专利名称：利用肠杆菌发酵生产2,3-丁二醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用葡萄糖为底物作为原料进行发酵生产2，3-丁二醇的方法， 属于生物化工技术领域。
背景技术：
2，3-丁二醇是一种重要的化工原料，广泛用于化工、食品、药品、原料以及航空航 天等领域。2，3-丁二醇是无色至微黄透明稠状液体，其具有很高的价值，常用于增加酒的 香气，使之醇甜、浓厚。在我国，2， 3- 丁二醇常被添加到白酒中，以改善白酒的风味；2， 3- 丁 二醇其有低的凝固点(-6(TC)，可以作为防冻剂；2，3-丁二醇和其他的液体燃料相比，其燃 烧值高达27198J/g，因此可以作为液体原料来使用；由于2， 3- 丁二醇有很高的辛烷数，可 以用作更高级燃料-航空燃料。除此之外，2，3-丁二醇还有一些特殊的性质其通过催化 脱氢可以转化成二乙酰，而该物质是一种高值的食品添加剂，能够改善食品的风味。酯化后 的2，3-丁二醇可作为医药和化妆品的杀菌剂，0. 1%的该溶液能够杀死大多数的病毒性细 菌。2，3-丁二醇与乙酸反应生成2，3-丁二醇二乙酸酯，此酯类可加到奶油中改善风味。2， 3- 丁二醇还是一种具有旋光性的手性化合物，常被用来作为药物的载体，因此具有很高的 医用和药用价值 2. 3- 丁二醇结构具有很高的特殊性，因此化学法合成2， 3- 丁二醇工艺过程复杂， 而且成本较高，所以一直难以实现工业化大生产，因此目前生产2，3-丁二醇的方法主要是 生物转化法。利用生物发酵方法生产2，3-丁二醇具有很大的优势，微生物在发酵过程中 可用的底物十分广泛，即可利用常规底物，还可以利用各种废弃物进行发酵生产2， 3-丁二醇。
发明内容
本发明的目的是提供肠杆菌进行厌氧发酵生产2， 3- 丁二醇的方法，2， 3- 丁二醇 的产生完全是在厌氧或者兼性厌氧的条件下产生的，发酵液经过处理后即可得到纯净的2， 3-丁二醇。 为实现上述目的，本发明的技术方案如下 (1)菌种本发明以河底污泥为菌源，经过多次稀释后，从河底污泥中筛选出了一 株能发酵生产2， 3- 丁二醇的菌种，经过经16S rDNA鉴定，该菌种和Enterobacter sp. Y5 的同源性达到100%，应此可以确定该菌种为Enterobacter sp. Y5 ; (2)底物本发明主要采用葡萄糖，其他各种废弃物(如秸秆等)本菌种也可以利 用； (3)种子液体培养基葡萄糖8 10g/L;蛋白胨3 5g/L;酵母粉2 4g/L; NaC12 4g/L ;K2HP040. 5 1. 5g/L ;MgCl 0. 2 0. 4g/L ;用浓磷酸将其pH调节到5. 4 6. 8 ;固体培养基液体培养基+1. 5%琼脂； (4)发酵液培养基葡萄糖18 24g/L ;胰蛋白胨4 6g/L ;牛肉膏2 4g/L ;酵母粉1 2g/L ;NaCl 3 5g/L ;KH2P041 3g/L ;MgS040. 1 0. 3g/L ;L-半胱氨酸0. 3 1. 0g/L ;微量元素液(MnS04. 7H20 0. 01g/L， ZnS04. 7H200. 05g/L， H萬O. 01g/L， CaCl2. 2H20 0. 01g/L， NaMo040. 01g/L， A1K(S04)20. 01g/L)8 15mL ; (5)种子的活化将菌种Enterobacter sp. Y5接一环到固体种子培养基上进行种 子的活化，然后将活化好的种子转接到液体种子培养基上进行种子扩大化培养，用封口膜 封好培养瓶，将其放置在30 3『C的摇床中进行种子的扩大化培养，摇床的转速为120 220rmp，培养8_10个小时。 (6)将步骤(5)中的种子液按装液量的4% 8%的接入到发酵反应瓶中，用硅胶 塞塞好反应瓶。接完种后，向反应瓶中冲入0.2 0. 5vvm的惰性气体(氩气或者氮气)，将 反应装置放置在摇床中空气浴培养；培养条件为30 3『C，转速为120 220rmp，培养时 间为10 14小时，发酵液即为含有2，3-丁二醇的液体，发酵液经过处理后利用气相色谱 FID检测器检测其中2， 3- 丁二醇的含量； (7)对步骤(6)培养完后的发酵液进行离心、蒸馏、分离纯化等处理，可得到纯的 2，3-丁二醇。 本发明采用的肠杆菌发酵过程简单，反应周期短，具有较高的应有价值和利用前 景；本发明发酵培养基使用混合氮源(胰蛋白胨/牛肉膏/酵母粉)，并加入适量L-半胱 氨酸，可明显提高2， 3- 丁二醇的转化率。
具体实施例方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 : 发酵培养基的配方如下 葡萄糖20g/L ;胰蛋白胨4g/L ;NaCl 4g/L ;KH2P041. 5g/L ;MgS040. 3g/L ;微量 元素液(MnS04.7H20 0. 01g/L， ZnS04. 7H20 0. 05g/L， H萬O. 01g/L， CaCl2. 2H20 0. 01g/L， NaMo040 . 01g/L， A1K(S04)20. Olg/L) 10mL。 pH用磷酸调节到5. 8，反应装置采用250mL三角 瓶，其装样量为150mL，12rC条件下灭菌20min。 将菌种活化后进行扩大培养，其培养条件为35t:，转速为130rmp。然后将上述种 子液按4%的接种量接种到发酵培养基中，采用硅胶塞塞好三角瓶口 ，用石蜡密封瓶口 。然 后向反应瓶中冲入0. 2vvm氩气。将上述培养装置放置于摇床中培养，其培养条件为35°C， 转速为150rmp，发酵过程持续12小时。发酵过程定时检测细胞浓度和2，3-丁二醇的含量。 发酵完后细胞浓度达到了 4. 24 (0D6。。) ， 150mL培养基发酵液中2， 3- 丁二醇的产量达到了 0.91g。发酵完后2，3-丁二醇的产量达到了 6.06g/L，2，3-丁二醇的转化率达到了理论转 化率的60. 6%。
实施例2:
发酵培养基的配方如下 葡萄糖20g/L ;牛肉膏4g/L ;NaCl 4g/L ;KH2P041. 5g/L ;MgS040. 3g/L ;微量元 素液(MnS04.7H20 0. Olg/L， ZnS04. 7H20 0. 05g/L， H3B030 . 01g/L， CaCl2. 2H20 0. 01g/L， NaMo040 . 01g/L， A1K(S04)20. Olg/L) 10mL。 pH用磷酸调节到5. 8，反应装置采用250mL三角 瓶，其装样量为150mL，12rC条件下灭菌20min。
培养方式及其检测方式同实例l，发酵完后细胞浓度达到了 4. 04(0D6。。) ， 150mL培
养基发酵液中2，3-丁二醇的产量达到了 0. 90g。发酵完后2，3-丁二醇的产量达到了 6. Og/
L， 2， 3- 丁二醇的转化率达到了理论转化率的60 % 。 实施例3 : 发酵培养基的配方如下 葡萄糖20g/L ;胰蛋白胨4g/L ;牛肉膏4g/L ;NaCl 4g/L ;KH2P041. 5g/L ; MgS040. 3g/L ;微量元素液(MnS04. 7H20 0. 01g/L， ZnS04. 7H20 0. 05g/L， H萬O. 01g/L， CaCl2. 2H20 0. 01g/L， NaMo040. 01g/L， A1K(S04)20. Olg/L) 10mL。 pH用磷酸调节到5. 8，反应 装置采用250mL三角瓶，其装样量为150mL，12rC条件下灭菌20min。 其培养方式及其检测方式同实例l，发酵完后细胞浓度达到了 4. 27(0D6。。) ， 150mL 培养基发酵液中2，3-丁二醇的产量达到了 0.94g。发酵完后2，3-丁二醇的产量达到了
6. 27g/L，2，3- 丁二醇的转化率达到了理论转化率的62. 7%。
实施例4 : 发酵培养基的配方如下 葡萄糖20g/L ;胰蛋白胨4g/L ;牛肉膏4g/L ;酵母粉lg/L ;NaCl 4g/L ;KH2P041. 5g/ L ;MgS040. 3g/L ;L-cysteine 0. 7g/L ;微量元素液(MnS04. 7H200. 01g/L， ZnS04. 7H20 0. 05g/ L， H3B030. 01g/L， CaCl2. 2H20 0. 01g/L， NaMo040. 01g/L， A1K(S04)20. Olg/L) 10mL。 pH用磷酸 调节到5.8，反应装置采用250mL三角瓶，其装样量为150mL， 12rC条件下灭菌20min。
其培养方式及其检测方式同实例l，发酵完后细胞浓度达到了 4. 26(0D6。。) ， 150mL 培养基发酵液中2，3-丁二醇的产量达到了 1. lg。发酵完后2，3-丁二醇的产量达到了
7. 33g/L，2，3- 丁二醇的转化率达到了理论转化率的73. 3%。
实施例5: 与实施例4类似，不同之处在于没有加入L-cysteine。发酵完后细胞浓度达到了
4.31(0D6。。)，150mL培养基发酵液中2， 3-丁二醇的产量达到了 0. 975g。发酵完后2，3-丁
二醇的产量达到了 6. 5g/L，2，3-丁二醇的转化率达到了理论转化率的65%。 实施例6 : 具体的培养基成分如下 葡萄糖24g/L ;胰蛋白胨6g/L ;牛肉膏4g/L ;酵母粉1. 5g/L ;NaCl 4 ;KH2P041. 5g/ L ;MgS040. 3g/L ;L-cysteine 0. 7g/L ;微量元素液(MnS04. 7H200. 01g/L， ZnS04. 7H20 0. 05g/ L， H3B030 . 01g/L， CaCl2. 2H20 0. 01g/L， NaMo040 . 01g/L， A1K(S04)20. Olg/L) lOmL ;培养基的 pH采用浓度为0. 2mol/L的柠檬酸缓冲体系(pH = 4. 4)调到6. 4。培养的装置采用250mL 的三角瓶，其装样量为150mL。上述培养基在12rC高温灭菌20min。 其培养方式和检测方法同实例1，发酵完后细胞浓度达到了 4. 52 (0D6。。) ， 150mL培 养基产生的2，3-丁二醇的量为1.26g。其产率达到了8. 4g/L，2，3-丁二醇的转化率达到了 理论转化率的70%。
权利要求
肠杆菌Enterobacter sp.Y5在发酵生产2，3-丁二醇中的应用。
2. 根据权利要求1所述用途，其特征在于发酵培养基的组成如下葡萄糖18 24g/L ;胰蛋白胨4 6g/L ;牛肉膏2 4g/L ;酵母粉1 2g/L ;NaCl 3 5g/L ;KH2P04 1 3g/L ;MgS04 0. 1 0. 3g/L ;L-半胱氨酸0. 3 1. 0g/L ;微量元素液8 15mL。
3. 根据权利要求2所述用途，其特征在于L-半胱氨酸为0. 3 1. Og/L。
4. 根据权利要求2所述用途，其特征在于微量元素液组成为MnS04. 7H200. Olg/ L， ZnS04. 7H20 0. 05g/L， H3B03 0. 01g/L， CaCl2. 2H20 0. 01g/L， NaMo04 0. 01g/L， A1K(S04)20. 01g/L。
5. 根据权利要求1至4任意之一所述用途，其特征在于肠杆菌Enterobactersp. Y5发 酵生产2，3-丁二醇步骤如下(1) Enterobacter sp. Y5禾中子的活化从培养皿中用接种环取一环菌种到平板上进行平板划线，将其放置在36t:下静止培养 24小时；种子液体培养基葡萄糖8 10g/L ;蛋白胨3 5g/L ;酵母粉2 4g/L ;NaCl 2 4g/L ;K2HP04 0. 5 1. 5g/L ;MgCl 0. 2 0. 4g/L ;用浓磷酸将其pH调节到5. 4 6. 8 ;固体培养基液体培养基+1. 5%琼脂；(2) 将上述步骤(1)中固体培养基上的菌种转接到上述步骤(1)中的液体培养基中进 行种子的活化培养，液体种子液的活化采用100mL三角瓶，培养温度为30 38°C ，培养时间 为8-10小时；(3) 将上述步骤(2)种子液按4% 8%的接种量接入到发酵反应装置中，用硅胶塞塞 好反应瓶，然后向反应装置中冲入惰性气体，将其放置于空气浴中培养，培养时间为10 14小时，发酵液即为含有2，3-丁二醇的液体；(4) 提取、分离得到2，3-丁二醇。
全文摘要
本发明公开了利用肠杆菌Enterobacter sp.Y5发酵生产2，3-丁二醇的方法，其发酵培养基组成为葡萄糖18～24g/L；胰蛋白胨4～6g/L；牛肉膏2～4g/L；酵母粉1～2g/L；NaCl 3～5g/L；KH2PO4 1～3g/L；MgSO4 0.1～0.3g/L；L-半胱氨酸0.3～1.0g/L；微量元素液8～15ml，肠杆菌Enterobacter sp.Y5经过种子培养和发酵培养得到2，3-丁二醇。本发明发酵过程简单，发酵周期短。
文档编号C12R1/01GK101709281SQ20091021950
公开日2010年5月19日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者惠俊峰, 朱晨辉, 范代娣, 陈火晴, 马晓轩 申请人:西北大学