专利名称：一株有机磷农药降解菌及其菌剂的生产方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及
的芽孢杆菌，及其菌剂的生产方法。
株分离自油菜叶际的能高效降解有机磷类农药
背景技术：
有机磷农药以其品种多、药效高、防治范围广谱等特点，至今仍是农药中用量最多 的类别，在农业生产中起到了举足轻重的作用，我国有机磷农药的生产和使用量占农药总 生产和使用量的一半以上。但是，有机磷农药具有较强的毒性，长期、大量使用后，其在农作 物上的残留会引起食品安全问题，也影响了我国农产品出口，而且散落的农药也会使水和 土壤受到污染。 利用微生物降解有机磷农药残留的生物修复方法具有低成本、无毒、无二次污染 等优点，是最具应用前景的削减农药污染的方法之一。有机磷农药降解微生物筛选常用的 方法是从长期遭受农药污染的土壤或水体中采集样品，经富集培养、平板划线等操作，分离 得到单菌落，然后经驯化培养，或紫外化学诱变等方法获取高效降解菌株，或通过细胞工 程、基因工程等技术手段构建工程菌株。例如中国发明专利(申请号200610090054.7) 公开了一株降解有机磷农药的施氏假单胞菌，是从农药厂排污口土壤样品中分离的；中国 发明专利(申请号200410081019. X)公开了一株降解有机磷农药的苍白杆菌，是从长期农 药污染的土壤中分离获得。 植物的叶际是指植物的地上部分，包括叶、茎、花、果等的表面或内部的小环境。在
植物的叶际范围内生活着多种微生物，主要有细菌、真菌、放线菌等，这些在叶际生存的微
生物称为叶际微生物。对于叶际微生物而言，植物叶际环境相当恶劣，在强烈的日照下，其
表面干燥，温度可以达到5(TC，紫外线强烈，而夜晚温度又骤降，还有刮风、下雨等天气变化
等。对于分离自土壤、污泥等来源的农药降解微生物，不一定能适应植物叶际的恶劣环境，
其降解效率往往会受到显著影响。而从植物的叶际分离的农药降解微生物能够在叶际长期
生存，比较适应多变的叶际环境，更适合原位降解作物表面的农药残留。 本专利是从油菜叶际分离出的一株高效降解有机磷农药的芽孢杆菌，能够在植物
叶际环境下保持良好的降解性能。目前尚未发现从油菜叶际分离出降解有机磷农药的芽孢
杆菌及其菌剂生产方法的文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株分离自油菜叶际的能够高效降解有机磷农药的芽孢杆 菌，并提供该菌剂的生产方法。 本发明所提供的降解有机磷农药的菌株是由我们实验室从油菜的叶面上分离筛 选出来的。将其编号为N14，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏日期为2009年11月2日，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。保藏编号 为CGMCC No. 3374。该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到了 GenBank数据库，登录号为GU086422。在http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的 16S rDNA基因序列进行比较，结果表明与枯草芽孢杆菌的相似性最高，可以达到99X以上。
本发明所述的菌剂的生产方法如下
1、培养基配制 1)菌种保藏培养基(固体，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，加水 至1L， pH 7. 0-7. 5 ; 2)菌种活化培养基(液体，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L， pH 7. 0-7. 5 ; 3)种子培养基(液体，10L) :MgS04 1. Og， KH2P04 5. 0g， NaCl 5. 0g， K2HP04 15. 0g， 蔗糖100g，蛋白胨50g，加水至10L，pH 7.0-7.5 ;4)发酵培养基(液体，200L) :MgS04 20g，KH2P04 1 00g，NaCl 100g，K2HP04 3 00g，糖 蜜12kg， (NH4)2S040 . 8kg，加水至200L， pH 7. 0-7. 5 ;
以上培养基均在121。C灭菌15-30min。 2、菌种活化挑取有机磷农药降解菌至菌种保藏培养基，3(TC连续划线、挑单菌落 培养两次后，挑取单菌落接种于菌种活化培养基中，于3(TC， 150-200r/min摇床振荡培养 12-24h ; 3、液体种子制备向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5% _10%的接 种量接种步骤2活化的有机磷农药降解菌，于25-37°C ，通空气培养12-24h，得到液体种子。
4、液态发酵向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5% _10%的接种量 接种有机磷农药降解菌液体种子，于25-37t:，通空气培养18-60h，得到活菌体培养物。
5、菌剂制备培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓縮，调节至1(TCFU/mL，加入 甘氨酸(质量分数0.3%-2%)和甘油(质量分数0.5%-5%)，灌装保藏。使用时用水稀 释500-1000倍。 由本发明技术方案生产的有机磷农药降解菌剂能够有效降解作物表面残留的有 机磷农药。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本 发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
实施例1 :有机磷农药降解菌剂生产
1、培养基配制 1)菌种保藏培养基(固体，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，加水 至1L， pH 7. 2 ; 2)菌种活化培养基(液体，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L， pH
7. 2 ; 3)种子培养基(液体，10L) :MgS04 1. Og， KH2P04 5. Og， NaCl 5. Og， K2HP04 15. Og， 蔗糖100g，蛋白胨50g，加水至10L，pH 7.2;4)发酵培养基(液体，200L) :MgS04 20g，KH2P04 1 00g，NaCl 100g，K2HP04 3 00g，糖 蜜12kg， (NH4)2S040 . 8kg，加水至200L， pH 7. 2 ;
以上培养基均在12rC灭菌15min。 2、菌种活化挑取有机磷农药降解菌至菌种保藏培养基，3(TC连续划线挑单菌落 培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30°C ， 150r/min摇床振荡培养20h ;
4
3、液体种子制备向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5%的接种量 接种经步骤2活化的有机磷农药降解菌，于3(TC，通空气培养20h，得到液体种子。
4、液态发酵向装有高温灭菌的发酵培养基中，接种有机磷农药降解菌液体种子， 于3(TC，通空气培养30h，得到活菌体培养物。 5、菌剂制备培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓縮，调节至1(TCFU/mL，加入
甘氨酸(质量分数0.5%)和甘油(质量分数1.5%)，灌装保藏。 实施例2 :有机磷农药降解菌剂对油菜叶面敌敌畏农药残留的降解效果 1)选取两个完全相同的油菜地块，各30!112，均匀喷洒1000倍稀释的80%敌敌畏乳
油农药； 2) 6h后，均匀喷施农药降解菌剂(用清水稀释600倍)，以喷施清水作对照；
3) 24h后，五点取样法检测油菜叶面敌敌畏残留，发现处理组较对照组敌敌畏残留 量减少80%左右。 实施例3 :有机磷农药降解菌剂对油菜叶面乐果的降解效果 1)选取两个完全相同的油菜地块，各301112，均匀喷洒1000倍稀释的50%乐果乳油 农药； 2)6h后，均匀喷施农药降解菌剂(用清水稀释800倍)，以喷施清水作对照；
3) 36d后，五点取样法检测油菜叶面乐果的残留，发现处理组较对照组乐果残留量 减少65%左右。 本发明所提供的降解有机磷农药的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏日期为2009年11月2日，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。保藏编号为CGMCCNo. 3374。
权利要求
一株能够高效降解有机磷农药的芽孢杆菌，其特征在于该菌株是一株枯草芽孢杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.3374。
2. 权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于该菌株的16S rDNA基因序列已经递 交到GenBank数据库，登录号为GU086422。
3. 用权利要求1所述芽孢杆菌的菌剂生产方法，其特征在于发酵培养基以糖蜜为主要营养物质，生产步骤包括(1) 培养基配制1) 菌种保藏培养基(固体，lU :蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，加水至1L， pH7. 0-7. 5 ;2) 菌种活化培养基(液体，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L， pH7. 0-7. 5 ;3) 种子培养基(液体，IOL) :MgS04 1.0g，KH2P04 5. 0g， NaCl 5. 0g， K2HP04 15.0g，蔗糖 100g，蛋白胨50g，加水至10L，pH7. 0-7.5 ;4) 发酵培养基(液体，200L) :MgS04 20g， KH2P04 1 00g， NaCl 100g， K2HP04300g，糖蜜 12kg， (NH4)2S04 0 . 8kg，加水至200L， pH7. 0-7. 5 ;以上培养基均在121。C灭菌15-30min。(2) 菌种活化挑取有机磷农药降解菌至菌种保藏培养基，3(TC连续划线、挑单菌落 培养两次后，挑取单菌落接种于菌种活化培养基中，于30°C， 150-200r/min摇床振荡培养 12-24h ;(3) 液体种子制备向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5% _10%的接种 量接种步骤(2)活化的有机磷农药降解菌，于25-37t:，通空气培养12-24h，得到液体种子。(4) 液态发酵向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5% _10%的接种量接 种步骤(3)制备的有机磷农药降解菌液体种子，于25-37t:，通空气培养18-60h，得到活菌 体培养物。(5) 菌剂制备培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓縮，调节至1(^CFU/mL，加入甘氨 酸(质量分数0.3%-2%)和甘油(质量分数0.5%-5%)，灌装保藏。使用时用水稀释 500-1000倍。
全文摘要
本发明涉及一株分离自油菜叶际的能够高效降解有机磷农药的芽孢杆菌，并提供其菌剂的生产方法，属于生物技术领域。经鉴定这株菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.3374，该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到GenBank数据库，登录号为GU086422。其菌剂的生产方法包括5个步骤培养基配制、菌种活化、液体种子制备、液态发酵、菌剂制备，发酵培养基以糖蜜为主要原料。由本发明技术方案生产的有机磷农药降解菌剂能高效原位降解植物叶片上有机磷农药残留，保障食品安全，保护生态环境。
文档编号C12N1/20GK101709282SQ20091022783
公开日2010年5月19日 申请日期2009年12月23日 优先权日2009年12月23日
发明者刘冬芹, 姜丹, 李林, 杨建州, 王晓辉, 白志辉 申请人:河北科技大学