. OKb和4. OKb的阳性片段，而对照及其它引物均没有条 带产生(见附图3，A、B、C三个条带，只显示引物10所产生的结果)。将使用引物10所产 生第二轮PCR步移产物(分别长约0. 9Kb,3. 0Kb,4. 0Kb)克隆测序，测序结果证明三者均为 已知序列部分正确的延伸，引物10及VapF2均正确地参入到PCR产应中，而引物10在本实 例PCR延伸范围内共有3个结合位点。该结果再一次证实了方法的可靠性和有效性。一种长PCR步移试剂盒及其使用方法和应用序列表SEQUENCE LISTING<110>中国科学院南海海洋研究所<120> 一种长PCR步移试剂盒及其使用方法和应用<130><160>15<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211 >40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a, c, g, or t<400>1tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnnctgctga 40<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a, c, g, or t<400>2tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnngacgact 40<210>3<211>40
<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a, c, g, or t<400>3tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnncagcagt 40<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a, c, g, or t<400>4tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnngtcgtca 40<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a, c, g, or t<400>5tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnngctctca 40<210>6<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a, c, g, or t<400>6tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnnggatcca 40
<210>7
<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a，c, g, or t<400>7tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnnggtacca 40<210>8<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a，c, g, or t<400>8tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnngactcta 40<210>9<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a，c, g, or t<400>9tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnnacgcgta 40<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a，c, g, or t<400>10tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnngtgcaca 40
<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>11tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctg29<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>12gttctatccg accatagatg20<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>13tgggctaacc tcggatagac aggattact29<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14tggtttactc ttataccgag20<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>15tataccgaga aaaagcgcat ccgtaagga29.
权利要求
一种长PCR步移试剂盒，其特征在于包括(1)试剂A其中，每9.25~12.5μL试剂A中包含10mmol/L的dNTP1~3μL，25mmol/LMgCl23~4μL，10×PCR缓冲液5μL及LA Taq酶0.25~0.5μL；(2)试剂BddH2O5~20mL；(3)试剂C琼脂糖5~20g；(4)试剂D6×PCR上样缓冲液1~5mL；(5)试剂E核酸染料20~100μL；(6)试剂F50×电泳缓冲液10~20mL；(7)引物11条，序列如SEQ ID NO1~11所示，每条各10~50μL。
2.根据权利要求1所述的长PCR步移试剂盒，其特征在于所述6XPCR上样缓冲液 的成分为EDTA2(T30mmol/L，甘油30 40体积％，二甲苯青0. 0004 0. 0008g/ml和溴酚蓝 0.0004 0. 0006g/ml。
3.根据权利要求1所述的长PCR步移试剂盒，其特征在于每IL50 X电泳缓冲液中含 三羟甲基氨基甲烷242g，EDTA37. 2g，醋酸57. lmL。
4.权利要求3所述的长PCR步移试剂盒的使用方法，其特征在于所述方法包括如下步骤(1)DNA提取；(2)第一轮长PCR步移根据已知的DNA序列设计与其互补的上游引物P，长 18 22bp，浓度为Γ2 μ mol/L,当反应体系为25 μ L时，加入试剂Α4. 2 6. 25 μ L，上游引物 Ρ0. 5 1. 0 μ L，DNA模板0. 5 2. OyL,余量为试剂B ；(3)第一轮长PCR步移扩增程序:92 94V预变性2 5min，92 94 V变性15 30s， 56 60 °C退火3(T60s，68 72 V延伸3 lOmin，共进行30个循环后，将反应体系降温到 4 12°C，维持5 30min，在维持期间，迅速加入引物各0. 5 1. 0 μ L，引物序列如SEQ ID NO 广10所示；加入引物后再进行一个循环，该循环程序为8(T86°C变性15、08，36 431变性 广3min，68 72°C延伸3 lOmin，68 72°C延伸5 8min ；所得PCR产物取1 μ L，加入试剂B，稀 释10 30倍，作为第二轮长PCR的DNA模板；(4)第二轮长PCR步移根据已知的DNA序列设计与其互补的上游引Q，长26 29bp， 浓度为10 20 μ mol/L,当反应体系为25 μ L时，加入试剂Α4. 2 6. 25 μ L，上游引物 Q0. 5 1.0 μ L，序列如SEQ ID NO :11所示的引物0. 5 1. 0 μ L，步骤(3)稀释得到的DNA模 板0. 5 2 μ L，余量为试剂B ；PCR反应对照组中，加入试剂Α4. 2 6. 25 μ L，序列如SEQ ID NO 11所示的引物0. 5^1. 0 μ L，步骤(3)稀释得到的DNA模板0. 5^2 μ L，余量为试剂B ；(5)第二轮长PCR步移扩增程序92 94°C预变性2 5min，92 94°C变性15 30s，68°C变 性并延伸3 lOmin，共30个循环，最后68°C延伸5 8min ；(6)PCR步移产物检测取第二轮长PCR步移产物及对照组PCR产物各3飞μL，加入 0. 5^1 μ L试剂D混合，上样琼脂糖凝胶，将试剂F用去离子水稀释50倍用作电泳缓冲液，电 压10(T140V，电泳2(T40min ；电泳结束后紫外成像，胶样中，实验组出现而对照组中不出现 的条带即为阳性的PCR步移片段。
5.根据权利要求4所述的长PCR步移试剂盒的使用方法，其特征在于步骤(6)中，每 IOOmL琼脂糖凝胶含有试剂Ε1 5 μ L。
6.根据权利要求4或5所述的长PCR步移试剂盒的使用方法，其特征在于步骤(6)中 所述阳性PCR步移片段用于下游PCR产物测序或克隆测序。
7.权利要求广3中任意一条权利要求所述的长PCR步移试剂盒的应用，其特征在于所 述长PCR步移试剂盒用于克隆已知DNA片段侧翼的未知序列。
全文摘要
本发明公开了一种长PCR步移试剂盒及其使用方法和应用。本发明长PCR步移试剂盒包括(1)试剂A其中，每9.25~12.5μL试剂A中包含10mmol/L的dNTP1~3μL，25mmol/L MgCl23~4μL，10×PCR缓冲液5μL及LA Taq酶0.25~0.5μL；(2)试剂BddH2O5~20mL；(3)试剂C琼脂糖5~20g；(4)试剂D6×PCR上样缓冲液1~5mL；(5)试剂E核酸染料20~100μL；(6)试剂F50×电泳缓冲液10~20mL；(7)引物11条，序列如SEQ ID NO1~11所示，每条各10~50μL。本发明长PCR步移试剂盒成本低，较之其它扩增方法明显简单、快速，效率高，一次即可获得长达3Kb以上的侧翼片段，用于获取DNA侧翼未知序列没有物种限制，可广泛用于分子生物学实验中。
文档编号C12R1/63GK101812494SQ200910214350
公开日2010年8月25日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者任春华, 罗鹏, 胡超群, 苏婷 申请人:中国科学院南海海洋研究所