专利名称：基于噬菌体专一性裂解原理的生物发光法快速检测致病菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测致病菌的方法，特别是涉及一种噬菌体专一性裂解联合 海洋发光细菌WiOtobacterium Ieiognathi 1菌株胞内荧光素酶和FMN: NADH氧化还原酶 的体外发光体系进行致病菌快速检测的方法。
背景技术：
据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，目前已知的海洋发光细菌只有三属， 分别是弧菌属(Vibrio)，明亮发光菌属(PhotcAacterium)，及希瓦氏菌属(Shewanella)， 陆地上则有异短杆菌属(Xenorhabdus)。在有氧的自然环境下，发光细菌可产生荧光素酶 (LE)，催化黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛类发生氧化反应，而发出监绿色的荧光。发光细菌的发光机理的研究表明，不同种类的发光细菌的发光机理是相同的，属 酶促氧化反应。是由分子氧作用，胞内荧光酶(LE)催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2) 及八碳以上的长链脂肪醛(RCHO)氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波 长为450 490nm的蓝绿光。荧光素酶和FMN:NADH氧化还原酶共同存在下的酶促氧化反应的原理如下FMN:NADH氧化还原酶对FMN有特异性，在NADH存在的条件下，将FMN还原为 FMNH2,为发光酶促反应提供底物。荧光素酶催化FMNH2和长链脂肪醛RCHO发生氧化还原反 应，同时发出监绿色荧光。噬菌体专一性裂解联合荧光素酶-FMN:NADH氧化还原酶体外发光体系快速检测 致病菌原理如下NADH是荧光素酶_FMN:NADH氧化还原酶体外发光体系的必需底物，在酶及其他底 物过量的情况下，NADH的浓度与荧光素酶-FMN:NADH氧化还原酶体外发光体系的发光强度
呈相关关系。NADH广泛存在于一切微生物的活细胞中，特定代谢时期的微生物细胞中NADH含 量相对稳定，其含量与食品中微生物的数量存在正相关性，且不同活细菌胞内NADH含量基 本一致，而细菌死亡后，在胞内酶作用下，NADH将很快被分解。以胞内NADH为测定指标，通 过测定样品中的NADH含量，即可推算出活菌数。噬菌体是广泛存在于自然界中的以细菌为宿主的一类病毒，有严格的宿主特异 性，一般只裂解相应的宿主细菌，而不裂解其他细菌。据本发明人通过查阅资料、文献检索 所知，目前利用噬菌体检测的技术主要有噬菌体扩增技术、生物发光噬菌体技术、化学发光 标记噬菌体技术和裂解产物技术。目前尚未有基于噬菌体专一性裂解原理的生物发光法快速检测致病菌的报道。
发明内容
本发明的目的是利用致病菌噬菌体专一性裂解技术，结合海洋发光细菌菌株 Photobacterium IeiognathiYL (鳆发光杆菌YL)胞内荧光素酶和FMN:NADH氧化还原酶体外发光体系进行致病菌的快速检测。本发明分离纯化出一株来源于海洋环境的发光细菌孔为革兰氏阴性杆菌，被鉴 定为鳆发光杆菌(Wiotobacterium leiognathi)。该菌株于2006年12月27目委托中国典 型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏号为M 206139。该菌株的16SrDNA基因序列已 经提交GenBank核酸序列数据库，存取号为EF017227。本发明借助噬菌体专一性裂解目的菌释放出胞内NADH，通过提取发光细菌胞内荧 光素酶和FMN: NADH氧化还原酶粗酶制剂，建立一种荧光素酶-FMN NADH氧化还原酶体外发 光的体系，实现了荧光素酶-FMN:NADH氧化还原酶双酶体系在活体细胞外的表达，通过双 酶体系对NADH的测定来确定目的菌菌数。其双酶体系特征是(1)最佳底物配比十 二烧酸 100 μ L (27mM)、FMN-Na 0. 5 μ L(IOmM)和 NADH 300 μ L (0. 14mM)，体系 pH 7.0。(2)发光检测在微弱发光仪中进行，检测条件是设置波长474nm，lmL酶液中，快 速加入各底物，立刻进行定时跟踪测定，连续测定间隔时间为1 s。其检测体系特征是目的菌由其对应噬菌体专一裂解，释放胞内NADH，应用从发光细菌胞内提取的产 物作为荧光素酶和FMN-NADH氧化还原酶粗酶制剂进行目的菌菌数的快速测定。本发明借助噬菌体专一性裂解致病菌，通过荧光素酶-FMN:NADH氧化还原酶发光 体系定量检测NADH实现了致病菌的快速检测。该体系发光性能稳定，发光强度高，底物配 比简便可行，且在一定条件下体系的发光强度与NADH的浓度呈正相关，因此可应用于致病 菌的快速检测。利用本发明检测致病菌具有成本低、操作简便、耗时短等特点，能够满足致 病菌快速检测的需要。
附图1不同浓度克雷伯氏菌对双酶体系发光强度的影响。附图2不同菌数克雷伯氏菌与双酶体系发光强度的标准曲线。
具体实施例方式实施例1酶液制备鳆发光杆菌YL 300mL，150r/min、25°C恒温培养至发光值320万以上，离心收集菌 体，沉淀用 0. 01mol/L PBS (pH 7. 0，内含 10mmol/L EDTA，lmmol/L DTT，下同)复溶，冰浴超 声粉碎细胞至发光值在10万以下；4°C冷冻离心(14000Xg，30min)，上清液用40% 80% 的固体硫酸铵盐析，离心，沉淀用20mLPBS(即湿重为Ig的菌体制备约4mL粗酶液)复溶， 4°C于PBS中透析24hr，即得实验用粗酶液。实施例2双酶体系发光强度测定ImL粗酶液中，一次性快速加入底物十二烷醛100μ (27πιΜ)、 FMN-NaO. 5 μ L(IOmM)，NADH 300 μ L(0. 14mM)，进行发光强度的测定。发光检测在微弱发光仪中进行，检测条件是加入溶液或试剂后，立刻进行定时跟 踪测定，连续测定间隔时间为ls，检测波长474nm。
实施例3噬菌体联合双酶体系快速检测克雷伯氏菌(Klesiella sp. NCTC 9133)专一裂解克雷伯氏菌所用噬菌体的效价2. 0 X 1012pfu/mL,克雷伯氏菌与其对应噬 菌体添加体积比1 1，35°C，150r/min摇床培养15min，应用双酶体系检测进行发光强度的 测定。同时做空白对照。实施例4不同浓度克雷伯氏菌对双酶体系发光强度的影响ImL酶液中加入一次性快速加入底物十二烷醛100 μ L (27mM)、FMN-Na 0.5 μ L(IOmM)，不同浓度(0D_表示)的克雷伯氏菌裂解液300 μ L(0. 14mM)，进行发光强度 的测定。克雷伯氏菌活细胞中NADH含量相对稳定，应用对应噬菌体裂解释放胞内NADH，菌 体浓度越高，裂解得到的胞内NADH含量越高，应用双酶体系检测时发光强度越高。如附图 1所示。实施例5噬菌体联合双酶体系检测鲅鱼肉中的克雷伯氏菌①不同菌数克雷伯氏菌与双酶体系发光强度的标准曲线测定方法同实施例4，每次测定重复3次，做不同菌数克雷伯氏菌与双酶体系发 光强度的标准曲线。以不同菌数的克雷伯氏菌为横坐标，双酶体系发光强度为纵坐标， 得到不同菌数克雷伯氏菌与双酶体系发光强度的标准曲线，如附图2所示，方程为y = 2113. 7X+2231. 8，R2 = 0. 9733。标准曲线的检出限为 2. 5X107CFU/mL。②噬菌体联合双酶体系检测鲅鱼肉中的克雷伯氏菌的加标回收实验及实际样品 检测精确称取鲅鱼肉2. 0g，加入到18. OmL营养肉汤培养基中，添加不同稀释梯度的克 雷伯氏菌菌悬液，漩涡混合均勻，静置1. Omin，取上清液3. OmL，添加3. OmL宿主菌噬菌体， 37°C，150r/m摇床培养15min，应用双酶体系检测各样品的发光强度。比对标准曲线，计算 克雷伯氏菌的实际检测菌数。检测重复5次，取平均值。以不加内标的鲅鱼肉样液作为空白本底。通过内标逐渐递加的方法，确定方法检出限(表1)。表1噬菌体联合双酶体系检测鲅鱼肉中克雷伯氏菌的加标回收实验及实际样品 检测(n = 5)
添加浓度测定值 冋收率相对标准偏差
权利要求
1. 一种基于噬菌体专一性裂解原理联合海洋发光细菌WiOtobacterium Ieiognathi YL菌株胞内荧光素酶和FMN:NADH氧化还原酶的体外发光体系进行快速检测致病菌的方法。其双酶体系特征是(1)双酶体系最佳底物配比十二烷醛100μ L(27mM)、FMN-Na 0. 5 μ L(IOmM)和NADH 300 μ L (0. 14mM)，体系 pH 7.0。(2)发光检测在微弱发光仪中进行，检测条件是设置波长474nm，ImL酶液中，快速加 入各底物，立刻进行定时跟踪测定，连续测定间隔时间为1 s。其检测体系特征是目的菌由其对应噬菌体专一裂解，释放胞内NADH，应用从发光细菌胞内提取的产物作 为荧光素酶和FMN-NADH氧化还原酶粗酶制剂进行目的菌菌数的快速测定。
全文摘要
本发明涉及了一种基于噬菌体专一性裂解原理的生物发光法快速检测致病菌的技术。本发明所用菌株鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)于2006年12月27日委托中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏号为M206139。该菌株的16S rDNA基因序列已经提交GenBank核酸序列数据库，存取号为EF017227。本发明借助噬菌体专一性裂解目的菌释放出胞内NADH，通过提取发光细菌胞内荧光素酶和FMN:NADH氧化还原酶粗酶制剂，建立了荧光素酶-FMN:NADH氧化还原酶体外发光的体系，通过双酶体系对NADH的测定来确定目的菌菌数。该方法具有快速、简便、专一性等特点，能够满足致病菌快速检测的需要。
文档编号C12R1/22GK102061342SQ20091023024
公开日2011年5月18日 申请日期2009年11月13日 优先权日2009年11月13日
发明者李萌, 林洪, 梅册霞, 王静雪 申请人:中国海洋大学