专利名称：一种蚓激酶制备工艺方法
技术领域：
本发明属于生物化学制药技术领域，涉及一种蚓激酶制备工艺方法。
背景技术：
血栓性疾病的高发病率、高死亡率及高致残率严重威胁人类的生存，溶栓性药物是治疗该病的首选用药。目前临床上使用的溶栓性药物中普遍存在易引起出血的副作用；有的价格昂贵，一般百姓难以承受；有的稳定性较差，保存条件要求较高，给用药者带来很多不便；有的品种给药方式单一，只有口服、或只有静脉或肌肉注射，使用药范围受到很大限制。 蚯蚓在中药中统称为地龙，可分为双胸蚓、赤子爱胜蚓、锯齿远蚓及参环毛蚓等不同种属，在我国早已被列入药源，其中作为活血化瘀应用已有几千年的历史。研究表明，新鲜的蚯蚓体内含有多种蛋白酶类，其中一组具有强烈溶解纤维蛋白及血栓作用的丝氨酸蛋白酶由日本Mihara等于八十年代首次发现，命名为蚓激酶，由此引起了国内外诸多学者的关注，开始了对蚓激酶从分离纯化和理化性质到药效学研究与临床应用等方面的广泛研究。大量的研究证实蚓激酶广泛存在于不同种属蚯蚓体内，是一组富含酸性氨基酸，分子量20000-40000道尔顿，具有激酶和纤溶酶双重功能的丝氨酸蛋白酶它既可类似纤溶酶直接降解纤维蛋白及纤维蛋白原，又类似尿激酶、链激酶等激活纤溶酶原形成纤溶酶，起到纤溶酶原激活剂的作用。蚓激酶的最大特点是稳定性好，纤溶活性强，药理作用明显，副作用小，可做成各种剂型的药品，且来源广泛。近20多年来，不少的研究人员都在力求将蚓激酶的研究推向实际应用，先后有各种各样的分离纯化技术问世。 如专利ZL 03134768. 1公开了通过采用单克隆抗体技术实现蚓激酶活性组分的再纯化，从而得到高纯度蚓激酶。专利ZL02153848. 4公开了通过粗分离先后过阴离子交换层析柱等精细纯化工艺能得到七个组分可满足实验室规模制备。专利ZL03146692. 3公开了采用包括阴离子交换层析、超滤、凝胶过滤脱盐等分离方法获得达电泳级蛋白酶。上述种种蚓激酶分离纯化方法都用到了柱层析技术，由于是粗提物直接上层析柱，所以柱子的负载量很大，相对于等量的填料，蚓激酶的收率很低；且蚓激酶的制备成本很高，产生需处理的废液多；上述一些工艺的蚓激酶的生产能力也相对较低。 直到目前为止，一些成熟的制备高纯度蚓激酶的实验技术真正转化为生产还有一定难度。所以，研究开发一种蚓激酶生产工艺方法并实现其工业生产化成为科研工作者的当务之急。 为此，我们经过反复探索，开发研制了一种能实现工业生产化蚓激酶生产工艺方法。 这种蚓激酶生产工艺方法的优点在于蚓激酶的收率较高、制备成本较低，产生需处理的废液少、生产能力大。 经相关专利和现有技术文献检索结果显示，均未见本发明的蚓激酶生产工艺方法的相关报道。
发明内容
为了克服现有的蚓激酶生产工艺存在的缺点蚓激酶的收率低、制备成本高，产生
需处理的废液多、生产能力低，本发明提供了一种能实现工业生产化蚓激酶生产工艺方法。
该种工艺方法是在将蚯蚓匀浆时加入乙醇作为助剂并通过物理沉降、超滤去除杂蛋白，然
后再上柱子层析纯化，这样减少柱子的负载量，从而提高了蚓激酶的收率、降低了其制备成
本，减少了产生需处理的废液、大大提高了生产能力。 本发明的目的在于提供一种蚓激酶生产工艺方法。
本发明的任务是通过以下方案实施的。
—种蚓激酶生产工艺方法包括以下步骤( — )鲜蚓清洗 在筐中或地面上将蚯蚓上部泥土层层除去，把蚯蚓铺成薄层，光照10 18小时，让蚯蚓排出污物，用手或工具刮掉，称重。用自来水在槽中冲洗二遍，洗去泥和粘浮物，用塑料桶装盛，贮存于冷库中备用。
(二)磨浆 用胶体磨将蚯蚓磨成浆液，蚯蚓与按(V/V)1 : 3 5的比例加入低浓度乙醇的pH5. 0 5. 3的柠檬酸钠制成匀浆。
(三)除渣 用卧式螺旋沉降离心机将料液中的粗渣去除，制得上清液，粗渣集中处理。进料量控制在100 300升/小时。料液中避免沙子进入，用完后用清水清洗。
(四)盐析 上清液中按30%饱和浓度加入硫酸铵，搅拌完全溶解后静置1小时。
(五)离心 用立式高速离心机经14000转/分的高速离心将料液中细渣去除，制得清液。进料量60 120升/小时。转鼓中的细渣用工具刮下，集中处理，转鼓用清水清洗干净。
(六)超滤 取上清液用50， 000dt膜超滤，得超滤液。
(七)柱层析分离 1上样将离心的浆液用泵送到下料桶，混合上样，调节柱底部出样口阀，使流量在40升/小时。每柱装量体积以60升计，上样量约为80 IOO升(折合鲜蚓约为20 25kg)。上样时保证每柱进料均匀，每柱液面高度保持不变。流出液p朋.O，呈酸性，检测无活力。 2洗涤上样完毕，用洗涤液洗涤，流量为50升/小时，洗量为80升/柱，洗至流出液呈淡黄色，pH7. 0 8. 0，略呈碱性。 3洗脱用洗脱液洗脱，流量约为40升/小时，洗脱液变混浊，颜色由黄变红，流出液电导率比洗脱液电导率略高时开始收集。洗脱倍数大约为1 : 2V/V。洗脱至料液变清，颜色呈淡橙色，电导率达到洗脱液电导率为止。 4后处理收集完毕，层析柱用去离子水洗涤，流量60升/小时或稍大，每柱用水
120升。然后用洗涤液平衡，备用。
(八)超滤 1清洗加入去离子水适量，开泵清洗，至流出液呈中性。 2超滤将收集液倒入贮罐内，开泵，调转速21X12rpm，调节压力不大于0. 1Mpa，浓縮至1/15，收集料液澄清，澄清完再上柱加去离子水脱盐，至浓縮液呈中性(pH = 7. 0)最后浓縮至1/(16 20)。 3清洗先用去离子水洗二遍，洗液回收套用。再用1 2N氯化钠清洗15分钟，并用1 2N氯化钠浸泡，待用(短时间)。若长时间不用，要用0. 1N NaOH冲洗、浸泡。
(九)过滤、除菌 1澄清过滤用澄清型、除菌型液净滤板过滤3遍，至滤液澄清。 2除菌将除菌设备、附件、出料管道、接料瓶经高温高压消毒。在30万级用0. 22um
微孔滤膜进行灭菌过滤。
(十)喷干 打开排风机，打开电加热器，使进口温度达到140 145t:，预热半小时，加料液，调节阀门，使出口温度控制在80 86t:。定时敲塔，收集酶粉。料液完毕后，先关电加热器，降温至40°C ，关掉风机取下收集瓶。 所述生产工艺方法中，低浓度乙醇的浓度范围为5% 30%，优先选取10% 20%。 所述生产工艺方法中，柱层析的层析柱，可以为疏水层析柱、离子层析柱，优先选取疏水层析柱。 所述生产工艺方法中，洗涤液的pH值为7. 0 8. 5，优先选取7. 0 8. O，可以为
硫酸铵_磷酸盐缓冲液、硫酸铵_三羟甲基氨基甲烷缓冲液或巴比妥_氯化钠缓冲液，优先选取硫酸铵_磷酸盐缓冲液。 所述生产工艺方法中，洗脱液pH值为为7. 0 8. 5，优先选取7. 0 8. O，可以为
硫酸铵_三羟甲基氨基甲烷缓冲液、巴比妥_氯化钠缓冲液或磷酸盐缓冲液，优先选取磷酸盐缓冲液。 本发明提供的工艺方法是在将蚯蚓匀浆时加入乙醇作为助剂通过物理沉降、超滤去除杂蛋白，然后再上柱子层析纯化，这样减少柱子的负载量，从而提高了蚓激酶的收率、降低了其制备成本，减少了产生需处理的废液、大大提高了生产能力。 本发明提供的蚓激酶生产工艺方法，其蚓激酶的生产工艺质量可控性和稳定性好。
具体实施方式
实施例1
( — )鲜蚓清洗 在筐中或地面上将蚯蚓上部泥土层层除去，把蚯蚓铺成薄层，光照10 18小时，让蚯蚓排出污物，用自来水在槽中冲洗二遍，洗去泥和粘浮物，用塑料桶装盛，贮存于冷库中备用。
( 二 )磨浆 用胶体磨将蚯蚓磨成浆液，蚯蚓与按(V/V) 1 : 4的比例加入10%乙醇的pH5. 3的拧檬酸钠制成匀桨。
(三)除渣 用沉降离心机将料液中的粗渣去除，制得上清液。[OO53](四)盐析 上清液中按30%饱和浓度加入硫酸铵，搅拌完全溶解后静置1小时。
(五)离心 用立式高速离心机经高速离心将料液中细渣去除，制得清液。
(六)超滤 取上清液用50， OOOdt膜超滤，得超滤液。(七)柱层析分离(层析柱填料疏水层析，填料为Phenyl S印harose 6FF)
将超滤液用泵送到下料桶，混合上样，上样完毕，用pH为7. 5的硫酸铵_磷酸盐缓冲液，洗至流出液呈淡黄色，略呈碱性，再用pH为7. 5磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱液变混浊，颜色由黄变红，流出液电导率比磷酸盐缓冲液电导率略高时开始收集，洗脱至料液变清，颜色呈淡橙色，电导率达到磷酸盐缓冲液电导率(不小于9000ii s/cm)为止。
(八)超滤 将收集液倒入贮罐内，开泵，调转速21X12rpm，调节压力不大于0. 1Mpa，浓縮至1/15，收集料液澄清，澄清完再上柱加去离子水脱盐，至浓縮液呈中性(pH = 7. 0)最后浓縮至1/17。 (九)过滤、除菌 用澄清型、除菌型液净滤板过滤3遍，至滤液澄清，在30万级用0. 22um微孔滤膜
进行灭菌过滤。(十)喷干 在干燥塔中，使出口温度控制在82t:干燥料液，收集酶粉。
实施例2
( — )鲜蚓清洗 在筐中或地面上将蚯蚓上部泥土层层除去，把蚯蚓铺成薄层，光照10 18小时，让蚯蚓排出污物，用自来水在槽中冲洗二遍，洗去泥和粘浮物，用塑料桶装盛，贮存于冷库中备用。
( 二 )磨浆 用胶体磨将蚯蚓磨成浆液，蚯蚓与按(V/V) 1 : 3的比例加入15X乙醇的pH5. 0的
拧檬酸钠制成匀桨。
(三)除渣 用沉降离心机将料液中的粗渣去除，制得上清液。
(四)盐析 上清液中按30%饱和浓度加入硫酸铵，搅拌完全溶解后静置1小时。 (五)离心 用立式高速离心机经高速离心将料液中细渣去除，制得清液。
(六)超滤 取上清液用50， OOOdt膜超滤，得超滤液。
6
(七)柱层析分离(层析柱填料疏水层析，填料为Phenyl S印harose 6FF)
将超滤液用泵送到下料桶，混合上样，上样完毕，用pH为7. 8的硫酸铵_磷酸盐缓 冲液，洗至流出液呈淡黄色，略呈碱性，再用pH为7. 8的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱液变混浊， 颜色由黄变红，流出液电导率比磷酸盐缓冲液电导率略高时开始收集，洗脱至料液变清，颜 色呈淡橙色，电导率达到磷酸盐缓冲液电导率(不小于9000 s/cm)为止。
(八)超滤 将收集液倒入贮罐内，开泵，调转速21X12rpm，调节压力不大于0. lMpa，浓縮至 1/15，收集料液澄清，澄清完再上柱加去离子水脱盐，至浓縮液呈中性(pH = 7. 0)最后浓縮 至1/18。(九)过滤、除菌 用澄清型、除菌型液净滤板过滤3遍，至滤液澄清，在30万级用0. 22um微孔滤膜
进行灭菌过滤。(十)喷干 在干燥塔中，使出口温度控制在85t:干燥料液，收集酶粉。
实施例3
( — )鲜蚓清洗 在筐中或地面上将蚯蚓上部泥土层层除去，把蚯蚓铺成薄层，光照10 18小时， 让蚯蚓排出污物，用自来水在槽中冲洗二遍，洗去泥和粘浮物，用塑料桶装盛，贮存于冷库 中备用。 (二)磨浆 用胶体磨将蚯蚓磨成浆液，蚯蚓与按(V/V) 1 : 4的比例加入20%乙醇的pH5. 2的
拧檬酸钠制成匀桨。
(三)除渣 用沉降离心机将料液中的粗渣去除，制得上清液。
(四)盐析 料液中按30%饱和浓度加入硫酸铵，搅拌完全溶解后静置1小时。
(五)离心 用立式高速离心机经高速离心将料液中细渣去除，制得清液。
(六)超滤 取上清液用50， 000dt膜超滤，得超滤液。(七)柱层析分离(层析柱填料疏水层析，填料为Phenyl S印harose 6FF)
将超滤液用泵送到下料桶，混合上样，上样完毕，用pH为8. 0的硫酸铵_磷酸盐缓 冲液，洗至流出液呈淡黄色，略呈碱性，再用pH为8. 0的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱液变混浊， 颜色由黄变红，流出液电导率比磷酸盐缓冲液电导率略高时开始收集，洗脱至料液变清，颜 色呈淡橙色，电导率达到磷酸盐缓冲液电导率(不小于9000 ii s/cm)为止。
(八)超滤 将收集液倒入贮罐内，开泵，调转速21X12rpm，调节压力不大于0. 1Mpa，浓縮至 1/15，收集料液澄清，澄清完再上柱加去离子水脱盐，至浓縮液呈中性(pH = 7. 0)最后浓縮 至1/16。
7[O105] (九)过滤、除菌 用澄清型、除菌型液净滤板过滤3遍，至滤液澄清，在30万级用0. 22um微孔滤膜
进行灭菌过滤。
(十)喷干 在干燥塔中，使出口温度控制在8(TC干燥料液，收集酶粉。
实施例4
( — )鲜蚓清洗 在筐中或地面上将蚯蚓上部泥土层层除去，把蚯蚓铺成薄层，光照10 18小时， 让蚯蚓排出污物，用自来水在槽中冲洗二遍，洗去泥和粘浮物，用塑料桶装盛，贮存于冷库 中备用。 (二)磨浆 用胶体磨将蚯蚓磨成浆液，蚯蚓与按(V/V) 1 : 5的比例加入20%乙醇的pH5. 0的
拧檬酸钠制成匀桨。(三)除渣 用沉降离心机将料液中的粗渣去除，制得上清液。
(四)盐禾斤 料液中按30%饱和浓度加入硫酸铵，搅拌完全溶解后静置1小时。
(五)离心 用立式高速离心机经高速离心将料液中细渣去除，制得清液。
(六)超滤 取上清液用50， 000dt膜超滤，得超滤液。(七)柱层析分离(层析柱填料疏水层析，填料为Phenyl S印harose 6FF)
将超滤液用泵送到下料桶，混合上样，上样完毕，用pH为7. 4的硫酸铵_磷酸盐缓 冲液，洗至流出液呈淡黄色，略呈碱性，再用pH为7. 4的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱液变混浊， 颜色由黄变红，流出液电导率比磷酸盐缓冲液电导率略高时开始收集，洗脱至料液变清，颜 色呈淡橙色，电导率达到磷酸盐缓冲液电导率(不小于9000 ii s/cm)为止。
(八)超滤 将收集液倒入贮罐内，开泵，调转速21X12rpm，调节压力不大于0. 1Mpa，浓縮至 1/15，收集料液澄清，澄清完再上柱加去离子水脱盐，至浓縮液呈中性(pH = 7. 0)最后浓縮 至1/20。(九)过滤、除菌 用澄清型、除菌型液净滤板过滤3遍，至滤液澄清，在30万级用0. 22um微孔滤膜
进行灭菌过滤。
(十)喷干 在干燥塔中，使出口温度控制在86t:干燥料液，收集酶粉。
8
权利要求
一种蚓激酶生产工艺方法，其特征在于，包括以下步骤(一)鲜蚓清洗在筐中或地面上将蚯蚓上部泥土层层除去，把蚯蚓铺成薄层，光照10～18小时，让蚯蚓排出污物，用自来水在槽中冲洗二遍，洗去泥和粘浮物，用塑料桶装盛，贮存于冷库中备用；(二)磨浆用胶体磨将蚯蚓磨成浆液，蚯蚓与按(V/V)1∶3～5的比例加入低浓度乙醇的pH5.0～5.3的柠檬酸钠制成匀浆；(三)除渣用沉降离心机将料液中的粗渣去除，制得上清液；(四)盐析上清液中按30％饱和浓度加入硫酸铵，搅拌完全溶解后静置1小时；(五)离心用立式高速离心机经高速离心将料液中细渣去除，制得清液；(六)超滤取上清液用50,000dt膜超滤，得超滤液；(七)柱层析分离将超滤液用泵送到下料桶，混合上样，上样完毕，用洗涤液，洗至流出液呈淡黄色，pH7.0～8.0，略呈碱性，再用洗脱液洗脱，洗脱液变混浊，颜色由黄变红，流出液电导率比洗脱液电导率略高时开始收集，洗脱至料液变清，颜色呈淡橙色，电导率达到洗脱液电导率(不小于9000μs/cm)为止；(八)超滤将收集液倒入贮罐内，开泵，调转速21×12rpm，调节压力不大于0.1Mpa，浓缩至1/15，收集料液澄清，澄清完再上柱加去离子水脱盐，至浓缩液呈中性(pH＝7.0)最后浓缩至1/(16～20)；(九)过滤、除菌用澄清型、除菌型液净滤板过滤3遍，至滤液澄清，在30万级用0.22um微孔滤膜进行灭菌过滤；(十)喷干在干燥塔中，使出口温度控制在80～86℃干燥料液，收集酶粉。
2. 按照权利要求l所述生产工艺方法，其特征在于，低浓度乙醇的浓度范围为5% 30%，优先选取10% 20%。
3. 按照权利要求l所述生产工艺方法，其特征在于柱层析的层析柱，可以为疏水层析 柱、离子层析柱，优先选取疏水层析柱。
4. 按照权利要求1所述生产工艺方法，其特征在于洗涤液的pH值为7. 0 8. 5，优先 选取7. 0 8. O，可以为硫酸铵-磷酸盐缓冲液、硫酸铵-三羟甲基氨基甲烷缓冲液或巴比 妥_氯化钠缓冲液，优先选取硫酸铵_磷酸盐缓冲液。
5. 按照权利要求1所述生产工艺方法，其特征在于洗脱液pH值为为7. 0 8. 5，优先 选取7. 0 8. O，可以为硫酸铵-三羟甲基氨基甲烷缓冲液、巴比妥_氯化钠缓冲液或磷酸 盐缓冲液，优先选取磷酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种蚓激酶制备工艺方法，其包括磨浆、除渣、盐析、离心、超滤、柱层析分离、超滤、除菌、喷干等步骤。本发明提供的蚓激酶制备工艺方法是在将蚯蚓匀浆时加入乙醇作为助剂通过物理沉降、超滤去除杂蛋白，然后再上柱子层析纯化，这样减少柱子的负载量，从而提高了蚓激酶的收率、降低了其制备成本，减少了产生需处理的废液、大大提高了生产能力。本发明提供的蚓激酶生产工艺方法，具有生产工艺质量可控性和稳定性好等特点。
文档编号C12N9/64GK101760454SQ20091023148
公开日2010年6月30日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者张慧英, 李海珍, 董金陵, 路兵 申请人:青岛国大药业有限公司