专利名称：一种检测抗体亚型的方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种检测抗体亚型的方法。
(二)
背景技术：
1975年英国剑桥的科学家Kohler和Milstein通过杂交瘤技术建立了单克隆抗 体，其特点是理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和 质量控制，且来源相对容易。这些优点使它一问世就受到高度重视，可谓是免疫学乃至医学 史上的一个里程碑。经过不断的发展，单克隆抗体、多克隆抗体和基因工程抗体现已广泛应 用于生物学和医学研究领域。抗体的主要用途包括l.作为研究工作中的探针或亲合层析 的配体，用于生物学及医学的研究以及工业纯化；2.作为医学检验试剂或动植物病原、食 品菌原等检验试剂，用于实验室、临床诊断产品及影象诊断试剂的开发，并发展动物疫苗； 3.作为生物治疗的导向武器或免疫抑制剂，用于临床治疗。 然而，抗体的各种用途往往对其亚型等信息要求较高。目前抗体分型多采用基于 抗各亚型抗体制备的试剂盒或层析试纸条，由于针对各亚型单克隆抗体的抗体筛选十分不 易，因此分型所用试剂和耗材价格均非常昂贵。 作为组合化学技术发展的最新成果，核酸适体(即tamer)与靶分子高特异性、高 亲和力的结合已经得到确认。此外，从寡核苷酸文库中筛选出的核酸适体还具有许多优势 a.适体通过体外筛选制备，不依赖动物、细胞，筛选成本低；b.本身是寡核苷酸，分子量较 小可以化学合成，节约生产成本，且合成精确度高，重复性强，批间差异小；c.能区别靶标 间的微小差异；d.其与靶标间的亲和性和特异性高于抗原抗体；e.稳定性好，易于保存，对 高温和剧烈条件不敏感；f.适体的变性是可逆的，变性的适体可在数分钟内再生，因而可 反复使用；g.化学修饰及标记非常容易实现。因此，寡核苷酸适体在生物分子分离、分析方 面具有良好的应用前景。
(三)
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测抗体亚型的方法，该方法检测抗体亚型的成本 低、质量稳定、效率高，而且能检测任何来源的抗体。
本发明的技术方案一种检测抗体亚型的方法，其特征在于采用核酸适体即 即tamer作为亚型检测试剂进行抗体亚型检测，包括以下步骤
(1)抗体亚型检测用核酸适体的筛选；
(2)检测介质上核酸适体的包被；
(3)抗体亚型的检测分析。 上述所说的作为亚型检测试剂的核酸适体为针对抗体及抗体不同亚型的特异核 酸适体。 上述所说的核酸适体为通过体外筛选获得与抗体以及抗体不同亚型有特异结合 能力的核酸序列。
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上述所说的核酸适体为与抗体以及抗体不同亚型具有特异性结合能力的DNA序列或RNA序列。 上述所说的步骤(3)所说的抗体亚型的检测分析采用E1AA即enzymelinkedaptamer assay、层析试纸条艮卩lateral flow strip或液相芯片艮卩liquid chip的方f去。
上述所说的抗体包括人源、鼠源、兔源、羊源、猪源、鸡源抗体。 本发明的技术效果本发明所涉一种检测抗体亚型的方法，是以核酸适体为检测试剂的抗体亚型检测法，即采用针对各亚型单克隆抗体的核酸适体作为亚型检测试剂，利用EIAA(enzyme linked aptamer assay)或层析试纸条(lateral flow strip)或液相芯片(liquid chip)的方法检测抗体亚型，具有检测成本低、质量稳定、效率高的特点，而且能检测任何来源的抗体。
具体实施例方式实施例1 :一种检测抗体亚型的方法，即基于抗体亚型特异性核酸适体的小鼠源
抗体亚型检测方法 文库的合成及扩增 ssDNA文库通过化学合成法制备，其两端为固定序列，中间为35个碱基的随机序列5，CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3'，库容量1014以上；引物1 :5' CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3'，引物2 :5' ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3'。
用以上合成的ssDNA文库为模板，以引物1、引物2不对称扩增ssDNA文库，即采用不对称PCR，引物1/引物2浓度比100 : l，扩增条件为94t:预变性3min，然后94。C变性30s，65t:退火45s，循环35次，72t:延伸lmin，最后72。C延伸7min。将获得的产物主要为ssDNA，于95t:作用3min，于冰中2min，室温放置10min，即为ssDNA文库。
抗体亚型特异性核酸适体的筛选 以小鼠IgGl抗体亚型为筛选耙标，将小鼠IgGl抗体亚型包被于96孔板，以小鼠IgG2a、2b、3抗体亚型为反筛对象，将其与以上制备的初级ssDNA文库作用，吸取未结合部分再与小鼠IgGl抗体亚型孵育，洗去未与小鼠IgGl抗体亚型结合的部分，然后将已结合的ssDNA洗脱下来，作为次级ssDNA文库参与下轮筛选。重复筛选15轮。多克隆核酸适体经克隆测序及亲和力分析，得到可用于小鼠IgGl抗体亚型检测的核酸适体。同法还可分别筛选得到与小鼠IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM、K即pa等抗体亚型有特异性高亲和力的核酸适体。
抗体亚型检测 采用E1AA(enzyme linked即tamer assay)方法。合成上述用于小鼠IgGl等抗体亚型检测的核酸适体，并将3'端用氨基修饰；购买偶联有氨基的酶标板，通过PDITC溶液的介导，分别将针对不同小鼠抗体亚型的3' -NH2-ssDNA核酸适体固定于酶标板的不同孔，封闭过剩的活性位点；向固定有核酸适体的酶标板孔中加入待检鼠源单克隆杂交瘤细胞上清，孵育，再加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗，与底物TMB作用后测0D值。0D值高于0. 2的孔所对应的亚型即为待检小鼠源单克隆抗体亚型。 实施例2 :—种检测抗体亚型的方法，即基于抗体亚型特异性核酸适体的大鼠源抗体亚型检测方法采用组合化学法合成含30个随机序列的单链DNA文库5' -GTCACTGTCTTCATAGGTTG-N30-GAATCAGTGAGACATCCC 3'，经8 %变性聚丙烯酰胺胶纯化后，通过引物1 (5' -GTCACTGTCTTCATAGGTTG-3 ，)和引物2 (5' -TTCTAATACGACTCACTATAGGGATGTCTCACTGATTC-3')扩增；用T7体外转录试剂盒转录合成RNA， DNA模板用无RNA酶的DNA酶消化，酚_氯仿_异戊醇抽提，乙醇沉淀RNA，溶解后用8%变性聚丙烯酰胺胶纯化，即为初级RNA文库。 以大鼠IgM抗体亚型为筛选耙标，将大鼠IgM抗体亚型包被于96孔板，与以上制备的初级RNA文库作用，洗去未结合的部分，然后将已结合RNA洗脱下来，作为次级RNA文库参与下轮筛选。重复筛选15轮。多克隆核酸适体经克隆测序及亲和力分析，得到可用于大鼠IgM抗体亚型检测的核酸适体。同法还可分别筛选得到与大鼠IgG各亚型、K即pa轻链有特异性高亲和力的核酸适体。 抗体亚型检测采用层析试纸条(lateral flow strip)方法试纸条组装将筛选获得的k-IgM和k-IgG四种亚型(IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG2c)的特异核酸适体(即tamer—M、即tamer—gl、即tamer—g2a、即tamer—g2b、即tamer—g2c)分别固定在石宵酸纤维素膜相应位置的检测线上，用抗k轻链通用型核酸适体(即tamer-k)标记胶体金后包被在胶体金垫上，按样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫的顺序组装成层析试纸条。
检测细胞培养液中Ig类型和亚型将试纸条插入细胞培养上清中，样品通过样品垫与胶体金垫中胶体金标记的即tamer-k结合，随着液体流动，至硝酸纤维素膜上的即t咖er-M或即t咖er-gl或即t咖er-g2a或即t咖er-g2b或即t咖er-g2c结合，形成胶体金核酸适体_抗体_核酸适体复合物而沉淀显色，根据显色的位置判定其抗体相应类型和亚型。
实施例3 :—种检测抗体亚型的方法，即基于抗体亚型特异性核酸适体的人源抗
体亚型检测方法 文库的合成及扩增 ssDNA文库通过化学合成法制备，其两端为固定序列，中间为35个碱基的随机序列5，CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3'，库容量1014以上；引物1 :5' CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3'，引物2 :5' ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3'。
用以上合成的ssDNA文库为模板，以引物1、引物2不对称扩增ssDNA文库，即采用不对称PCR，引物1/引物2浓度比100 : l，扩增条件为94t:预变性3min，然后94。C变性30s，65t:退火45s，循环35次，72t:延伸lmin，最后72。C延伸7min。将获得的产物主要为ssDNA，于95t:作用3min，于冰中2min，室温放置10min，即为ssDNA文库。
抗体亚型特异性核酸适体的筛选 以人IgGl抗体亚型为筛选耙标，将人IgGl抗体亚型包被于96孔板，与以上制备的初级ssDNA文库作用，洗去未结合的部分，然后将已结合的ssDNA洗脱下来，作为次级ssDNA文库参与下轮筛选。重复筛选15轮。多克隆核酸适体经克隆测序及亲和力分析，得到可用于人IgGl抗体亚型检测的核酸适体。同法还可分别筛选得到与人IgG2、IgG3、IgG4、IgM、 K即pa等抗体亚型有特异性高亲和力的核酸适体。
抗体亚型检测 采用液相芯片(liquid chip)的方法。取带有多种独特荧光光谱的氨基荧光微球2. 5X 106个，用双功能试剂戊二醛修饰活化；漂洗后的活化微球在偶联缓冲液(0. 05mol/LPBS，pH7. 5)中与合成并经氨基修饰的上述核酸适体(3'端修饰)振荡孵育2h ;封闭微球表面的未结合位点；加入待测的人源抗体，与FITC标记的抗人二抗室温孵育30min，清洗后用流式细胞仪分析待测抗体亚型。
权利要求
一种检测抗体亚型的方法，其特征在于采用核酸适体即aptamer作为亚型检测试剂进行抗体亚型检测，包括以下步骤(1)抗体亚型检测用核酸适体的筛选；(2)检测介质上核酸适体的包被；(3)抗体亚型的检测分析。
2. 根据权利要求1所说的一种检测抗体亚型的方法，其特征在于所说的作为亚型检测 试剂的核酸适体为针对抗体及抗体不同亚型的特异核酸适体。
3. 根据权利要求1或2所说的一种检测抗体亚型的方法，其特征在于所说的核酸适体 为通过体外筛选获得与抗体以及抗体不同亚型有特异结合能力的核酸序列。
4. 根据权利要求3所说的一种检测抗体亚型的方法，其特征在于所说的核酸适体为与 抗体及抗体不同亚型具有特异性结合能力的DNA序列或RNA序列。
5. 根据权利要求l所说的一种检测抗体亚型的方法，其特征在于所说的步骤(3)所说 的抗体亚型的检测分析采用EIAA即enzymelinked aptamer assay、层析试纸条即lateral flow strip或液相芯片即liquid chip的方法。
6. 根据权利要求1所说的一种检测抗体亚型的方法，其特征在于所说的抗体包括人 源、鼠源、兔源、羊源、猪源、鸡源抗体。
全文摘要
一种检测抗体亚型的方法，其特征在于采用核酸适体即aptamer作为亚型检测试剂进行抗体亚型检测，包括以下步骤(1)抗体亚型检测用核酸适体的筛选；(2)检测介质上核酸适体的包被；(3)抗体亚型的检测分析。该方法检测抗体亚型的成本低、质量稳定、效率高，而且能检测任何来源的抗体。
文档编号C12Q1/68GK101782571SQ20091022415
公开日2010年7月21日 申请日期2009年11月26日 优先权日2009年11月26日
发明者吴淑庆, 弓景波, 张良, 杨在明 申请人:国家纳米技术与工程研究院