专利名称：一种基因重组解淀粉芽胞杆菌及菌剂制备方法
技术领域：
本发明涉及一种植物抗病促生工程菌及菌剂制备方法，尤其是涉及一种含有透明
颤菌血红蛋白基因的基因重组解淀粉芽胞杆菌及菌剂制备方法。
背景技术：
农业生产中，化学农药和化学肥料的使用量逐年增加，引起环境污染、生态恶化、土壤板结和土壤退化等问题，对食品安全、人类健康和农业可持续发展构成了巨大的威胁和挑战。因此，发展可持续性农业，就要减少化学农药和化学肥料的使用量，寻找有效的替代品。 微生物农药和微生物肥料，具有持效期长、不污染环境、成本低等特点，是化学农药和化学肥料的最有效替代品。合理开发和利用微生物农药和微生物肥料，是我国农业持续发展的重要途径。 植物根围促生细菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，简称PGPR)是一种生存在植物根圈范围中，对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌的统称。PGPR在植物根围的聚集，可以加强土壤中有机物质的分解，促进植物营养元素的矿化，增强对作物营养的供应。某些PGPR菌株产生的植物激素可促进植物根系生长，增强根系吸收矿物营养和水分的能力，从而达到调控作物生长、增强抗逆性，达到提高产量、改善品质、减少化肥使用、提高土壤肥力的目的。同时，PGPR在根围的定殖能在一定程度上抑制作物病原菌的发生和传播。 解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，是一种研究比较多的植物根际促生防病细菌。它能促进植物根部的生长，增强作物对非生物因素(例如高盐分和缺水等)和生物因素(生物病原体)的耐受力，提高作物的产量。其运行机理是，基于通过释放生长素和其它植物激素，如喷哚-3-乙酸(IAA)，剌激和推动作物生长；同时能产生胞外植酸酶分解土壤中的植酸为植物提供生长必需的磷，还能产生嗜铁素(Siderophore)向植物提供铁_嗜铁素复合体，从而增加植物对铁营养的吸收，还能产生固氮酶，可将根围的氮素供给作物；此外，还能对作物产生诱导系统抗性(Induced systemic resistance, ISR)，提高对植物病虫害的抗性，同时还能分泌几丁质酶、葡聚糖酶以及次生代谢产物表面活性素(surfcatin)、伊枯草菌素(iturin)、芬荠素(fengycin)和杆菌抗霉素Bacillomycin D等脂肽类抗生素，起到预防植物病害和抑制植物病原菌作用。 解淀粉芽胞杆菌是一种高好氧细菌，在其工业发酵中后期，由于菌体密度过大造
成供氧不足，影响菌体的生长以及次生脂肽类抗生素的合成。此外，在施入土壤后，如果土
壤中氧气含量低，会影响该菌体的生长和定殖能力，进而影响其防病促生效果。透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)是由透明颤菌属
(Vitreoscilla sp.)产生的一种可溶性血红蛋白，这种血红蛋白能在贫氧条件下被大量诱
导合成，使透明颤菌在微氧条件下能够很好地生存。透明颤菌血红蛋白已经被成功克隆到
多种细菌中，VHb的表达提高了宿主的耐低氧能力，提高了菌体的密度和代谢产物的产量。2008年华中农农业大学的冯亮等将vgb基因转入苏云金芽胞杆菌后，低氧发酵条件下其菌体数量和杀虫晶体蛋白产量分别提高了 1. 59倍和3. 13倍，1996年，Pay li等将vgb基因转入产淀粉酶枯草芽胞杆菌1012M15后，其发酵后菌体数量和淀粉酶活力分别提高了 30%和17%。 2000年，中国农业大学的文莹等将vgb基因转入阿维链霉菌(S. avermiti lis)和肉桂地链霉菌(S. cinnamonensis)中，提高了抗生素的产量。2003年，Bhave等证实了 VHb在酵母菌(Y. lipolytics)中的表达使细胞具有更高的生长率，加强了氧呼吸效率，并提高了呼吸效能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对氧的利用率高，发酵产孢数和抗菌脂肽产量高的基
因重组解淀粉芽胞杆菌及菌剂制备方法。 本发明的目的是通过以下技术方案实现的 本发明之基因重组解淀粉芽胞杆菌通过以下方法得到将透明颤菌血红蛋白基因vgb，通过重叠延伸PCR技术置于强启动子P43的调控下，构建到基因重组整合载体pDGP43-vgb中，通过基因重组整合载体pDGP43-vgb中含有的解淀粉芽胞杆菌a _淀粉酶基因amyE的上下游两端同源臂，将-P43-vgb-片段整合到野生型植物促生防病细菌解淀粉芽胞杆菌FZB42的染色体上，得到基因重组解淀粉芽胞杆菌XLV09-1 (Bacillusamyloliquefaciens XLV09-1);所述基因重组解淀粉芽胞杆菌XLV09-1保藏日期2009年12月10日，保藏单位中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC);保藏单位地址武汉，珞珈山，武汉大学内；保藏编号CCTCC M209299。 本发明之菌剂制备方法是利用基因重组解淀粉芽胞杆菌XLV09-1在生产和应用过程中，表达有活性的VHb蛋白，主要工艺流程包括菌种活化、一级种子罐发酵培养、二级
种子罐发酵培养和生产用发酵罐培养，具体包括以下步骤
(1)菌种活化 将保藏的解淀粉芽胞杆菌XLV09-1划线接种于固体种子培养基斜面上，接种前将装有培养基的扁瓶在12rC条件下灭菌30分钟，接种后在28 35t:条件下培养30 48h，配成孢子液，以5%的接种量用于种子罐接种；
(2)种子罐发酵 先将一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，冷却至3(TC，将孢子液接入培养液中，通入无菌空气培养，可得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在12rC下灭菌30min，装入培养基后再灭菌，冷却至3(TC，将一级种子罐发酵液按5% 8%接种量接入二级种子罐，通入无菌空气和搅拌进行培养，可得二级种子罐发酵菌液；
(3)生产发酵罐培养 先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25°C 3(TC，按5% 8%的
接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通过无菌空气；
(4)浓縮 发酵罐中发酵结束后，将菌液通过超滤进行浓縮、补加增效添加剂、随后装瓶；
灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在12rC，压力0. 3 0. 5kg/cm2条件下灭菌30min，发酵罐接种后，在28 35t:条件下培养36 48小时，通气量1 2Vols/vol/min，氧气含量
种子罐培养液配方牛肉膏O. 3 0.8%，蛋白胨0. 7 1.2%，葡萄糖0. 1 0. 6%， NaCl 0. 1 0. 6%， MgS04 7H20 0. 01 0. 06%， K2HP04 0 . 01% 0. 06%， MnS040. 02% 0. 08%，余为水，pH值消毒前7. 0 7. 8，消毒后pH6. 8 7. 5 ;
发酵罐培养基配方葡萄糖2 8%， L-谷氨酸钠0. 3 1. 5%， KH2P04 0 . 08 0. 22%， K2HP04 0. 10 2. 2%， CaC03 0. 1 2. 20%， FeS04 7H20 0. 001 0. 005%，余为水，pH值消毒前8. 5 11. 0，消毒后6. 5 9. 5 ; 发酵液要求发酵液含活芽胞数每毫升达80亿以上，菌体量不足5X时放罐，pH值
7. 0-8.0，无杂菌污染； 所述百分比为重量百分比。 透明颤菌血红蛋白功能验证 1. Western-Blot检测透明颤菌血红蛋白基因的表达 将已纯化的目标透明颤菌血红蛋白免疫兔子，获得抗体后与辣根过氧化物酶连
接，形成酶联抗体；将培养的细菌用超声波处理后，将总蛋白电泳后转膜、用抗体杂交，洗
脱、显色，确定是否有VHb表达。 2.透明颤菌血红蛋白的生物活性 通过一氧化碳差光谱法检测表达的VHb是否具有生物活性。
3.工程菌生长情况的检测 通过血球计数板和稀释涂平板法来测定发酵后的产孢数。
4、抗菌脂肽产量及其抗真菌活性的测定 采用HPLC来测定抗菌脂肽的产量，同时采用平板抑菌试验来测定抗菌脂肽的抗真菌活性。 本发明利用透明颤菌血红蛋白基因在解淀粉芽胞杆菌中的表达，提高了解淀粉芽胞杆菌对氧气的利用率。 本发明之植物促生防病工程菌基因重组解淀粉芽胞杆菌菌剂，是一种产生透明颤菌血红蛋白的解淀粉芽胞杆菌制剂，为绿色农药，无残毒，对人、畜安全，有利保护生态环境。 本发明与现有的促生防病菌菌剂相比具有以下优点 (1)、产孢数量高该制剂的基因重组解淀粉芽胞杆菌的芽胞含量比原始菌株提高了 14. 49%，达到100亿/ml以上； (2)、抗菌脂肽产量高工程菌抗菌总脂肽产量达到lg/L以上，抗菌效果好，比常规生防菌株提高30% 60% ; (3)、遗传稳定性更高由于外源基因是直接整合到宿主菌的染色体上，所以在生产和使用过程中，外源基因能稳定的遗传和表达。工程菌所携带的血红蛋白基因对人、畜均无害。 解淀粉芽胞杆菌XLV09-1保藏日期、保藏单位全称及简称、保藏编号 保藏日期2009年12月10日； 保藏单位中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC ; 保藏编号CCTCC M209299。
图1为P43启动子和vgb的重叠延伸拼接及中间载体pMD-P43vgb和重组整合载体 pDGP43-vgb的构建流程图； 图2为P43启动子和vgb的PCR扩增及重叠延伸PCR图谱；
图3为中间载体pMD-P43vgb的酶切鉴定图谱；
图4为重组整合载体pDGP43-vgb的酶切鉴定图谱；
图5为重组整合载体pDGP43-vgb的部分测序图谱； 图6为P43启动子和vgb融合片段整合到解淀粉芽胞杆菌染色体上稳定遗传的示 意图； 图7为本发明基因重组解淀粉芽胞杆菌的PCR鉴定图谱； 图8为本发明基因重组解淀粉芽胞杆菌和出发菌株的淀粉酶活力测定图； 图9为本发明基因重组解淀粉芽胞杆菌发酵生产工艺流程图； 图10为本发明基因重组解淀粉芽胞杆菌表达VHb的SDS-PAGE和Western-Blot
图谱； 图11为本发明基因重组解淀粉芽胞杆菌的一氧化碳差光谱图； 图12为本发明基因重组解淀粉芽胞杆菌和出发菌株产生抗菌脂肽的HPLC检测图。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细说明。 本发明实施例利用植物根围促生防病菌_解淀粉芽胞杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)FZB42作为受体菌，将透明颤菌血红蛋白基因vgb，通过构 建基因重组整合载体pDGP43-vgb，将vgb整合到解淀粉芽胞杆菌中实现高表达，构建出产 孢数和抗菌脂肽产量更高的植物促生防病工程菌解淀粉芽胞杆菌工程菌菌株XLV09-1，并 制备解淀粉芽胞杆菌工程菌菌剂。 —、基因重组解淀粉芽胞杆菌工程菌的构建方法实施例
(1)PCR扩增P43启动子 提取枯草芽胞杆菌B. subtilis 168菌株的总DNA，方法参考文献 [Isolation ofBacillus subtilis chromosomal DNA. Recombinant DNA Techniques. Addison-WesleyPublishing Co. ， Inc. ， Reading,Mass, 1983，pp. 162-163]，根据GenBank中 登录的B. subtilis P43 fragment (ACCESSION No. K02174. 1)序歹lj，设计引物，P _F :CCCAAGC HGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTG，下划线为Hind III酶切位点；P43_R :GGTTTGCTGGTCTAACATG TGTACATTCCTCTCTT。以B. subtilis菌株总DNA为模板，P43_F/P43-R为引物，扩增长为0. 37kb 的P43启动子。反应条件为94。C预变性4min ;94。C变性45sec，58。C退火30sec，72。C延伸 30sec ;30个循环；72。C延伸10min ;
(2)PCR扩增透明颤菌血红蛋白基因vgb 根据GenBank中登录的透明颤菌血红蛋白基因(ACCESSION No.M27061)序列， 以质粒pRK404-VHb为模板用vgb-F :AAGAGAGGAATGTACACATGTTAGACCAGCAAACC和vgb-R :CCCGAATTCTTATTCAACCGCTTGAGCG,下划线为EcoRI酶切位点，以质粒pRK404_VHb为模板， Vgb-F/Vgb-R为引物，扩增0. 44kp的透明颤菌血红蛋白基因vgb ;反应条件为94t:预变性 4min ;94。C变性45sec， 58。C退火30sec，72。C延伸30sec，30个循环；72。C延伸10min ;
(3)重叠延伸拼接P43启动子和vgb 用PCR回收试剂盒回收所述两次PCR的产物，并以两种回收产物为模板，以P43_F/ Vgb-R为引物，采用重叠延伸拼接的方法扩增0. 81kb的融合基因，反应条件为94t:预变性 4min ;94。C变性45sec， 58。C退火lmin，72。C延伸lmin，30个循环；72。C延伸10min ;具体流 程参照图1， PCR详细结果见图2。
(4)中间载体pMD-P43vgb的构建 用PCR回收试剂盒回收重叠PCR产物，将回收产物连接pMD18-T载体，连接体系为 2 iil PCR产物，2. 5iU Solution I，O. 5iU pMD18-T载体，16。C连接过夜，连接产物全部用 来转化Ecoli ToplO感受态细胞，次日挑选抗性斑划线，用菌落PCR初步筛选阳性转化子； 然后将阳性转化子转接小摇瓶，37t:摇床培养过夜，提取质粒，提取质粒进行用Hind III/ EcoRI双酶切鉴定转化子质粒，，进一步确定转化子，酶切鉴定结果见图3 ;将酶切鉴定正确 的质粒pMD-P43vgb测序； (5)基因重组整合载体pDGP43-vgb的构建 提取基因重组质粒pMD-P43vgb和整合载体pDG1730，将质粒pMD-P43vgb和整 合载体pDG1730同时用Hind III/EcoR I双酶切，回收其目的片段，将两者连接形成质粒 pDGP43-vgb，转化E. coli ToplO感受态细胞，Amp抗性筛选阳性转化子。转化子经快速裂 解、菌落PCR和酶切鉴定，筛选正确的阳性转化子pDGP43-vgb。其具体流程参照图l，酶切 鉴定结果见图4 ;将酶切鉴定的质粒pDGP43-vgb送测序鉴定，部分测序图见图5 ;
(6)基因重组解淀粉芽胞杆菌XLV09-1的构建 解淀粉芽胞杆菌感受态细胞的制备参照文献[Extracell y lar phytase activity ofBacillus amy 1o1iquefaciens FZB45 contributes to its plant-growth-promoting effect. J. Microbiology, 2002， 148 :2097-2109]进行；具体整 合流程参照图6进行，用Xho I将基因重组整合载体pDGP43-vgb线性化，切胶回收，随后 100ng DNA加入200 y 1感受态中，孵育20min ;加入LB和抗生素，培养90min，然后涂布壮 观霉素抗性平板。37t:倒置培养12-16h ;挑选抗性菌落，划线到另一个平板；从壮观霉素平 板上挑取转化子，然后在另一平板上划线培养，同时挑取一部分菌株做模板进行菌落PCR， 以确定vgb表达框是否真正整合到解淀粉芽胞杆菌FZB42的染色体上，PCR检测结果见图 7 ;然后，使用淀粉酶水解圈试验来验证目的基因是否正确整合到解淀粉芽胞杆菌的amyE 基因位点将amyE基因阻断，具体操作如下将PCR筛选出的阳性菌落点种到含2 %淀粉的 LB平板上，用原始菌株作为对照，倒置培养三天，然后在平板中加入碘液进行染色，看菌落 周围是否出现了水解圈，具体检测结果见图8 ;筛选出没有水解圈的菌落，得到正确的基因 重组解淀粉芽胞杆菌菌株XLV09-1。 二、解淀粉芽胞杆菌XLV09-1菌剂的生产发酵工艺实施例 本发明解淀粉芽胞杆菌XLV09-1菌剂发酵工艺(参照图9)，主要包括菌种活化、一
级种子罐发酵培养、二级种子罐发酵培养和生产用发酵罐培养。
1.菌种活化
将保藏的解淀粉芽胞杆菌XLV09-1划线接种于固体种子培养基斜面上，接种前将 装有培养基的扁瓶在12rC条件下灭菌30分钟，接种后在3(TC条件下培养48h，配成孢子 液，以5%的接种量用于种子罐接种；
2.种子罐发酵 先将一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，冷却至3(TC，将孢子液接入培养液 中，通入无菌空气培养，可得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在12rC下灭菌30min，装 入培养基后再灭菌，冷却至3(TC，将一级种子罐发酵液按5%接种量接入二级种子罐，通入 无菌空气和搅拌进行培养，可得二级种子罐发酵菌液；
3.生产发酵罐培养 先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25°C 3(TC，按5%的接种量
将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通过无菌空气；
4.浓縮 发酵罐中发酵结束后，将菌液通过超滤进行浓縮、补加增效添加剂、随后装瓶；
灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在12rC，压力0. 5kg/cm2条件下灭菌30min，发酵罐接 种后，在3(TC条件下培养48小时，通气量2Vols/vol/min，氧气含量40% 。
种子罐培养液配方牛肉膏0.8%，蛋白胨1.2%，葡萄糖0.6%， NaCl 0.6%， MgS04 7H20 0. 06%，K2HP04 0 . 06%，MnS04 0 . 02 % ，余为水，pH值消毒前7. 5，消毒后pH
7. 2 ; 发酵罐培养液配方葡萄糖2%丄-谷氨酸钠0. 5%，KH2P04 0 . 08%，K2HP040. 10%，
CaC03 0. 1 % ， FeS04 7H20 0. 001 % ，余为水，pH值消毒前7. 5，消毒后pH 7.2。 发酵液要求发酵液含活芽胞数每毫升达100亿以上，菌体量不足5%时放罐，pH
值6.8，无杂菌污染。 透明颤菌血红蛋白功能验证 1. Western-Blot检测透明颤菌血红蛋白基因的表达 将已纯化的目标透明颤菌血红蛋白免疫兔子，获得抗体后与辣根过氧化物酶连 接，形成酶联抗体；将培养的细菌用超声波处理后，将总蛋白电泳后转膜、用抗体杂交，洗 脱、显色，确定该制剂表达了 VHb蛋白(图10)。
2.透明颤菌血红蛋白的生物活性 通过一氧化碳差光谱法检测表达的VHb是否具有生物活性(图11)，该制剂的一氧 化碳光谱中存在特异的419nm的吸收峰，而原始菌制剂的一氧化碳光谱中没有该吸收峰， 证明该制剂表达的VHb蛋白具有血红蛋白生活活性。
3.工程菌生长情况的检测 通过血球计数板和稀释涂平板法来测定发酵后的产孢数，该制剂基因重组解淀粉 芽胞杆菌的芽胞含量比原始菌株提高了 14.49%，达到103亿/ml ;。
4、抗菌脂肽产量及其抗真菌活性的测定 采用HPLC来测定抗菌脂肽的产量(图12)，本实施例菌剂中抗菌脂肽fengycin的 含量比原始菌株菌剂提高了 1. 74倍，达到769. 8mg/L， surfactin的含量提高了 3. 14倍， 达到197. 8mg/L ;同时采用抑菌试验来测定抗菌脂肽的抗真菌活性，该制剂抗菌脂肽粗溶 液对立枯丝核菌Rhizitoconia solani有很好的抑制效果，比原始菌抗菌脂肽粗溶液提高
10了 61. 54%，对辣椒白绢病Sclerotiumrolfsi的抑制效果提高了 36. 4%，对烟草赤星病菌 Alternaria alternata的抑制效果提高了 38. 9% 。
权利要求
一种基因重组解淀粉芽胞杆菌，其特征在于，该基因重组解淀粉芽胞杆菌染色体上整合有透明颤菌血红蛋白基因vgb，其分类命名为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)XLV09-1，保藏编号CCTCC M209299。
2. 根据权利要求1所述的基因重组解淀粉芽胞杆菌，其特征是，构建所用的整合表达 载体为pDGP43-vgb，采用P43启动子。
3. —种权利要求1所述基因重组解淀粉芽胞杆菌的构建方法，其特征在于，将透明颤 菌血红蛋白基因vgb，通过重叠延伸PCR技术置于强启动子P^的调控下，构建到基因重组 整合载体pDGP43-vgb中，通过基因重组整合载体pDGP43-vgb中含有的解淀粉芽胞杆菌 a _淀粉酶基因amyE的上下游两端同源臂，将_P43-vgb-片段整合到野生型植物促生防病 细菌解淀粉芽胞杆菌FZB42的染色体上，即得到基因重组解淀粉芽胞杆菌XLV09-1。
4. 根据权利要求3所述的基因重组解淀粉芽胞杆菌的构建方法，其特征在于，包括以 下具体步骤(1) PCR扩增^启动子提取枯草芽胞杆菌B. subtilis 168菌株的总DNA，根据GenBank中登录的登记号为 No. K02174. 1的B. subtilis P43 fragment序列，设计引物P43_F :CCCAAGCTTGATAGGTGGTATG TTTTCGCTTG，下划线为Hind III酶切位点；P43_R :GGTTTGCTGGTCTAACATGTGTACATTCCTCTCT T，以B. subtilis菌株总DNA为模板，P^F/^-R为引物，扩增长为0. 37kb的P43启动子，反 应条件为94。C预变性4min ;94。C变性45sec， 58。C退火30sec， 72。C延伸30sec ;30个循环； 72。C延伸10min ;(2) PCR扩增透明颤菌血红蛋白基因vgb根据GenBank中登录的登记号为No. M27061的透明颤菌血红蛋白基因序列，以质 粒pRK404-VHb为模板，用vgb-F :AAGAGAGGAATGTACACATGTTAGACCAGCAAACC禾P vgb-R : CCCGAATTCTTATTCAACCGCTTGAGCG，下划线为EcoRI酶切位点，以质粒pRK404-VHb为模板， Vgb-F/Vgb-R为引物，扩增0. 44kp的透明颤菌血红蛋白基因vgb ;反应条件为94t:预变性 4min ;94。C变性45sec， 58。C退火30sec，72。C延伸30sec，30个循环；72。C延伸10min ;(3) 重叠延伸拼接P43启动子和vgb用PCR回收试剂盒回收两次PCR的产物，并两种回收产物为模板，以P43_F/Vgb-R为引 物，采用重叠延伸拼接的方法扩增O. 81kb的融合基因，反应条件为94t:预变性4min ;94°C 变性45sec，58。C退火lmin，72。C延伸lmin，30个循环；72。C延伸10min ;(4) 中间载体pMD-P43vgb的构建用PCR回收试剂盒回收重叠PCR产物，将回收产物连接pMD18-T载体，连接体系为2 y 1 PCR产物，2. 5iU Solution I，O. 5iU pMD18-T载体，16。C连接过夜，连接产物全部用来转 化E.coli ToplO感受态细胞，次日挑选抗性斑划线，用菌落PCR初步筛选阳性转化子；然后 将阳性转化子转接小摇瓶，37t:摇床培养过夜，提取质粒，提取质粒进行用Hind III/EcoRI 双酶切鉴定转化子质粒，，进一步确定转化子，将酶切鉴定正确的质粒pMD-P43vgb测序；(5) 基因重组整合载体pDGP43-vgb的构建提取基因重组质粒pMD-P43vgb和整合载体pDG1730，将质粒pMD-P43vgb和整合 载体pDG1730同时用Hind III/EcoR I双酶切，回收其目的片段，将两者连接形成质 粒pDGP43-vgb，转化E. coli ToplO感受态细胞，Amp抗性筛选阳性转化子；转化子经快速裂解、菌落PCR和酶切鉴定，筛选正确的阳性转化子pDGP43-vgb ;将酶切鉴定的质粒 pDGP43-vgb送测序鉴定；(6)基因基因重组解淀粉芽胞杆菌工程菌XLV09-1的构建制备解淀粉芽胞杆菌感受态细胞；用Xho I将基因重组整合载体pDGP43-vgb线性 化，切胶回收，随后lOOng DNA加入200 y 1感受态中，孵育20min ;加入LB和抗生素，培养 90min，然后涂布壮观霉素抗性平板，37t:倒置培养12_16h ;挑选抗性菌落，划线到另一个 平板；从壮观霉素平板上挑取转化子，然后在另一平板上划线培养，同时挑取一部分菌株做 模板进行菌落PCR，以确定vgb表达框是否真正整合到解淀粉芽胞杆菌FZB42的染色体上， PCR的三对引物分别为P43_F/P43-R、 Vgb-F/Vgb-R和P43-F/Vgb-R ;然后，使用淀粉酶水解圈 试验来验证目的基因是否正确整合到解淀粉芽胞杆菌的amyE基因位点将amyE基因阻断， 具体操作如下将PCR筛选出的阳性菌落点种到含2X淀粉的LB平板上，用原始菌株作为 对照，倒置培养三天，然后在平板中加入碘液进行染色，看菌落周围是否出现了水解圈；筛 选出没有水解圈的菌落，即为基因重组解淀粉芽胞杆菌XLV09-1。
5. —种基因重组解淀粉芽胞杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1) 、菌种活化将保藏的基因重组解淀粉芽胞杆菌XLV09-1划线接种于固体种子培养基斜面上，接种 前将装有培养基的扁瓶在12rC条件下灭菌30分钟，接种后在28 35t:条件下培养30 48h，配成孢子液，以5%的接种量用于种子罐接种；(2) 、种子罐发酵先将一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，冷却至30°C ，将孢子液接入培养液中，通 入无菌空气培养，可得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在12rC下灭菌30min，装入培 养基后再灭菌，冷却至3(TC，将一级种子罐发酵液按5% 8%接种量接二级种子罐，通入 无菌空气和搅拌进行培养，可得二级种子罐发酵菌液；(3) 、生产发酵罐培养先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温至25°C 3(TC，按5% 8%的接种 量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通过无菌空气；(4) 、浓縮发酵罐中发酵结束后，将菌液通过超滤进行浓縮，补加增效添加剂，随后装瓶； 所述灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在12rC，压力0. 3-0. 5kg/cm2条件下灭菌30min，发酵罐接种后，在28 35t:条件下培养36 48小时，通气量1 2Vols/vol/min，氧气含量30 40% ;种子罐培养液配方牛肉膏O. 3 0. 8%，蛋白胨0. 7 1.2%，葡萄糖0. 1 0. 6%， NaCl 0. 1 0. 6%，MgS04 *7H20 0. 01 0. 06%，K2HP04 0 . 01% 0. 06%，MnS04 0 . 02% 0. 08%，余为水，pH值消毒前7. 0 7. 8，消毒后pH6. 8 7. 5 ;发酵罐培养基配方为葡萄糖2 8%， L-谷氨酸钠O. 3 1.5%， KH2P040 . 08 0. 22%， K2HP04 0. 10 2. 2%， CaC03 0. 1 2. 20%， FeS04 7H20 0. 001 0. 005%，余为 水，pH值消毒前8. 5 11. 0，消毒后6. 5 9. 5 ;发酵液要求发酵液含活芽胞数每毫升达80亿以上，菌体量不足5 %时放罐，pH值 7. 0-8.0，无杂菌污染；。
全文摘要
一种基因重组解淀粉芽胞杆菌及菌剂制备方法。本发明以解淀粉芽胞杆菌FZB42菌株为宿主菌，经过构建基因重组整合载体，构建带有P43强启动子调控下的透明颤菌血红蛋白基因重组解淀粉芽胞杆菌XLV09-1。用该解淀粉芽胞杆菌菌珠发酵生产制备的菌剂的产孢数达到100亿/ml以上，总抗菌脂肽产量达到1g/L以上，对多种植物真菌病害的防治效果提高了30％以上。所述菌剂为绿色微生态制剂，无残毒，对人、畜安全，有利保护生态环境。
文档编号C12P21/02GK101717744SQ20091022719
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者丁学知, 余子全, 刘清术, 夏立秋, 孙运军, 胡胜标 申请人:湖南师范大学