专利名称：一种用于防治番茄叶霉病的糖丝菌及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物农药技术领域，涉及一种用于防治番茄叶霉病的新菌株，特别涉 及一种用于防治番茄叶霉病的糖丝菌及其制备方法。
背景技术：
番茄叶霉病(Fulvia fulva (Cook) Ciferri)，俗称“黑毛病”，是番茄生产中普遍发 生的病害，尤其在保护地内危害更为严重，此病一旦发生，迅速蔓延，给番茄生产带来了巨 大的损失。番茄叶霉病是由半知菌亚门真菌引致的典型流行性病害，具有间歇爆发的特点。 病菌除引致叶片病斑影响光合作用外，还可侵染茎和果实，影响果实品质，降低食用价值， 造成经济损失。近几年由于保护地番茄种植面积的扩大，加之保护地栽培环境条件有利于 叶霉病的发生流行，因此叶霉病有逐年加重的趋势，至今已成为番茄生产上最严重的病害 之一。其原因之一与防治措施的不合理有关。为有效地控制叶霉病的危害，我国科研工作者对叶霉病菌的病害流行规律以及综 合防治等方面进行了广泛的研究，制定出了一系列防治措施，包括药剂防治、生物防治。化 学农药的大量使用造成严重的环境污染，农产品的农药残留，病菌抗药性、耐药性。这些问 题已对人们的生活产生了严重影响，而生物防治可以最大限度地减少化学农药的用量，以 改善生态环境。国内拮抗菌对番茄叶霉病菌的皿内拮抗试验较常见，但利用拮抗菌防治番茄叶霉 病的例子并不多，防治番茄叶霉病的生防制剂就更少了。植物内生菌是一种能在植物组织中定殖与运转，对植物无害甚至有益的微生物， 由于它在植物体内有稳定的生存空间，且能产生与宿主植物代谢相同或相似的生理活性物 质，因而能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性。近几年，内生菌因其独特 的优点在生物防治方面比根围、叶围等微生物更具有应用潜力，从而成为生物防治的研究 热点，为生物防治的应用开辟了新的天地。本发明将报道一株内生放线菌——杨凌糖丝菌 Hhs. 015菌株的发现及其防病作用。
发明内容
本发明的目的旨在探寻生物农药的新来源，利用植物内生菌资源而开发一 种可以用于番茄灰霉病防治的高效、可产业化生产的放线菌菌株，提供杨凌糖丝菌 (Saccharothrix yanglingensis)Hhs. 015 白勺ff选、鉴定方^去。实现上述发明目的的技术方案具体如下一种杨凌糖丝菌Hhs. 015菌株(以下简称为Hhs. 015菌株)，于2009年6月保藏 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCN0. 3023，分类命 名杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis)，保藏单位地址北京市朝阳区大屯路中国 科学院微生物研究所，邮政编码100101。该菌株还于2009年10月保藏在韩国生物科学 和生物技术研究所典型培养物保藏中心，编号为Saccharothrix yanglingensis Hhs. 015τ/ KCTC 19722τ。
本发明Hhs. 015菌株的制备方法，具体方法包括下列步骤1)将待分离的黄瓜根用自来水冲洗后展开晾干，表面消毒后用无菌手术刀切成 0. 5X0. 5mm大小的薄片。2)将表面消毒后的黄瓜根组织块置于含有高氏一号平板上，28士 1°C培养箱中培 养21d后统计放线菌菌落数并进行纯化，可分离到Hhs. 015菌株，于-80°C保藏。所述的表面消毒的条件是剪取健康植物样品的根用清水洗净后，在99%乙醇中 浸lmin，然后在3. 125%的NaOCl中浸6min，再次放入99%乙醇中浸30sec，最后用无菌水 冲洗5次。检测表面消毒是否彻底的方法是将消毒后的无菌水取200 μ L涂在PDA平板上。本发明的Hhs. 015菌株经菌落和形态的显微观察、细胞化学组成分析、常规生 理生化特性实验、16S rDNA序列分析以及与相似菌株杂交，该菌株鉴定为的一个新菌株 (Hhs. 015)，具有以下特征(A)形态特征基生菌丝细长，舒展，发达；多分枝，无隔。气生菌丝细密柔曲，顶部 螺旋状，生长不旺盛，易断裂。培养后期，气生菌丝成熟，分化成孢子链，少螺旋，松散。革兰 氏染色阳性；(B)培养特征初期，菌株在培养基上表面光滑，杏黄色，没有明显的气生菌丝，不 产生可溶性色素。随着培养时间的增加，菌落表面向下浅裂，产生栗肉白的气生菌丝，呈放 线状。菌落表面产生少量的露珠状分泌物。(C)生理生化特征不能使牛奶凝固，也不能胨化，可使石蕊牛奶变红；可水解淀 粉；产卵磷脂酶；不产生硫化氢；产生黑色素；不能使明胶水解；产生纤维素酶；能还原硝 酸盐。生长温度15 37°C，最适生长温度为28°C ；能利用糊精、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、半 乳糖、麦芽糖、甘油、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、肌醇、木糖、山梨醇；不能利用甘露糖、马尿酸 钠、棉子糖。能以甘氨酸、丙氨酸、色氨酸为氮源；不能利用赖氨酸、L-半胱氨酸、胱氨酸、瓜 氨酸、尿素、D，L-酪氨酸、天门冬氨酸。(D) 16S rDNA序列分析结果在GeneBank中进行最大同源性比较，发现16s rDNA 测序结果与糖丝菌属16S rDNA序列同源性达到99%。(E)Hhs. 015菌株与相似菌株杂交结果表明两株菌DNA同源性为33. 81%，而不同 种之间同源性要求低于70%，所以Hhs. 015是糖丝菌属一个新种。本发明还有一个目的是提供Hhs. 015菌株的菌体，它是按照下列方法制备的 将-80°C保藏的杨凌糖丝菌Hhs. 015菌株接种在高氏一号培养基上，28°C培养4d后，将其单 菌落接种到IOOmL黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养48h，然后按照
的种子液接种到IOOmL的黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养120h，发酵液 经5000rpm离心20min后，所得沉淀物即为杨凌糖丝菌Hhs. 015菌株的菌体。所述的黄豆粉液体培养液由大豆粉20g(沸水煮30min，过滤保留滤液)，蔗糖10g， 可溶性淀粉 5g，蛋白胨 2g，酵母膏 2g，NaC12g, CaCO3Ig, MgS04-7H200. 5g，KH2PO4O. 5g，琼脂 15g, H2O IOOOmL 组成，且 pH 值为 7. 2。本发明还有一个目的是提供Hhs. 015菌株的抗菌活性物质，它是按照下列方法制 备的将-80°C保藏的杨凌糖丝菌Hhs. 015菌株接种在高氏一号培养基上，28°C培养4d后， 将其单菌落接种到IOOmL黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养48h，然后按照1 %的种子液接种到IOOmL的黄豆粉培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养120h，所得 菌液经5000rpm离心20min，所得上清液进行浓缩后的物质即为粗提活性物。本发明的Hhs. 015菌株的抗菌活性物质成分经分析鉴定为抗生素类物质。本发明还有一个目的是提供Hhs. 015菌株在防治番茄叶霉病中的应用。本发明还有一个目的是提供Hhs. 015菌株的菌体在防治番茄叶霉病中的应用。本发明还有一个目的是提供Hhs. 015菌株的抗菌活性物质在防治番茄叶霉病中 的应用。本发明的Hhs. 015菌株有较强的抗番茄叶霉病菌活性，具备了拮抗菌作为生防因 子的双重特性，是一种很有开发潜力的生物农药，可用于番茄叶霉病的防治。本发明的Hhs. 015菌株具有稳定的天然原料来源，菌种来源于黄瓜根部，筛选方 法简单；糖丝菌菌体和抗菌活性物质制备简单，操作方便，产品质量稳定，低毒，对人畜无毒 害，对农作物无药害，绿色环保，防治番茄叶霉病病害效果显著。
图1是糖丝菌菌株Hhs. 015菌体及其抗菌活性物质对番茄叶霉的皿内抑制作用 图。图2是糖丝菌菌株Hhs. 015活性物质组成的薄层层析图。图3是糖丝菌菌株Hhs. 015田间防治作用的对照图。
具体实施例方式下面通过发明人给出的制备实施例和使用效果试验例来进一步详述本发明，但本 发明的内容并不局限于此。实施例1 :Hhs. 015菌株的分离、鉴定黄瓜根采自陕西杨凌高新技术示范区蔬菜大棚，用自来水冲洗后展开晾干，取植 株的根段样品各称取Ig进行表面消毒(99%乙醇中浸lmin，然后在3. 125%的NaOCl中浸 6min,再次放入99%乙醇中浸30sec，最后用无菌水冲洗5次)。将最后一次冲洗过的无菌 水取200 μ L涂在高氏一号平板上，用于检测表面消毒是否彻底。取消毒后的材料用无菌手 术刀切成0. 5X0. 5mm大小的薄片，将表面消毒后的黄瓜根组织块置于含有高氏一号平板 上，28士 1°C培养箱中培养21d后统计糖丝菌菌落数并进行纯化，可分离到Hhs. 015菌株，所 得菌株采用甘油法保藏于-80°C冰箱。将糖丝菌菌株划线接种于黄豆粉固体培养基上，28°C培养5d后用打孔器打取直 径6mm的菌块接种到糖丝菌发酵培养液中，28°C，150r/min摇床培养2d后，以10%的接种 量接入糖丝菌发酵培养液中进行二次发酵，28°C，150r/min摇床培养5d。发酵液在5000r/ min离心20min，取上清液备用。沉淀用与上清液等量的无菌水悬浮，即为菌体悬浮液，浓度 为 IO8 10ncfu/mLo从田间发病的番茄叶片上刷下番茄叶霉病菌孢子，配成浓度约为IX IO7 10X107cfu/mL的孢子悬浮液，喷雾接种番茄幼苗。自然风干后，分别喷施糖丝菌上清液和 菌体悬浮液，每处理1株番茄幼苗，重复3次，以清水为对照。置于温室保湿条件下培养48h， 15d后调查病叶数，计算病情指数和相对防效。调查和计算方法参照《农药田间药效试验准则》。番茄叶霉病的分级标准(以叶片为单位)采用目前国内统一的9级病情分级标 准。即0级无症状；1级接种叶出现褪绿至出现黄斑；3级接种叶病斑上产生薄的稀疏霉层；5级接种叶病斑上产生明显霉层；7级接种叶病斑上产生浓密霉层，上部叶片也受到侵染；9级除接种叶病斑上生有浓密的霉层外上部叶片的霉层也很明显。根据Hhs. 015菌株对番茄叶霉病的活体试验调查结果，筛选到一种高效防病的 活性菌株，经菌落和形态的显微观察、细胞化学组成分析、常规生理生化特性实验、16S rDNA序列分析以及与相似菌株杂交，该菌株鉴定为糖丝菌属一个新种类Saccharothrix yanglingensis Hhs.015o实施例2 =Hhs. 015菌株菌体的制备方法将-80°C保藏的杨凌糖丝菌Hhs. 015菌株接种在高氏一号培养基上，28°C培养4d 后，将其单菌落接种到IOOmL黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养48h，然 后按照的种子液接种到IOOmL的黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养 120h，发酵液经5000rpm离心20min后，所得沉淀物即为杨凌糖丝菌Hhs. 015菌株的菌体。所述的黄豆粉液体培养液由大豆粉20g (沸水煮30min，过滤保留滤液)，蔗糖10g， 可溶性淀粉 5g，蛋白胨 2g，酵母膏 2g，NaC12g, CaCO3Ig, MgSO4 · 7H200. 5g，KH2p040. 5g，琼脂 15g, H2O IOOOmL 组成，且 pH 值为 7. 2。实施例3 =Hhs. 015菌株的抗菌活性物质的制备方法将-80°C保藏的杨凌糖丝菌Hhs. 015菌株接种在高氏一号培养基上，28°C培养4d 后，将其单菌落接种到IOOmL黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养48h，然后 按照1 %的种子液接种到IOOmL的黄豆粉培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养120h，所 得菌液经5000rpm离心20min后所得上清液进行浓缩得到的物质。试验例1 :Hhs. 015菌株菌体和粗提抗菌活性物质离体抑菌活性实验取番茄叶霉病菌PDA斜面，用IOmL无菌水配成悬浮液，吸取100 μ L均勻涂布在含 有15mL PDA的培养皿上。实施例2中所述的Hhs. 015菌株菌体接种于高氏一号平板，生长 5天；打块；在距培养皿中均勻反贴3块直径6mm的糖丝菌菌块，25°C下培养。待靶标菌长 满培养皿时测量抑菌圈直径。将番茄叶霉病菌接种在PDA斜面上，25°C培养3d。用IOmL无菌水与斜面上的靶标 菌株混勻，配成菌体悬浮液，与50mL PDA培养基混勻后，每皿15mL平铺在直径9mm的培养 皿中。在培养皿中均勻放置3个灭菌的牛津杯，吸取200 μ L实施例3中所述的抗菌活性物 质液到牛津杯中。培养皿于25°C培养箱中培养3 5d后，测量抑菌圈直径。结果表明，Hhs. 015菌株菌体和抗菌活性物质对番茄叶霉病菌生长的抑制作用显 著(图1，左Hhs. 015菌株菌体对番茄叶霉病菌生长的抑制作用，右抗菌活性物质对番茄 叶霉病菌生长的抑制作用)。试验例2 活性物质的分析
实施例3中所述的抗菌活性物质进行薄层层析(图2)，对其中几条明显的条带回 收进行抑菌活性实验，结果表明多组分具有抑制番茄叶霉生长的活性。试验例3 =Hhs. 015菌株菌体和活性物质防治番茄叶霉病的盆栽实验将-80°C保藏的杨凌糖丝菌Hhs. 015菌株接种在高氏一号培养基上，28°C培养4d 后，将其单菌落接种到IOOmL黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养48h，然后 按照1 %的种子液接种到IOOmL的黄豆粉培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养120h，所 得菌液经5000rpm离心20min后所得上清液进行浓缩的物质。沉淀用无菌水制成孢子悬浮 液，浓度为IO8 109cfu/mLo从田间发病的番茄叶片上刷下番茄叶霉病菌孢子，配成浓度约为IX IO7 10X107cfu/mL的孢子悬浮液，喷雾接种番茄幼苗。自然风干后，分别喷施糖丝菌上清液和 菌体悬浮液，每处理1株番茄幼苗，重复3次，以清水为对照。置于温室保湿条件下培养48h， 15d后调查病叶数，计算病情指数和相对防效。调查和计算方法参照《农药田间药效试验准则》。番茄叶霉病的分级标准(以叶片为单位)采用目前国内统一的9级病情分级标 准。即0级无症状；1级接种叶出现褪绿至出现黄斑；3级接种叶病斑上产生薄的稀疏霉层；5级接种叶病斑上产生明显霉层；7级接种叶病斑上产生浓密霉层，上部叶片也受到侵染；9级除接种叶病斑上生有浓密的霉层外上部叶片的霉层也很明显。不同施药时间的防治结果测定按下面处理进行。提前施药取三叶一心期的番茄幼苗，喷施浓度IX IO7 10 X 107Cfu/mL的番茄叶 霉菌孢子悬浮液，保湿48h后，再喷施Hhs. 015菌株发酵液上清液。推后施药取三叶一心期的番茄幼苗，喷施菌株Hhs. 015发酵液上清液，保湿培养 48h后，喷施浓度IX IO7 10X 107Cfu/mL的番茄叶霉菌孢子悬浮液，保湿培养48h。同时接种先接种浓度IX IO7 IOX 107Cfu/mL的番茄叶霉菌孢子悬浮液，待番茄 叶片晾干后再喷施菌株Hhs. 015发酵液上清液。以上试验每处理1株番茄，5次重复。置于温室保湿条件下培养，15d后调查病叶 数，计算病情指数和相对防效。调查和计算方法参照文献进行。结果表明，盆栽试验中，糖丝菌株Hhs. 015上清液对番茄叶霉病的相对防效较高， 达到49. 7%，菌悬液防效达14. 8%。并且无论是提前施药还是推后施药，拮抗糖丝菌菌株 Hhs. 015对番茄叶霉病都有较好的防治效果，其相对防效分别达到62. 6%和50. 6%，而且 提前施药的防治效果明显高于退后施药的防治效果(表1)。表1糖丝菌菌株Hhs. 015对番茄叶霉病的防治作用
权利要求
杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015。
2.制备权利要求1所述的杨凌糖丝菌菌株的方法，其特征在于，具体包括以下步骤1)将待分离的黄瓜根用自来水冲洗后展开晾干，表面消毒后用无菌手术刀切成 0. 5X0. 5mm大小的薄片；2)将表面消毒后的黄瓜根组织块置于高氏一号平板上，28士1°C培养箱中培养21d后 统计放线菌菌落数并进行纯化，可分离到Hhs. 015菌株，于-80°C保藏。
3.根据权利要求2所述的制备杨凌糖丝菌Hhs.015菌株的方法，其特征在于，所述的 表面消毒的条件是剪取健康植物样品的根用清水洗净后，在99%乙醇中浸lmin，然后在 3. 125%的NaOCl中浸6min，再次放入99%乙醇中浸30sec，最后用无菌水冲洗5次。
4.权利要求1所述的杨凌糖丝菌Hhs.015，其特征在于，它是按照下列方法制备其菌体 的将_80°C保藏的杨凌糖丝菌Hhs. 015菌株接种在高氏一号培养基上，28°C培养4d后，将 其单菌落接种到100mL黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养48h，然后按照 1 %的种子液接种到100mL的黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养120h，发 酵液经5000rpm离心20min后，所得沉淀物即为杨凌糖丝菌Hhs. 015菌株的菌体；所述的黄豆粉液体培养液由大豆粉20g (沸水煮30min，过滤保留滤液)，蔗糖10g，可 溶性淀粉 5g，蛋白胨 2g，酵母膏 2g，NaCl 2g，CaC03lg, MgS04 7H200. 5g，KH2P040. 5g，琼脂 15g，H20 lOOOmL 组成，且 pH 值为 7. 2。
5.权利要求1所述的杨凌糖丝菌Hhs.015，其特征在于，它是按照下列方法制备其抗 菌活性物质的将-80°C保藏的杨凌糖丝菌Hhs. 015菌株接种在高氏一号培养基上，28°C 培养4d后，将其单菌落接种到100mL黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养 48h，然后按照1 %的种子液接种到100mL的黄豆粉培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养 120h，所得菌液经5000rpm离心20min后，所得上清液进行浓缩的物质即为抗菌活性物质。
6.权利要求1所述的杨凌糖丝菌Hhs.015在防治番茄叶霉病中的应用。
7.权利要求4所述的杨凌糖丝菌Hhs.015菌体在防治番茄叶霉病中的应用。
8.权利要求5所述的杨凌糖丝菌Hhs.015的抗菌活性物质在防治番茄叶霉中的应用。全文摘要
本发明公开了一株杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015，该菌株于2009年6月保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.4.5627；该菌株还于2009年10月保藏在韩国生物科学和生物技术研究所典型培养物保藏中心，编号为Saccharothrix yanglingensisHhs.015T/KCTC 19722T。本发明还公开了该菌株的分离与鉴定方法、菌体制备方法、抗菌活性粗提物质的制备方法；还公开了Hhs.015菌株及其菌体和抗菌活性物质在防治番茄叶霉病中的应用。本发明的Hhs.015菌株具有稳定的天然原料来源，筛选方法简单，操作方便，产品质量稳定，无毒副作用，绿色环保，而且对防治番茄叶霉病害效果显著，便于推广应用。
文档编号C12N1/20GK101955894SQ200910219509
公开日2011年1月26日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者姚敏, 康振生, 涂璇, 王心选, 颜霞, 高小宁, 黄丽丽 申请人:西北农林科技大学