专利名称：：一种检测辐照食品的微生物快速筛选方法
技术领域：
：本发明提供一种检测辐照食品的方法，属于食品卫生领域，具体地讲，涉及用微生物快速筛选方法来检测辐照食品的技术。
背景技术：
：食品辐照是第二次世界大战后发展起来的一种食品加工和食品保藏技术。它利用电离辐射(6°Co。或137"放射源产生的Y射线、电子加速器产生的低于10MeV电子束或X射线)对食品和其他农副产品进行加工处理，以达到控制食源性病原体，减少微生物负载和虫害，抑制发芽和延长易腐烂农产品使用期的目的，其具有冷加工处理、无二次污染和化学残留、能耗低等特点，在食品包装材料，农产品、禽肉制品及水产品等杀虫、灭菌领域有着广泛的应用。目前，我国颁布的辐照食品工艺标准涉及的食品种类有几十种，但由于缺乏必要的鉴别技术无法分辨食品是否经过辐照处理，很多企业认为辐照具有很好的灭菌效果，放松了对中间生产、加工过程的卫生控制，细菌病毒严重超标的产品拉去辐照一下"达标"，所以很多没有工艺标准的产品都去辐照，而且是辐照的剂量比较大。另外，辐照食品的潜在安全性问题尚存在争议，尽管在目前允许的食品种类，辐照剂量的作用下的辐照食品是安全的，但不当的辐照会对食品的颜色、味道、营养产生一些副作用，比如脱色、有臭味、破坏一些营养成分，辐照残留也对人的健康存在安全隐患，所以通过辐照食品鉴别来监控违法辐照对于防止危害，保障健康具有不可忽视的作用。而且近年来随着进出口贸易的发展，辐照食品管理中标识的问题已得到欧盟、日韩等国的重视，其影响很可能类是于对转基因食品的要求一样波及全球。目前，美国、英国、德国等国家对食品辐照有比较详细的要求，对于食品种类、辐照剂量、辐照设施、食品辐照的标示都有明确的规定，强调"只有得到许可和经批准的辐照设施才能为特定的目的处理特定的食品"。而由于我国的辐照装置的资格认证一直没有标准可依，目前国内还没有欧盟批准的辐照机构，所以我国规定对欧盟出口食品均不得进行辐照处理，但2004年-2006年的两年时间内，我国出口食品先后10次被欧盟通报存在有非法辐照问题，而且水产品、药材和食品等被检出非法辐照或未标注辐照标示，导致相应货物的禁售和退运。因此，日益严峻的食品安全问题和进出口贸易情况对进出口辐照食品鉴别技术的研究需求已迫在眉睫，只有加强进出口辐照食品鉴别技术的研究，才能监控违法辐照以防止危害保障健康；才能使辐照标签的标示管理规定得到真正的落实，维护消费者合法权益，进而保证进出口贸易的顺利发展。目前，我国尚无相应的国家标准。2006-2007年农业部发布了热释光检测香辛料、脱水蔬菜和新鲜水果、蔬菜的两个行业标准，正在制定宠物食品等检测标准，但相对于当前我国已颁布的允许辐照的7个大类几十种食品的辐照工艺标准而言，无论是数量上还是食品类别上都无法满足检测的实际需求。此外，现有的热释光法、ESR法以及化学法均需要使用昂贵的仪器，方法复杂、对操作人员要求也比较高，检测时间长，不适于大批量检测，所以3加强检测辐照食品的快速初筛方法的研究是极其必要的。
发明内容本发明的第一个目的是针对食品安全中辐照食品检测种类繁多，检测通量要求高的特点，为解决当前辐照食品检测中存在的价格昂贵、操作费时、检测通量低等缺陷，提供了一种微生物快速筛选方法检测辐照食品的方法，具体来讲就是，通过检测食品中内毒素的含量和革兰氏阴性菌计数，并比较两者的差异情况来判定食品是否经过辐照处理。通过微生物筛选方法检测辐照食品的方法包括内毒素含量的检测，革兰氏阴性菌的计数和两者之间的差异比较。内毒素含量的检测原理是在适宜的条件下(温度，PH值及无干扰物质)，细菌内毒素激活鲎变形细胞溶解物(鲎试剂)中的凝固酶原，使鲎变形细胞溶解物(鲎试剂)产生凝集反应形成凝胶。革兰氏阴性菌计数的原理是在2rc士rc的条件下，革兰氏阴性菌在含有乳酸链球菌素、青霉素和结晶紫的选择性培养基中好氧生长。通过比较待测样品中细菌内毒素含量与革兰氏阴性菌计数差异来初步判定所测样品是否经过辐照处理。本发明是通过以下技术方案实现的1.内毒素标准品(1)内毒素标准品的获得可通过商业公司购买所需要的内毒素标准品，例如厦门鲎试剂厂的内毒素标准品(IOEU)。(2)内毒素标准品的溶解取内毒素标准品(10EU)加入lml无内毒素水，复溶后置漩涡混匀器混匀15min，充分溶解，制成10EU/mL的内毒素标准品溶液。2.鲎试剂(1)鲎试剂的获得可通过商业公司购买所需要的内毒素标准品，例如厦门鲎试剂厂的鲎试剂。(2)鲎试剂的溶解按鲎试剂标示量，加入无内毒素水溶解，轻轻振摇至少30s至试剂完全溶解。注意不要引起气泡，溶解后的试剂应在短时间内使用。3.蛋白胨盐溶液的获得将氯化钠8.5g，酪蛋白消化酶l.Og，溶解在1000mL蒸馏水中溶解并混合均匀，调整溶液pH为7.0±0.2(25°C)，分装于试管中，每管9mL，i2rc士rc高压灭菌15min备用。溶液在4°c士rc最多保存2周。4.营养琼脂的获得5.0g氯化钠，5.0g酪蛋白消化酶，1.0g肉类提取物，2.0g酵母提取物，和9.Og18.Og(由琼脂的凝胶强度决定)琼脂加入1000mL蒸馏水混合，加热煮沸至完全溶解后，调整溶液pH值至7.4士0.2，121°C士rC高压灭菌15min。待琼脂冷却至45"5(TC后，倾注于平皿中，每个平皿倾注10mL备用。5.基础培养基的获得将牛奶琼脂(Oxoid)24.0g，Nisin(40000IU/L)40.Omg，溶解在997mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解后，调整溶液pH值至7.4±0.2，121°C士rC高压灭菌15min，冷却至45°C5(TC作为基础培养基备用。6.结晶紫溶液的获得将10.Omg结晶紫充分溶解在10.OmL蒸馏水中，使用0.22iim滤膜过滤除菌后备用，4t:6t:可保存2周。7.青霉素溶液的获得将100mg青霉素-G(20000IU/L)充分溶解在10.OmL蒸馏水中，使用0.22nm滤膜过滤除菌后备用，4t:6t:可保存1周。8.革兰氏阴性菌培养基的获得无菌条件下，将1.2mL青霉素溶液和2.0mL结晶紫溶液加入997mL45°C50°C的基础培养基中，混合均匀后分装待用。9.内毒素含量检测方法(1)检测程序以内毒素标准品为阳性对照，无内毒素水为阴性对照，分别取O.lmL不同稀释度的样品匀液加入含有0.lmL鲎试剂的无内毒素试管中，混合摇匀，用paraflim封口膜封闭管口，37。C士rC反应60min士2min。(2)结果判定当试管内的内容物发生完全凝集时为阳性记为"+"，部分凝集时记为+/-"，未凝集时为阴性记为"_"。(3)效价的计算通过不同稀释度中最后的阳性结果来决定效价，效价计算实例如表所示，若试管内容物发生完全凝集时，以实际效价用于内毒素含量计算；若发生部分凝集时，则以此稀释度的效价加上其前发生完全凝集的稀释度效价，取其平均效价用于内毒素含量计算。例如表l。表l.内毒素实验效价计算实例样品不同稀释度样品匀液内毒素实验反应结果效价10-1010"510-20It)'2510-3010-3.510"40样品1++1.5样品2+++/—1.25(4)内霉素含量的计算测试样品中内毒素含量用EU/g来报告，结果表述为logl。EU/g。使用公式(1)和(2)计算每克样品含有的内毒素量EU:EU/ml=10(Mr)X溶解物的灵敏度(由试剂生产商提供)(1)EU/g^EU加lx10(2)10.革兰氏阴性菌的计数方法(1)样品匀液的制备以无菌操作称取剪碎后的样品10g，置于装有90mL无内毒素水的灭菌塑料袋(或容器)中，充分振摇、混匀，制成i0—工样品匀液。10—工样品匀液可在rc4t:保存，以备进行GNB检测和内毒素检测，内毒素检测最好在2小时内进行。用lmL灭菌吸管准确吸取10—1样品匀液lmL，加入装有9mL蛋白胨盐溶液的灭菌试管中，充分振荡，制成10—2样品匀液。从容器中吸取样品匀液和以后的稀释操作中，吸管尖部不要触及瓶口或管口。再分别用lmL灭菌吸管上述稀释方法所述重复相同操作直到样品被充分稀释(通常稀释到10—5)。5(2)接种与培养倾注约10mL制备好的营养琼脂(保温至45°C±1°C)于培养皿中，水平放置，待其凝固备用。分别在已凝固的营养琼脂平板上涂布O.lmL不同稀释度的样品匀液，每个稀释度涂布两个平板。室温(20°C25°C)条件下放置90min。再倾注约10mLGNB选择性琼脂(保温至45t:±rc)于已凝固的营养琼脂表面。小心操作，避免倾注的琼脂太厚。待琼脂凝固后将平皿翻转，21°C±rC培养24h±lh。若平板上菌落的直径均<0.5mm，该平板应继续培养24h后再进行计数。(3)菌落计数与结果报告对菌落数15300的平板进行计数。按照方程式(1)计算每克测试样品中存在的革兰氏阴性菌数N(单位cfuGNB/g)，结果表述为l0gl。cfuGNB/g。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(1)式中EC表示2个连续稀释度样品匀液所有可计数平板的菌落数总和；V表示接种到每个平板的样品匀液的体积，用mL表示；&表示第一个稀释度计数的平板数；n2表示第二个稀释度计数的平板数；d表示与第一个稀释度相关的稀释因子。例如<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>若最低稀释倍数10—工样品匀液的平板上菌落数少于15个，报告结果为估计值(E)。若最低稀释度10—1样品匀液的平板上未发现革兰氏阴性菌，应报告"革兰氏阴性菌未检出"。11.结果判断根据公式lo^EU/g-lc^。cfuGNB/g，计算革兰氏阴性菌数和细菌内毒素结果的差异，判断食品样品是否经过辐照处理。(1)若样品中细菌内毒素含量高，革兰氏阴性菌数少或不可检测，S卩(logl。EU/g-l0gl。CfUGNB/g)>0，则表明样品中微生物状态不正常，该样品疑是辐照样品，需进行进一步的辐照鉴定试验。(2)若细菌内毒素浓度与革兰氏阴性菌数都很高且相是，则表明样品的微生物状态正常。即当1o&。EU/g-logi。cfuGNB/g《0时，该样品是未辐照的样品。(3)若细菌内毒素值logl。EU/g<2，且革兰氏阴性菌数也很低，即l0gl。cfuGNB/g<2时，该结果应判定为不可确定，需进行进一步的辐照鉴定试验。应当理解的是，该方法是一种快速初筛方法，其基本原理为，细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖(LipoplySaccharide)和微量蛋白(Protein)的复合物，它是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。食品经过一定剂量辐照后，食品中活的革兰氏阴性菌基本上会被杀死，产生大量的细菌内毒素。通过对细菌内毒素的测定(Limulusamoebocytelysatetest)和革兰氏阴性菌的培养计数可以估算食品中死的革兰氏阴性菌总数与活的革兰氏阴性菌总数。如果两个结果的差异很大，说明该食品微生物状态异常，可能经过辐照处理。按照该发明方法判定疑是辐照处理的食品样品需要结合其它方法进行确认。以未辐照和分别经钴60辐照2.5kGy、5kGy、lOkGy3个剂量的鸡胸样品、鸡翅样品和鸡腿样品为例，应用本发明方法进行革兰氏阴性菌计数和细菌内毒素检测。未辐照的三种样品，logi。EU/g-logi。cfuGNB/g均〈O，结果得出该样品为未辐照样品。2.5kGy、5kGy和10kGy三个剂量分别辐照的三种样品，lc^。EU/g-lo^cfuGNB/g均>0，结果得出该样品疑是辐照过样品，需进一步确证。应当理解的是，该方法所建立的微生物快速筛选方法进行辐照食品的快速筛查，仪器设备要求较低，操作简便，检测时间短，成本低，能同时对多种食品样品进行高通量检测，适用于常规微生物检验实验室对辐照食品的初筛检测。应当理解的是，本发明的食品还可以是猪肉、牛肉、马肉、羊肉、、狗肉、鸭肉、鹅肉、鸽肉、火鸡肉等肉及肉制品，虾仁、鱼丸、虾丸、鱿鱼、蟹棒等水产品和速冻产品等。与鸡胸、鸡翅、鸡腿相比，由于这些其它食品的检测目标都是内毒素含量和革兰氏阴性菌计数，并且检测原理、检测方法相同，因此根据以上所述，本领域技术人员在理解本发明原理的基础上使用本发明的检测方法显然可以获得任一种食品的内毒素含量和革兰氏阴性菌计数值，并能得到两者的差异值，从而初步判断该食品是否是辐照食品。本发明的第二个目的是提供上述检测方法在用于检测辐照食品的用途。本发明的第三个目的是提供上述检测方法在用于检测辐照食品的用途。与现有技术相比，本发明具有以下优点1.检测仪器要求低，适用于常规微生物实验室检测。2.检测时间短，不需要复杂的前处理过程。3.操作简便，微生物实验室人员均可进行操作。4.检测成本低，克服了大型仪器设备及前处理设备费用高的问题。5.能够实现对大量、多种食品样品的高通量检测。6.根据检测原理，检测目标可以是各种禽畜肉产品、水产品、速冻产品等食品，克服了现有技术中检测目标过于单一的缺陷。总之，本发明的检测方法对仪器要求低，适用于常规微生物实验室对辐照食品的检测。易于操作，不需要复杂的前处理过程。检测成本低，克服了大型仪器设备及前处理设备费用高的问题。尤其是在同时检测大批量多种样品的情况下，其高通量的特点尤其明显。本发明作为一种快速初筛方法，操作简便，检测迅速，检测成本低，能够实现对大量、多种食品样品的高通量检测。填补了国内辐照食品快速筛选方法的空白，为现有技术缓解大量压力，能够有效地应用于辐照食品的初筛检测。具体实施例方式现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的微生物学等常规技术。这些技术是技术人员熟知的。实施例1样品某鸡胸样品。该样品经钴60辐照得到9个辐照剂量(0kGy;lkGy;1.5kGy;2kGy;2.5kGy;5kGy;7.5kGy;10kGy;15kGy)的辐照样品。不同剂量的辐照样品用微生物筛选方法检测其是否是辐照食品。1、待分析样品的制备以无菌操作称取不同辐照剂量样品10g，置于装有90mL无内毒素水的灭菌塑料袋(或容器)中，充分振摇、混匀，制成10—工样品匀液。10—工样品匀液可在1°CfC保存，以备进行GNB检测和内毒素检测。内毒素检测最好在2小时内进行。2、革兰氏阴性菌的检测程序(1)用lmL灭菌吸管准确吸取10—1样品匀液lmL，加入装有9mL蛋白胨盐溶液的灭菌试管中，充分振荡，制成10—2样品匀液。(2)分别用lmL灭菌吸管上述稀释方法所述重复相同操作直到样品被充分稀释(通常稀释到10—5)。(3)倾注约10mL制备好的营养琼脂(保温至45°C±1°C)于培养皿中，水平放置，待其凝固备用。(4)分别在已凝固的营养琼脂平板上涂布O.lmL不同稀释度的样品匀液，每个稀释度涂布两个平板。室温(20°C25°C)条件下放置90min。(5)然后再倾注约10mLGNB选择性琼脂(保温至45°C±1°C)于营养琼脂表面。小心操作，避免倾注的琼脂太厚。待琼脂凝固后将平皿翻转，2rc士rC培养24h士lh。若平板上菌落的直径均<0.5mm，该平板应继续培养24h后再进行计数。结果如表1所示。表l.不同辐照剂量的鸡胸样品革兰氏阴性菌培养结果8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、细菌内毒素的检测程序(1)用lmL无内毒素吸头吸取300iiL10—'样品匀液，加入装有650iiL无内毒素水的灭菌无内毒素试管中，通过移液器吹吸使其充分混合均匀，制成稀释倍数为10—a5的样品匀液。(2)分别用lmL无内毒素吸头按照(1)所述重复相同操作，将10—°5的样品匀液依次稀释为10—1Q、10—15、10—2°、10—2'5、10—3。的……直到样品被充分稀释(通常稀释到10,，。(3)以内毒素标准品为阳性对照，无内毒素水为阴性对照，分别取0.lmL不同稀释度的样品匀液加入含有0.lmL鲎试剂的无内毒素试管中，混合摇匀，用paraflim封口膜封闭管口，37"士rC反应60min士2min。结果如表2所示。表2.不同辐照剂量的鸡胸样品内毒素定量检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4、结果计算与判断。鸡胸OkGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=3.2-5.1=_1.9<0该样品为未辐照样品。鸡胸lkGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=3.2-3.88=_0.68<0该样品为未辐照样品。鸡胸1.5kGy样品logi。EU/g-logi。cfuGNB/g=3.2-0.48=2.72>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡胸2kGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=3.2-0.30=2.9>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡胸2.5kGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=3.2-0.7=2.5>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡胸5kGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=3.2-0=3.2>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡胸7.5kGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=3.7-0=3.7>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡胸10kGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=3.7-0=3.7>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡胸15kGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=3.7-0=3.7>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。通过以上计算结果可知，鸡胸样品分别经OkGy(未辐照)和lkGy辐照后的样品细菌内毒素浓度与革兰氏阴性菌数都很高，lo^EU/g-lo^cfuGNB/g<0，该剂量辐照样品是未辐照的样品。而辐照剂量^1.5kGy时lc^。EU/g-logi。cfuGNB/g>O，该剂量范围辐照样品疑是辐照样品。结果表明，该方法具有对辐照无皮鸡胸样品初筛的功能，检测灵敏度>1.5kGy。实施例2样品某鸡翅样品。该样品经钴60辐照得到9个辐照剂量(OkGy;lkGy;1.5kGy;2kGy;2.5kGy;5kGy;7.5kGy;10kGy;15kGy)的辐照样品。不同剂量的辐照样品用微生物筛选方法检测其是否是辐照食品。1、待分析样品的制备以无菌操作称取不同辐照剂量样品10g，置于装有90mL无内毒素水的灭菌塑料袋(或容器)中，充分振摇、混匀，制成10—工样品匀液。10—工样品匀液可在1°CfC保存，以备进行GNB检测和内毒素检测。内毒素检测最好在2小时内进行。2、革兰氏阴性菌的检测程序(1)用lmL灭菌吸管准确吸取10—工样品匀液lmL，加入装有9mL蛋白胨盐溶液的灭菌试管中，充分振荡，制成10—2样品匀液。(2)分别用lmL灭菌吸管上述稀释方法所述重复相同操作直到样品被充分稀释(通常稀释到10—5)。(3)倾注约lOmL制备好的营养琼脂(保温至45t:±1°C)于培养皿中，水平放置，待其凝固备用。(4)分别在已凝固的营养琼脂平板上涂布O.lmL不同稀释度的样品匀液，每个稀释度涂布两个平板。室温(20°C25°C)条件下放置90min。(5)然后再倾注约10mLGNB选择性琼脂(保温至45°C±1°C)于营养琼脂表面。小心操作，避免倾注的琼脂太厚。待琼脂凝固后将平皿翻转，2rc士rC培养24h士lh。若平板上菌落的直径均<0.5mm，该平板应继续培养24h后再进行计数。结果如表3所示。表3.不同辐照剂量的鸡翅样品革兰氏阴性菌培养结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3、细菌内毒素的检测程序(1)用lmL无内毒素吸头吸取300iiL10—'样品匀液，加入装有650iiL无内毒素水的灭菌无内毒素试管中，通过移液器吹吸使其充分混合均匀，制成稀释倍数为10—°5的样品匀液。(2)分别用lmL无内毒素吸头按照(1)所述重复相同操作，将10—°5的样品匀液依次稀释为10—u、10—15、10—2』、10—25、10—3°的……直到样品被充分稀释(通常稀释到10—5)，。(3)以内毒素标准品为阳性对照，无内毒素水为阴性对照，分别取O.lmL不同稀释度的样品匀液加入含有0.lmL鲎试剂的无内毒素试管中，混合摇匀，用paraflim封口膜封闭管口，37。C士rC反应60min士2min。结果如表4所示。表4.不同辐照剂量的鸡翅样品内毒素定量检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4、结果计算与判断。鸡翅OkGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=4.2-5.15=_0.95<0该样品为未辐照样品。鸡翅lkGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=4.2—4.53=_0.33<0该样品为未辐照样品。鸡翅1.5kGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=4.2-0.6=3.8>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡翅2kGy样品logi。EU/g-log^cfuGNB/g=4.2-0=4.2>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡翅2.5kGy样品logi。EU/g-logi。cfuGNB/g=4.2-0=4.2>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡翅5kGy样品logi。EU/g-log^cfuGNB/g=4.2-0=4.2>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡翅7.5kGy样品logi。EU/g-logi。cfuGNB/g=4.2-0=4.2>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡翅10kGy样品logi。EU/g-logi。cfuGNB/g=4.2-0=4.2>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡翅15kGy样品logi。EU/g-log^cfuGNB/g=4.2-0=4.2>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。通过以上计算结果可知，鸡翅样品分别经OkGy(未辐照)和lkGy辐照后的样品细菌内毒素浓度与革兰氏阴性菌数都很高，1ogi。EU/g-lo^。cfuGNB/g〈0，该剂量辐照样品是未辐照的样品。而辐照剂量^1.5kGy时lc^。EU/g-logi。cfuGNB/g>O，该剂量范围辐照样品疑是辐照样品。结果表明，该方法具有对辐照带皮鸡翅样品初筛的功能，检测灵敏度>1.5kGy。实施例3样品某鸡腿样品。该样品经钴60辐照得到9个辐照剂量(0kGy;lkGy;1.5kGy;2kGy;2.5kGy;5kGy;7.5kGy;10kGy15kGy)的辐照样品。不同剂量的辐照样品用微生物筛选方法检测其是否是辐照食品。1、待分析样品的制备以无菌操作称取不同辐照剂量样品10g，置于装有90mL无内毒素水的灭菌塑料袋(或容器)中，充分振摇、混匀，制成10—工样品匀液。10—工样品匀液可在1°CfC保存，以备进行GNB检测和内毒素检测。内毒素检测最好在2小时内进行。2、革兰氏阴性菌的检测程序(1)用lmL灭菌吸管准确吸取10—工样品匀液lmL，加入装有9mL蛋白胨盐溶液的灭菌试管中，充分振荡，制成10—2样品匀液。(2)分别用lmL灭菌吸管上述稀释方法所述重复相同操作直到样品被充分稀释(通常稀释到10—5)。(3)倾注约lOmL制备好的营养琼脂(保温至45t:±1°C)于培养皿中，水平放置，待其凝固备用。(4)分别在已凝固的营养琼脂平板上涂布O.lmL不同稀释度的样品匀液，每个稀释度涂布两个平板。室温(20°C25°C)条件下放置90min。(5)然后再倾注约10mLGNB选择性琼脂(保温至45°C±1°C)于营养琼脂表面。小心操作，避免倾注的琼脂太厚。待琼脂凝固后将平皿翻转，2rc士rC培养24h士lh。若平板上菌落的直径均<0.5mm，该平板应继续培养24h后再进行计数。结果如表5所示。表5.不同辐照剂量的鸡腿样品革兰氏阴性菌培养结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>3、细菌内毒素的检测程序(1)用lmL无内毒素吸头吸取300iiL10—'样品匀液，加入装有650iiL无内毒素水的灭菌无内毒素试管中，通过移液器吹吸使其充分混合均匀，制成稀释倍数为10—°5的样品匀液。(2)分别用lmL无内毒素吸头按照(1)所述重复相同操作，将10—°5的样品匀液依次稀释为10—1Q、10—15、10—2°、10—25、10—3°的……直到样品被充分稀释(通常稀释到10—5)，。(3)以内毒素标准品为阳性对照，无内毒素水为阴性对照，分别取O.lmL不同稀释度的样品匀液加入含有0.lmL鲎试剂的无内毒素试管中，混合摇匀，用paraflim封口膜封闭管口，37。C士rC反应60min士2min。结果如表6所示。表6.不同辐照剂量的鸡腿样品内毒素定量检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>4、结果计算与判断。鸡腿OkGy样品logl。EU/g-logl。cfuGNB/g=4.2-5.64=-1.44<0该样品为未辐照样品。鸡腿lkGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=4.2-5.0=_0.8<0该样品为未辐照样品。鸡腿1.5kGy样品logi。EU/g-logi。cfuGNB/g=4.2-0.3=3.9>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡腿2kGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=4.2-0.30=2.9>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡腿2.5kGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=4.2-0.7=2.5>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡腿5kGy样品logi。EU/g-logi。cfuGNB/g=4.2—0=4.2>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡腿7.5kGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=4.7—0=4.7>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡腿10kGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=4.7—0=4.7>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。鸡腿15kGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=4.7—0=4.7>0该样品疑是辐照样品，需进一步确证。通过以上计算结果可知，带皮鸡腿样品分别经OkGy(未辐照)和lkGy辐照后的样品细菌内毒素浓度与革兰氏阴性菌数都很高，lo^EU/g-lo^cfuGNB/g<0，该剂量辐照样品是未辐照的样品。而辐照剂量^1.5kGy时lc^。EU/g-logi。cfuGNB/g>O，该剂量范围辐照样品疑是辐照样品。结果表明，该方法具有对辐照鸡腿样品初筛的功能，检测灵敏度>1.5kGy。实施例4样品某羊肉样品。该样品经钴60辐照得到2个辐照剂量(0kGy;5kGy)的辐照样品。不同剂量的辐照样品用微生物筛选方法检测其是否是辐照食品。1、待分析样品的制备以无菌操作称取不同辐照剂量样品10g，置于装有90mL无内毒素水的灭菌塑料袋(或容器)中，充分振摇、混匀，制成10—工样品匀液。10—工样品匀液可在1°CfC保存，以备进行GNB检测和内毒素检测。内毒素检测最好在2小时内进行。2、革兰氏阴性菌的检测程序(1)用lmL灭菌吸管准确吸取10—工样品匀液lmL，加入装有9mL蛋白胨盐溶液的灭菌试管中，充分振荡，制成10—2样品匀液。(2)分别用lmL灭菌吸管上述稀释方法所述重复相同操作直到样品被充分稀释(通常稀释到10—5)。(3)倾注约lOmL制备好的营养琼脂(保温至45t:±1°C)于培养皿中，水平放置，待其凝固备用。(4)分别在已凝固的营养琼脂平板上涂布O.lmL不同稀释度的样品匀液，每个稀释度涂布两个平板。室温(20°C25°C)条件下放置90min。(5)然后再倾注约10mLGNB选择性琼脂(保温至45°C±1°C)于营养琼脂表面。小心操作，避免倾注的琼脂太厚。待琼脂凝固后将平皿翻转，2rc士rC培养24h士lh。若平板上菌落的直径均<0.5mm，该平板应继续培养24h后再进行计数。结果如表7所示。表7.不同辐照剂量的多种样品革兰氏阴性菌培养结果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3、细菌内毒素的检测程序(1)用lmL无内毒素吸头吸取300iiL10—'样品匀液，加入装有650iiL无内毒素水的灭菌无内毒素试管中，通过移液器吹吸使其充分混合均匀，制成稀释倍数为10—°5的样品匀液。(2)分别用lmL无内毒素吸头按照(1)所述重复相同操作，将10—°5的样品匀液依次稀释为10—1Q、10—15、10—2°、10—25、10—3°的……直到样品被充分稀释(通常稀释到10—5)，。(3)以内毒素标准品为阳性对照，无内毒素水为阴性对照，分别取O.lmL不同稀释度的样品匀液加入含有0.lmL鲎试剂的无内毒素试管中，混合摇匀，用paraflim封口膜封闭管口，37。C士rC反应60min士2min。结果如表8所示。表8.不同辐照剂量的多种样品内毒素定量检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>4、结果计算与判断。羊肉OkGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=2.2—4.03=—1.83<0该样品为未辐照样品。羊肉5kGy样品:log10EU/g-log10cfuGNB/g=2.2-0=2.2>0该样品疑是辐照样品。权利要求一种用于检测辐照食品的微生物快速筛选方法，其步骤包括(1)革兰氏阴性菌数的检测(2)细菌内毒素含量的检测(3)革兰氏阴性菌数与内毒素含量的差异比较(4)结果判定2.权利要求1所述的革兰氏阴性菌数，是通过革兰氏阴性菌计数方法，计算每克测试样品中存在的革兰氏阴性菌数N(单位cfuGNB/g)，结果表述为l0gl。cfuGNB/g。3.权利要求1所述的细菌内毒素含量，是通过细菌内毒素检测试剂盒，检测每克测试样品中细菌内毒素含量，用EU/g来报告，结果表述为logl。EU/g。4.权利要求1所述的结果判定是(1)若样品中细菌内毒素含量高，革兰氏阴性菌数少或不可检测，即(logl。EU/g-l0gl。CfUGNB/g)>O，则表明样品中微生物状态不正常，该样品疑是辐照样品，需进行进一步的辐照鉴定试验。(2)若细菌内毒素浓度与革兰氏阴性菌数都很高且近似，则表明样品的微生物状态正常。即当log10EU/g-logloCfuGNB/g《0时，该样品是未辐照的样品。(3)若细菌内毒素值l^。EU/g〈2，且革兰氏阴性菌数也很低，lc^。cfuGNB/g<2时，该结果应判定为不可确定，需进行进一步的辐照鉴定试验。5.权利要求2中所述的革兰氏阴性菌计数方法，步骤包括(1)使用不含内毒素的水将待测食品制备成适宜连续稀释度的样品匀液。(2)样品匀液在非选择性营养琼脂表面涂布接种使菌体复苏；室温(20°C25°C)下预孵育90min。(3)复苏后，用含有乳酸链球菌素、青霉素和结晶紫的选择性革兰氏阴性菌培养基覆盖在非选择性培养基表面；2rc士rc孵育。(4)革兰氏阴性菌计数。6.权利要求3中所述的细菌内毒素检测试剂盒检测步骤包括(1)使用不含内毒素的水将待测食品制备成适宜连续稀释度的样品匀液。(2)不同稀释度的样品匀液与鲎试剂混合均匀，37t:士rC反应60min士2min。同时做阳性和阴性对照。(3)结果判定(4)内毒素含量的计算。7.权利要求5中革兰氏阴性菌培养基的孵育时间是24h士lh或48h士2h。8.权利要求6中所述的结果判定是，当试管内的内容物发生完全凝集时为阳性记为"+"，部分凝集时记为"+/_"，未凝集时为阴性记为"-"。9.权利要求1至8中任一项所述的方法用于初筛检测辐照食品的方法。10.权利要求1至8中任一项所述的试剂盒用于初筛检测辐照食品的方法。11.权利要求9和10所述方法，其中食品可以是猪肉、牛肉、马肉、羊肉、、狗肉、鸭肉、鹅肉、鸽肉、火鸡肉等肉及肉制品，虾仁、鱼丸、虾丸、鱿鱼、蟹棒等水产品和速冻产品等。12.权利要求1至8中任一项所述的试剂盒在检测辐照食品方面的用途。13.权利要求1至8中任一项所述的方法在检测辐照食品方面的用途。全文摘要一种用于初筛检测辐照食品的方法，属于食品卫生领域，具体涉及一种运用微生物快速筛选方法检测辐照食品的方法。其技术方案是利用食品中内毒素的含量与革兰氏阴性菌计数的差异情况来判定食品是否经过辐照处理。本发明包括内毒素的检测方法、革兰氏阴性菌的计数方法以及与之配套的检测程序和结果判断方法。本发明填补了辐照食品微生物快速筛选方法的空白，用于大量辐照食品的快速高通量检测。该方法具有仪器设备要求低，操作简便，成本低、快速、高通量的特点。文档编号C12Q1/06GK101768624SQ20091022876公开日2010年7月7日申请日期2009年11月26日优先权日2009年11月26日发明者宓捷波申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心