专利名称：蓝细菌血红蛋白基因及其在促进微生物及植物生长中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域。更具体的说，本发明涉及一种促进微生物和植物生长的基因以及含有该基因具有加速生长的转化体及其进一步涉及培育生长周期短的转基因油菜。
背景技术：
传统的抗生素工业以及近年来发展的基因工程菌高密度培养，都遇到发酵设备的供氧能力与生产菌株对氧的需求量之间的矛盾。氧是好气性微生物进行能量代谢的重要物质，在正常状态下,空气中的氧在培养基中的溶解度大约只有
0.25mol/m3左右，而培养液中的氧还须经过气膜、液膜、细胞团块、细胞膜等一系列传递过程最后进入细胞内到达呼吸链，此过程需要克服相当大的阻力，供氧己成为微生物工业中提高产品产量的主要限制因素之一。目前，提高供氧水平通常从设备和操作角度考虑，例如，改进发酵罐设计、通气搅拌优化配置、输入富氧或纯氧或加入化学物质增加液相中氧气的溶解度等。这些方法都着眼于提高溶氧(DO)水平或气液传质系数，虽然有一定效果,但都不同程度地受到设备、能源或操作条件的制约，同时也使发酵工业成为一个高能耗的工业。随着现代分子生物学技术的快速发展，在以溶氧为限制条件的生物反应器中，尤其是在
大规模、高密度微生物发酵和动植物细胞培养解决供氧问题领域，运用基因工程改造微生物，获得利用氧能力增加的基因工程菌株是解决上述问题的有效策略和手段。
在农业方面，尤其在我国耕地面积有限的条件下，如何利用冬置闲田，对于提高农业产量具有重要意义。油菜是我国最重要的油料作物之一，"双低"菜籽油中Q8不饱和脂肪酸含量高(60%以上)，是一种健康的食用油；低芥酸菜籽油的脂肪酸碳链长度和结构接近化石柴油，是一种适宜于生产生物柴油的植物油，已被欧美各国作为解决全球能源短缺的重要原料作物。虽与大豆、向日葵等夏季油料作物相比，油菜是越冬作物，但因油菜生长周期较长，在一定程度上与其他主要粮食作物如水稻生产周期相冲突，如果能够培育出生长周期较短的油菜品种，则能够充分地利用南方大量的冬置闲田，就会解决上述矛盾，从而会大大地提高油菜产量。
研究表明，血红蛋白都能够与氧可逆性地结合并运输，从而能够促进生物的生长与发育。透明颤菌血红蛋白(VHb)能在限氧条件下，显著促进大肠杆菌和酿酒酵母细胞生长，提高蛋白质合成能力，增加目的产物的产量；1997年，Holmberg等将透明颤菌(Vitreoscilla)的血红蛋白基因转化烟草后，能促进烟草的生长、提高烟草叶中叶绿素与尼古丁的含量等，并且花期明显提前。血红蛋白存在于动物、植物、细菌、真菌和藻类等生物体内，分析多种生物的血红蛋白氨基酸序列显示，它们拥有一个由"three-on-three"三明治式的a-螺旋组成的保守结构。这一结果说明几乎所有的血红蛋白均来自一个共同的血红蛋白袓先。
为了解决上述在工业和农业中的问题，我们克隆出蓝细菌SynechocystisspJPCC6803的血红蛋白基因，并应用分子生物学技术证明了这个血红蛋白基因具有促进微生物和植物生长的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种促进微生物和植物生长的基因SLR2097，该基因具有如SEQ.ID.No.l所示的核苷酸序列。本专利采用分子生物学方法从蓝细菌Synechocystis sp.PCC 6803的基因组DNA中克隆出了血红蛋白基因SLR2097,速度快、效率高。该基因能够促进微生物和植物生长，对培育高密度发酵菌株和生长周期短的作物有重要意义。
本发明还在于构建了原核表达载体pET-30a-SLR2097和酵母表达载体pYES2-SLR2097，分别转化大肠杆菌和酵母，获得了表达菌株，在以溶氧为限制条件和高密度微生物发酵领域有重要意义。
本发明还在于构建了植物双元表达载体pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097并转化农杆菌，将其转化拟南芥和油菜，作物生长明显加快。油菜转化株种子萌发明显加快，开花也明显提前。
实现本发明的技术如下
根据NCBI数据库中的蓝细菌血红蛋白基因的序列(8八000022.2)设计引物，用蓝细菌Synechocystis sp.PCC 6803的基因组DNA作为模板，从蓝细菌中克隆了血红蛋白基因SLR2097。
为了检测该基因对细菌生长的影响，PCR和酶切鉴定正确的SLR2097阳性重组克隆质粒用KpnI和BamHI双酶切后，回收目的片段SLR2097，并与同样双酶切回收的大肠杆菌原核表达载体pET-30a在16t:连接过夜，获得阳性重组表达质粒pET-30a-SLR2097。用热激法将构建好的pET-30a-SLR2097转化大肠杆菌E coli DH5a感受态，然后测验表达蓝细菌血红蛋白基因的大肠杆菌的生长曲线，发现该基因对大肠杆菌的生长有显著促进功能。
为了检测该基因对酵母生长的影响，用上述同样的方法构建了酵母表达载体pYES2-SLR2097。将酵母表达载体pYES2-SLR2097转化酵母PEP4感受态。然后测验表达蓝细菌血红蛋白基因的酵母的生长曲线，发现该基因对酵母的生长有显著促进功能。
为了进一步检测该基因对植物生长的影响，我们构建了植物双元表达载体pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097，并将其转化农杆菌，用floral-dip法
转化拟南芥和油菜，并调査转基因植物生长情况，结果发现，该基因对拟南芥和油菜生长有明显的促进作用，另外，转基因油菜种子表现出萌发提前，花期也有所提前。
本发明的优点
1、 从蓝细菌的基因组DNA中克隆血红蛋白基因速度快、效率高。
2、 本发明克隆的血红蛋白基因SLR2097在低氧条件下对大肠杆菌、酵母的生长有明显的促进功能，在以溶氧为限制条件的生物反应器中，尤其是在大规模、高密度微生物发酵和动植物细胞培养解决供氧问题领域有重要意义。
3、 本发明将植物双元表达载体转化模式植物拟南芥，转基因拟南芥表现出明显的生长加快，对研究该基因在植物中的生物学功能有重要意义。
4、 本发明还将植物双元表达载体转化了油菜，转基因植株种子萌发有所提前，花期也明显提前，为解决油菜生长周期与其他主要粮食作物生产周期相冲突而导致全国大量农田冬季闲置问题提供了新方法。
图l从蓝细菌Synechocystissp.PCC6803中扩增SLR2097基因。M: marker; 1-2:血红蛋白DNA片段的扩增。
图2氧气含量极度缺乏情况下，SLR2097转基因菌株与非转基因对照菌株的生长曲线。
图3氧气充足的情况下，SLR2097转基因菌株与非转基因对照菌株的生长曲线。图4 SLR2097转基因酵母和非转基因对照菌株的生长曲线。图5双元表达载体pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097转化农杆菌GV3101的鉴
定。M: marker; 1-2:血红蛋白DNA片段的扩增;+:阳性对照；-:阴性对照。
图6抗生素筛选拟南芥转基因植株。
图7转基因拟南芥与非转基因对照植株的生长比较。
图8转基因油菜与非转基因对照植株的生长比较。
图9在24h时，转基因油菜种子与非转基因对照种子的萌发率。
图IO在48h时，转基因油菜种子与非转基因对照种子的胚根生长比较。
图ll在72h时，转基因油菜种子与非转基因对照种子的胚根长度比较。
具体实施例方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
本发明实施例中涉及的由发明人保存的生物材料，均可向公众提供20年。
本发明中所使用到的微生物以及载体来源如下
1、 蓝细菌Synechocystis sp.PCC 6803由江苏大学环境学院宁德刚教授提供。
2、 pYES2由美国华盛顿州立大学的J. I. Gordon教授提供。
3、 大肠杆菌DH5a来源于江苏大学生命科学研究院。
4、 PEP4细胞的尿嘧啶缺陷型来源于江苏大学生命科学研究院。5、 载体pET-30a来源于江苏大学生命科学研究院。
6、 载体pCAMBIA1300来源于江苏大学生命科学研究院。
7、 农杆菌GV3101来源于江苏大学生命科学研究院。
8、 农杆菌LBA4404来源于江苏大学生命科学研究院。
9、 pMD18-T来源于TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。实施例一蓝细菌血红蛋白基因SLR2097的克隆
根据NCBI数据库中血红蛋白基因的序列(BA000022.2)设计了一对引物，正向引物HemoglobinF为[5'-ggtaccATGTCAACTTTGTATG-3']，反向引物HemoglobinR为[5'-ctgcag TCACTGATTAAGCACG-3']，由上海生物工程技术服务有限公司合成。用蓝细菌Synechocystis sp.PCC 6803的基因组DNA作为模板,PCR体系含l^iL的DNA模板，2pL的dNTP(终浓度为2mmol/L)， 2jiL的10xPCR缓冲液，HemoglobinF、 HemoglobinR各lML， 0.2nL的LA-Taq酶，用超纯水补足总体积20 pL。反应程序为94。C预变性5 min;94。C变性40 sec， 57。C退火40 sec， 72。C延伸40sec;40个循环；最后72'C延伸10 min。
PCR产物进行1X琼脂糖凝胶电泳(如图l所示)，切胶回收目的片段，直接与pMD-18T Simple Vector 16。C连接过夜，转化感受态细胞EcoliDH5a，经PCR和酶切鉴定确定阳性重组质粒，并由上海生物工程技术服务有限公司测序，核苷酸序列如SEQ.ID.No.l所示。
实施例二原核表达载体pET-30a-SLR2097和酵母表达载体pYES2-SLR2097的构建
以上PCR和酶切鉴定正确的阳性重组克隆质粒分别用Kpnl和BamHI双酶切后，回收目的片段SLR2097，并与同样双酶切回收的表达载体pET-30a在16。C连接过夜，并将获得的阳性重组表达质粒命名为pET-30a-SLR2097。将口￡1-3(^-SLR2097转化感受态EcoliDH5a菌株，同时转化pET-30a空载体作为对照，提取质粒，PCR和双酶切鉴定。
用Kpnl和BamHI双酶切后的表达载体pYES2与鉴定正确后回收的目的片段SLR2097在16t连接过夜，并将获得的阳性重组表达质粒pYES2-SLR2097转化酵母菌PEP4感受态细胞，PEP4是一个水解蛋白酶缺陷型菌株，含有少量相关的主要水解酶的细胞。因此，血红蛋白能够相对提高蛋白含量。同时转化pYES2空载体作为对照。生长到对数期中后期的酵母细胞分别涂布到DOBA培养基上，30'C培养2 4 d。挑取单菌落到YPD液体培养基(2。/。 bacteriological peptone,1% yeast extract)中培养12h，收集菌体用含2。/。半乳糖不含葡萄糖的YPD液体培养基诱导表达12-16h。
实施例三:蓝细菌血红蛋白基因显著促进大肠杆菌和酵母的生长为了验证该血红蛋白基因在氧含量发生变化时对生物生长的影响，我们按Sambrook的方法，将含有蓝细菌血红蛋白基因的原核表达载体pET-30a转入大肠杆菌菌株DH5a中。在密封摇动状态(氧气极度缺)和摇动状态(氧气充足)状态下控制接种量使各组合一致；除了氧气含量外，各生长条件一致，重复三次。分别绘制细菌的生长曲线。结果发现，在氧气含量极度缺乏(氧胁迫)情况下(密封摇动状态，37°C， 300r/min)， SLR2097的转基因菌株长势明显好于非转基因对照(含有无SLR2097的空载体DH5a菌株)菌株，在对数生长期，SLR2097的转基因菌株比非转基因对照菌株生长明显加快(图2所示)， 而在氧气含量充足条件下(摇动状态，37°C， 300 r/min), SLR2097的转基因菌株比非转基因对照菌株生长也稍微加快(图3所示)。在上述两种情况下，SLR2097的转基因菌株及非转基因对照菌株都以氧充足时的生长好，氧胁迫时生长弱。
我们同时将含有蓝细菌血红蛋白基因的酵母表达载体pYES2转入酵母菌株PEP4中，在密封摇动状态(氧气极度缺乏)和摇动状态(氧气充足)状态下控制接种量使各组合一致;除了氧气含量外，各生长条件一致，重复三次。分别绘制细菌的生长曲线。结果发现在两种状态下，与非转基因对照菌株相比SLR2097的转基因菌株生长较快(如图4所示)。
实施例四双元表达载体pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097的构建将质粒载体pCAMBIA1300与CaMV35S-sGFP(S65T)-nos3'用BamHI与Xbal进行双酶切。用试剂盒回收大约8 950bp与400bp的DNA片段，然后用T4DNA连接酶将二者连接。用同样的方法将SLR2097连接到载体pCAMBIA1300-CaMV35S上。
实施例五拟南芥转化及筛选
1. 植物培养
拟南芥种子在4°C暗处理48h后，播种于1/3 B5培养液浸泡过的蛭石中，23。C连续光照，光照强度为80-120 Mmolm,sec'1。在培养基上种植时，将拟南芥种子用70%酒精表面杀菌3—5min后，用10% Bleach浸泡灭菌10-15min，无菌水洗3-4次。灭菌后的种子播于1/2 MS固体培养基(含2%蔗糖，0.3%phytagel)上，23。C连续光照。
2. 农杆菌转化
取40nl转化农杆菌GV3101感受态细胞，加入1^1 (约300ng)构建好的双元表达载体pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097， 2.5KV电击转化，然后迅速加入l毫升SOC; 28°C, 200rpm摇lh后，取200^1菌液涂布于含卡那霉素和利福平的LB固体培养基平板上；于28°C倒置培养l-2d。挑选克隆鉴定阳性菌落。通过菌落PCR鉴定农杆菌，使用前面所用的引物，能扩增出SLR2097长度的片断，表明构建的双元表达载体已转入到农杆菌GV3101。 GV3101的菌落都能扩增出与载体一致的375bp的条带(如图5所示)，说明所构建的载体已转入到GV3101中。3.拟南芥真空渗透转化法
拟南芥培养至茎高3-10cm时，去其顶生花序，刺激腋生花序的生长。继续生长4-6天后，即可用于转化。将阳性农杆菌按千分之一接种于5mlLB液体培养基中(含终浓度为5(Vg/ml的利福平和终浓度为50pg/ml的卡那霉素)；28°C，200rpm振荡培养48hr;然后将菌液倒入1L LB中，继续培养至006()()为1.2-1.8 (约需48hr) 4000rpm室温离心15min，收集菌体后，重悬于lL转化液(2.2g MS; 5%sucrose; lxB5 Vitamins; 10mg/L的6-BA; SilwetL-77;用0.4MNaOH调pH至5.8)中将剪枝后4-6天的植株倒置于含转化缓冲液的玻璃瓶中，抽真空，维持0.05Mpa压力5min。取出种植盆，侧放24hr。然后将种植盆直立，按常规的方法培育植株至结实，收获成熟种子(Tl代)。
4.抗性植株的筛选及纯系的获得收取转化后拟南芥T1代种子，播在含有潮霉素(30pg/ml)的1/2MS平板上筛选抗性的幼苗(如图6所示)，转入蛭石中，收获T2代种子。再按株系播种于含潮霉素的平板，筛选具有3:1抗性分离比的株系，移栽抗性植株，收获T3代种子，把T3代种子播于含潮霉素的平板上，没有抗性分离的株系就是纯系。在相同生长条件下转基因纯系植株和对照植株生长过程中，转基因植株生长明显比对照植株生长速度快(如图7所示)。
实施例六油菜的转化及筛选
1.植物材料的准备自然条件下生长正常的甘蓝型油菜品系宁油16号，待其生长至花期。当油菜植株开始开花后2-3天对拟浸染的油菜植株进行初步筛选。理想的拟浸染油菜植株应该具有大量正在发育中花序，其花序上含有大量未开放的花蕾，和少量已经开放的油菜花朵和授粉的角果。在进行农杆菌介导的浸花法转化前需要人工去除已经授粉的角果和花序顶端已经开放的花朵，最终用于浸染的植株
应该只具有未开的花蕾。植物材料的准备必须在浸花前8-12小时内完成，在浸花过程中如遇开放的花朵，需剪去后再进行浸花实验。
2. 携带重组质粒的农杆菌的准备
在进行浸花实验前2-3天，在5mL含有相应抗生素的LB液体培养基中小量培养转化双元表达载体pCAMBIA1300-CaMV35S-SLR2097的农杆菌LBA4404, 28°C 220 rpm，然后将5ml菌液接种到500mlLB培养基中，28°C 220rpm培养两天。浸花前在菌液中加入3%的蔗糖、0.1%的Silwet L-77、 2ng/1的6-BA和8mg/1的乙酰丁香酮。
3. 浸花步骤
(1) 浸花前，检査油菜花絮是否有盛开花朵，确认符合浸花植物材料后，将油菜的整个花序部分浸泡在农杆菌混合溶液中150s左右，同时轻轻晃动花絮，使其充分蘸取菌液。浸泡过后，待花蕾上的农杆菌菌液不再滴落，菌液又未干涸的时候，及时将完成浸花的花絮套入羊皮纸袋遮阴，袋口用回形针扎紧，持续套袋生长24h，以保持花蕾具有较高的湿度，不会因阳光暴晒而致使农杆菌失去活性。
(2) 间隔48h重复步骤(1)，浸好的花絮依然套袋生长24h。
(4) 三次浸花结束后，去掉套在花絮上的羊皮纸袋，剪去新生出的侧枝花絮以及经过浸花的花絮其顶端新萌发的花蕾。
(5) 定期剪除新生的侧枝花絮及新生花蕾，正常的浇灌培养植株，因为转化缓冲液中的蔗糖会导致害虫滋生，因此还需要定期喷洒农药杀虫，直到种子
成熟时收获干种子(Tl代)。
4.抗性植株的筛选及纯系的获得
收取转化后油菜T1代种子,用含有100mg/l潮霉素的水溶液浸泡24-36h，播种到土壤中，收获T2代种子。再按株系用潮霉素水溶液浸泡种子播种到土壤，筛选具有3:1抗性分离比的株系，收获T3代种子，同样用潮霉素水溶液浸泡T3代种子播种，没有抗性分离的株系就是纯系，在相同条件下生长的转基因植株比对照植株生长速度快，并且花期也提前一周左右(如图8所示)。实施例七油菜种子的萌发试验
选取四株转基因株系(H12、 H18、 H21、 H23) T3代种子和对照植株的进行了萌发实验，具体实验步骤如下
用双层滤纸培养，先在洁净的直径为9cm的培养皿内底放滤纸一张，选取四株转基因株系(H12、 H18、 H21、 H23) T3代种子和对照植株饱满种子IOO粒摆放到滤纸上，再在种子上面盖一张滤纸，然后每皿滴加2ml水使上层滤纸湿润，倾斜时皿底无溶液。将培养皿室温条件下暗培养，间隔24h统计发芽势和发芽率，共计72h，重复三次。如果胚根出现就记作萌发，在萌发24h和48h时，转基因株系的萌发率显著高于对照植株。在24h、 48h和72h，所有转基因株系比对照植株明显提前。如图9所示，为24h时每个培养皿中种子的萌发率。48h时，转基因株系与对照植株都已经萌发，但转基因株系的胚根明显比对照植株长，如图10所示。72h时转基因植株与对照植株胚根长度有显著差异，如图11所示。SEQUENCE LISTING<110>江苏大学
<120>蓝细菌血红蛋白基因及其在促进微生物及植物生长中的应用
<130>
<160> 1
<170> Patentln version 3.3
<210> 1<211〉 375<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803<400> 1
atgtcaactt tgtatgaaaa attaggtgga accaccgctg tcgatctagc tgtggacaaa 60ttttacgagc gggtgttgca ggatgaccgc atcaaacatt ttttcgccga cgtggatatg 120gctaaacaac gggcccacca aaaagccttt ttaacctatg cctttggcgg tacggataaa 180tatgatggtc gctatatgcg ggaagcccac aaagagttgg tggaaaacca tggtttgaac 240ggtgaacact tcgacgcagt ggcggaggat ttgctggcaa ccttgaagga aatgggtgtt 300cccgaagatt taattgcaga agtggccgcc gtggccgggg ctccagccca taaacgggac 360gtgcttaatc agtga 375
1权利要求
1、一种表达载体，其含有SEQ.ID.No.1所示的蓝细菌血红蛋白基因SLR2097。
2、 根据权利要求1所述的表达载体，是pET-30a-SLR2097。
3、 根据权利要求1所述的表达载体，是酵母表达载体pYES2-SLR2097。
4、 根据权利要求1所述的表达载体，是植物双元表达载体pCAMBIAl 300-CaMV35S-SLR2097 。
5、 SEQ. ID. No.l所示的蓝细菌血红蛋白基因SLR2097在促进微生物和植物生长中的应用。
6、 根据权利要求5所说的蓝细菌血红蛋白基因SLR2097在促进微生物生长中的应用，其特征在于，是先构建含蓝细菌血红蛋白基因SLR2097的表达载体，然后将表达载体转入微生物中培养表达。
7、 根据权利要求5所说的蓝细菌血红蛋白基因SLR2097在促进植物生长中的应用，其特征在于，是先构建含蓝细菌血红蛋白基因SLR2097的表达载体，然后通过该表达载体将SLR2097导入目标植物中，获得转基因植物。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域。具体涉及一种促进微生物和植物生长的基因以及含有该基因具有加速生长的转化体及其进一步涉及培育生长周期短的转基因油菜。所说的促进微生物和植物生长的基因具有SEQ.ID.No.1所示核苷酸序列。通过构建该基因的表达载体，将其转入微生物或植物中，能有效促进微生物和植物的生长。
文档编号C12N15/63GK101671691SQ200910232918
公开日2010年3月17日 申请日期2009年10月9日 优先权日2009年10月9日
发明者孔凡明, 宁德刚, 张志燕, 朱福各, 娟 李, 政 王, 谭小力 申请人:江苏大学