专利名称：一种适用于仿刺参家系鉴定的微卫星标记方法
技术领域：
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，涉及一种遗传育种的分子辅助技术， 特别是一种适用于仿刺参家系鉴定的微卫星标记方法。
背景技术：
家系选择育种是新品种培育的有效方法，通过建立家系进行系统选择是遗传育种 的重要手段，已在动植物中取得广泛成功。完整、准确的系谱信息对育种进程会产生很大的 影响，不能准确确认个体间的亲缘关系，会导致育种过程中遗传进展的降低。通过亲子鉴定 正确判别亲子关系，修正错误系谱信息，对促进品种改良具有重要意义。同时，在人工放养、 放流过程中，为减少近交造成个体生活力降低，保持物种的遗传多样性，也需要弄清育种亲 体的亲缘关系。微卫星DNAOiiicrosatellite)又称简单重复序列，由于其具有分布广、多态 性高、在单个位点基因呈共显性遗传、检测方法快速稳定、所需DNA量少、易于分析等优点， 在亲子鉴定中有着明显的优势。仿刺参(Apostichopus japonicus)是食用海参中最为名 贵的一种，自然分布于我国北方、日本、朝鲜半岛及俄罗斯的远东地区。由于经济价值高， 近几年来仿刺参的人工养殖及放流增殖发展迅猛，已成为我国北方重要的海水养殖品种之 一。利用分子标记技术，建立一套适用于仿刺参的微卫星标记家系鉴定体系，对选育中保持 家系信息、确定亲缘关系、追踪家系提供有力工具，为仿刺参的育种规划奠定良好基础，是 本技术领域的科研人员力求探究的方法，但目前，这种方法的成功及其应用尚未见有报导。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一套适用于仿刺参的微卫 星标记家系鉴定方法，实现在仿刺参选育过程中保持家系信息、确定亲缘关系、追踪家系的 标记基石出。为了实现上述目的，本发明包括微卫星位点来源、引物设计、引物优化和微卫星标 记家系鉴定体系的确立四个步骤，先利用富集文库-菌落原位杂交法筛选微卫星序列，应 用微卫星检索软件R印eatR印orter 1. 5进行微卫星片段的快速分离；在微卫星重复的侧 翼序列设计引物，并进一步优化引物成为微卫星标记；然后对微卫星标记在扩增过程中的 重复性、稳定性和多态性信息含量值进行综合评价，确认其中的9个微卫星标记作为仿刺 参家系微卫星鉴定体系(表1)，用于仿刺参不同家系间的区分或进行个体间的识别和鉴 定，从而实现标记功效。具体步骤为(1)、微卫星位点来源提取仿刺参的基因组DNA，4°C冰箱保存备用，然后利用提 取的DNA，用已有的限制性内切酶法获得仿刺参基因组DNA片段，并构建富集文库，接着将 富集文库中的含有插入片段的大肠杆菌菌落原位杂交，然后放射自显影确定阳性克隆，最 后测序阳性克隆，得到含有微卫星重复的DNA序列；(2)、引物设计在微卫星重复的侧翼序列利用软件PrimerPremier 5. 0和Oligo 6. 44设计引物，引物设计条件为引物长度为19-25mer ；GC含量为40%-60% ；退火温度为45-65度；预期PCR产物长度为100-400bp ；(3)、引物优化不同引物根据不同Tm值，在温度梯度PCR仪上进行温度梯度优化， 在Tm值上下各做10度，扩增反应采用BiometraT-Gradient PCR系统，PCR程序为95°C 变性45s，退火45s，72°C延伸45s，反应进行30个循环，首次循环前95°C预变性5min，最后 一次循环结束后72°C再延伸5min，反应体系为20iU，含有1 XPCR反应缓冲液，0. 2mM的 dNTPs，1. 2mM的Mg2+，各0. 2 y M的正、反引物，1U的Taq DNA聚合酶，80ng的模板DNA，该模 板是从48个个体中任取5个个体的DNA等量混合得到，扩增得到的PCR产物用10 %的聚丙 烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，选取杂带较少、特异性产物亮度较高的PCR反应对 应的温度为该引物的最佳退火温度Ta ；(4)、微卫星标记家系鉴定体系的确立微卫星位点的多态性水平可用多态信息含 量值(Polymorphism Information Content, PIC)衡量，一般情况下，多态信息含量值能反 映出某一个遗传标记所包含的或所能够提供的遗传信息的容量，当PIC > 0. 5时，表明该遗 传标记可提供丰富的遗传信息；当0. 25 < PIC < 0. 5时，表明该遗传标记能够较为合理的 提供遗传信息；而当PIC<0. 25时，表明该遗传标记可提供的遗传信息较差，根据上述优化 获得的Ta值，选取48个个体作为群体进行多态性信息含量值的计算，PCR程序为95°C变 性45s，各引物优化的最佳退火温度Ta退火45s，72°C延伸45s，反应进行30个循环；首次 循环前95°C预变性5min ；最后一次循环结束后72°C再延伸5min，反应体系为20iil，含有 1XPCR反应缓冲液，0. 2mM的dNTPs, 1. 2mM的Mg2+,各0. 2 y M的正、反引物，1U的Taq DNA 聚合酶，20ng的模板DNA，PCR扩增产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm， 电泳完毕后经EB(浓度为0. 15ug/ml)染色，紫外观察成像并对电泳带谱利用公式PIC = 1- E Pi2进行计算，其中Pi是第i个等位基因的频率，所有位点的等位基因频率由软件 P0PGENE32计算得出，根据PIC值的计算结果，去除重复性、稳定性差，PIC小于0. 25的标 记，最终筛选得到重复性、稳定性好，PIC值大于0. 25的位点9个，作为仿刺参微卫星标记 家系鉴定体系，用于仿刺参的家系区分与个体识别。本发明与现有技术相比，其设计原理可行，标记方式简单，应用性好，特别适应于 仿刺参家系鉴定的微卫星标记。
图1为本发明方法的位点PSC2对仿刺参1#家系中的雌性(早)和雄性($ )亲 本及其5个“子代”(1-5)的扩增结果示意图，通过此微卫星位点的PCR扩增，5号个体被确 认不是这两个亲本的后代，因为其不符合亲本在此位点的孟德尔遗传分离规律，通过多个 微卫星位点的综合分析，可有效识别鉴定个体间的亲缘关系。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行详细叙述。本实施例包括下列四个步骤(1)、微卫星位点来源提取仿刺参的基因组DNA，4°C冰箱保存备用，然后利用提 取的DNA，用已有的限制性内切酶法获得仿刺参基因组DNA片段，并构建富集文库，接着将 富集文库中的含有插入片段的大肠杆菌菌落原位杂交，然后放射自显影确定阳性克隆，最
4后测序阳性克隆，得到含有微卫星重复的DNA序列；(2)、引物设计在微卫星重复的侧翼序列利用软件PrimerPremier 5. 0和Oligo 6. 44设计引物，引物设计条件为引物长度为19-25mer ；GC含量40% -60% ；退火温度 45-65度；预期PCR产物长度为100-400bp ；(3)、引物的优化不同引物根据不同Tm值，在温度梯度PCR仪上进行温度梯度优 化(在Tm值上下各做10度)，扩增反应采用Biometra T-Gradient PCR系统，PCR程序为 95°C变性45s，退火45s，72°C延伸45s，反应进行30个循环，首次循环前95°C预变性5min， 最后一次循环结束后72°C再延伸5min，反应体系为20iil，含有1XPCR反应缓冲液，0. 2mM 的dNTPs，1. 2mM的Mg2+，各0. 2 y M的正、反引物，1U的Taq DNA聚合酶，80ng的模板DNA，该 模板是从48个个体中任取5个个体的DNA等量混合得到，扩增得到的PCR产物用10 %的聚 丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，选取杂带较少、特异性产物亮度较高的PCR反应 对应的温度为该引物的最佳退火温度Ta ；(4)、仿刺参的微卫星标记家系鉴定体系的确立微卫星位点的多态性水平可用多 态信息含量值(Polymorphism InformationContent, PIC)衡量，一般情况下，多态信息含 量值能反映出某一个遗传标记所包含的或所能够提供的遗传信息的容量，当PIC > 0. 5时， 表明该遗传标记可提供丰富的遗传信息；当0. 25 < PIC < 0. 5时，表明该遗传标记能够较 为合理的提供遗传信息；而当PIC < 0. 25时，表明该遗传标记可提供的遗传信息较差，根 据上述优化获得的Ta值，选取48个个体作为群体进行多态性信息含量值的计算，PCR程序 为95°C变性45s，Ta(各引物优化的最佳退火温度)退火45s，72°C延伸45s，反应进行30 个循环；首次循环前95°C预变性5min ；最后一次循环结束后72°C再延伸5min，反应体系为 20iil，含有1XPCR反应缓冲液，0. 2mM的dNTPs, 1. 2mM的Mg2+，各0. 2 y M的正、反引物，1U 的Taq DNA聚合酶，20ng的模板DNA，PCR扩增产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电 压为5V/cm，电泳完毕后经EB(浓度为0. 15ug/ml)染色，紫外观察成像并对电泳带谱利用 公式PIC = 1-E Pi2进行计算，其中Pi是第i个等位基因的频率，所有位点的等位基因频 率由软件P0PGENE32计算得出，根据PIC值的计算结果，去除重复性、稳定性差，PIC小于 0. 25的标记，最终筛选得到重复性、稳定性好，PIC值大于0. 25的位点9个，作为仿刺参微 卫星标记家系鉴定体系，用于仿刺参的家系区分与个体识别。实施例本实施例分为提取仿刺参DNA、PCR扩增和电泳检测PCR反应条件三个步骤内容提取仿刺参DNA 选用的仿刺参家系采自山东荣成海域的某养殖场，在1#家系中 取雌性和雄性亲本，再随机选取48只健康的“子代”个体作为实验材料，仿刺参活体解剖后 取肌肉组织约 200mg，加入 500 ii 1 CTAB 裂解液EDTA :200mM ；Tris-Cl :100mM, PH = 8. 0 ； NaCl :1.4M;CTAB:2% (ff/V)；使用前加入1.5% 3 -巯基乙醇，剪碎，60°C处理，直到裂解 液澄清，加入等体积饱和酚(250iU)、氯仿/异戊醇(24 1) (250 yl)，抽提3次；取上清 液，加入等体积氯仿/异戊醇(500 u 1)抽提1次，取上清液，加入50 u 1 NaAc (3M)，缓慢摇 勻，加满冰无水乙醇，12，000转离心10分钟，将核酸沉淀于管底，70%乙醇(1000 ill)洗涤 沉淀并干燥直到乙醇全部挥发，加入100 ill的无菌水和少量RNase A，4°C直到DNA全部溶 解；PCR扩增PCR反应体系为20iU，含有40ng仿刺参基因组DNA，0. 2mmol/l的引物，200mmol/l 的 dNTPs，200mmol/l 的 Mg2+，1XPCR 反应缓冲液，1U 的 Taq DNA 聚合酶，PCR 程 序参数为95°C变性45s，Ta退火45s，72°C延伸45s，反应进行30个循环，首次循环前95°C 预变性5min ；最后一次循环结束后72°C再延伸5min，4°C保存； 电泳检测PCR反应条件PCR扩增产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为 5V/cm，每张胶上包括两个分子量标准——pUC19/HaeIII,电泳2_3小时后用溴化乙锭(浓 度0. 15mg/mL)染色，凝胶成像系统上紫外成像并对电泳谱带进行分析，利用软件Quantity One对每个个体的扩增产物进行准确的大小确定，从而进行快速准确的基因型确定，根据孟 德尔遗传定律对得到的基因型进行分析，进行家系鉴定和亲缘关系分析，以9个微卫星标 记作为仿刺参家系鉴定体系的建立，为仿刺参的家系育种奠定了良好的基础。
权利要求
一种适用于仿刺参家系鉴定的微卫星标记方法，包括微卫星位点来源、引物设计、引物优化和微卫星标记家系鉴定体系的确立四个步骤，其特征在于(1)、微卫星位点来源提取仿刺参的基因组DNA，4℃冰箱保存备用，然后利用提取的DNA，用已有的限制性内切酶法获得仿刺参基因组DNA片段，并构建富集文库，将富集文库中的含有插入片段的大肠杆菌菌落原位杂交，然后放射自显影确定阳性克隆，最后测序阳性克隆，得到含有微卫星重复的DNA序列；(2)、引物设计在微卫星重复的侧翼序列利用软件PrimerPremier 5.0和Oligo 6.44设计引物，引物设计条件为引物长度为19 25mer；GC含量为40％ 60％；退火温度为45 65度；预期PCR产物长度为100 400bp；(3)、引物优化不同引物根据不同Tm值，在温度梯度PCR仪上进行温度梯度优化，在Tm值上下各做10度，扩增反应采用BiometraT Gradient PCR系统，PCR程序为95℃变性45s，退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环，首次循环前95℃预变性5min，最后一次循环结束后72℃再延伸5min，反应体系为20μl，含有1×PCR反应缓冲液，0.2mM的dNTPs，1.2mM的Mg2+，各0.2μM的正、反引物，1U的Taq DNA聚合酶，80ng的模板DNA，该模板是从48个个体中任取5个个体的DNA等量混合得到，扩增得到的PCR产物用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳 EB染色系统进行检测，选取杂带少、特异性产物亮度高的PCR反应对应的温度为该引物的退火温度Ta；(4)、微卫星标记家系鉴定体系的确立微卫星位点的多态性水平用多态信息含量值衡量，多态信息含量值反映出遗传标记所包含的或所能够提供的遗传信息的容量，当PIC＞0.5时，表明该遗传标记提供遗传信息；当0.25＜PIC＜0.5时，表明该遗传标记能合理提供遗传信息；而当PIC＜0.25时，表明该遗传标记提供的遗传信息差，根据上述优化获得的Ta值，选取48个个体作为群体进行多态性信息含量值的计算，PCR程序为95℃变性45s，各引物优化的退火温度Ta退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；首次循环前95℃预变性5min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min，反应体系为20μl，含有1×PCR反应缓冲液，0.2mM的dNTPs，1.2mM的Mg2+，各0.2μM的正、反引物，1U的Taq DNA聚合酶，20ng的模板DNA，PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，电泳完毕后经浓度为0.15μg/ml的EB染色，紫外观察成像并对电泳带谱利用公式PIC＝1 ∑Pi2进行计算，其中Pi是第i个等位基因的频率，所有位点的等位基因频率由软件POPGENE32计算得出，根据PIC值的计算结果，去除重复性、稳定性差，PIC小于0.25的标记，筛选得到重复性、稳定性好，PIC值大于0.25的位点，作为仿刺参微卫星标记家系鉴定体系，实现仿刺参的家系区分与个体识别。
全文摘要
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，涉及一种遗传育种的分子辅助技术，特别是一种适用于仿刺参家系鉴定的微卫星标记方法，包括微卫星位点来源、引物设计、引物优化和微卫星标记家系鉴定体系确立四个步骤，先用富集文库-菌落原位杂交法筛选微卫星序列，用微卫星检索软件进行微卫星片段的快速分离；在微卫星重复的侧翼序列设计引物，优化引物成为微卫星标记；然后对微卫星标记在扩增过程中的重复性、稳定性和多态性信息含量值进行综合评价，确认其中的微卫星标记作为仿刺参家系微卫星鉴定体系，用于仿刺参不同家系的区分或个体间识别和鉴定，实现标记功效，其设计原理可行，标记方式简单，应用性好。
文档编号C12Q1/68GK101935692SQ20091023157
公开日2011年1月5日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者包振民, 吕雅萌, 彭薇, 胡景杰, 陆维, 黄晓婷 申请人:中国海洋大学