植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：：植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：植物是一个非常脆弱的有机体，很容易受到周围环境的影响，其中温度是影响植物生长发育的最重要因素之一。植物遇到低温冷害会影响到其生长发育的方方面面，包括不能正常发芽、生长缓慢、育性低甚至不结实等。其中有关低温影响发芽以及低温影响育性是近年来研究的热点并已有诸多文章报道。然而，对于低温影响植物生长发育进程的研究却报道甚少。水稻(0ryzasativaL.)是我国最重要的粮食作物，年种植面积占粮食作物的近三分之一，总产占40%左右，对保障我国粮食安全具有极其重要地位。优良水稻品种的选育是确保我国粮食需求的一条重要途径，然而，由于各个地区种植环境的差异，导致了一大批优良的水稻品种不能被广泛的推广，其中低温是影响优良水稻品种向北方推广的最重要限制因素之一。因此克隆控制低温生长的基因具有重要的理论意义与实用价值。水稻控制低温生长的基因大多是数量性状，其分离和克隆非常复杂，而染色体片段置换系(CSSL)或近等基因系(NIL)是研究水稻数量性状的理想材料。目前，利用近等基因系策略，水稻中已报道一个低温影响发芽的基因，但是有关控制低温生长基因的分离和克隆还未见报道。所有CKI蛋白都具有以下类似的结构，NH2—端含有短的具有9-76个氨基酸残基的NH厂末端区，一个高度保守、具催化功能并在底物识别中有重要作用的约300AA的激酶区，和序列高度可变(13-200AA)且同源性很低的C00N-端延伸区。CKI蛋白的COON-末端区具有几方面的功能，包括决定底物识别的特异性、调节催化活力和/或决定激酶的亚细胞定位及与不同的效应因子相互作用。liu等从水稻cDNA文库中筛选克隆到OsCKIl，发现该基因在水稻根的发育以及植物激素响应两个方面起作用。
发明内容本发明的目的是提供一种植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的植物低温生长相关蛋白(OsCKIl)，来源于稻属水稻(Oryzasativa)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物低温生长相关的由序列1衍生的蛋白质。序列表中的序列1由463个氨基酸残基组成。为了使(a)中的OsCKIl便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表l标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)朋朋朋FLAG8DYKDDDDKStr印一tagII8WSHPQFEKc_myc10EQKLISEEDL上述(b)中的OsCKIl可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsCKIl的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表l所示的标签的编码序列得到。编码上述植物低温生长相关蛋白的基因(OsCKIl)也属于本发明的保护范围。所述基因可为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物低温生长相关蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码植物低温生长相关蛋白的DNA分子。序列表中的序列2由1392个核苷酸组成。所述严格条件可为在O.IXSSPE(或O.IXSSC)，O.1%SDS的溶液中，在65。C下杂交并洗膜。含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体可为将所述基因插入pGA1611质粒的多克隆位点得到的重组质粒。具体来说，所述重组表达载体可为将pGA1611质粒HindIII和Sacl位点间的小片段取代为所述基因(OsCKIl)得到的重组质粒。含有以上任一所述基因(OsCKIl)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。扩增所述基因(OsCKIl)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种培育温度不敏感转基因水稻的方法。本发明提供的培育温度不敏感转基因水稻的方法，是将所述基因导入目的水稻(如细胞或组织)中，得到温度不敏感的转基因水稻。具体来说，可以将所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到温度不敏感的转基因水稻。所述目的水稻具体可为CSSL13水稻；所述温度不敏感具体体现在株高和/或生长速度和/或抽穗期时间性状上。所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。本发明的植物低温生长相关蛋白是首次通过图位克隆的方法分离得到的，将该蛋白导入植物后，可以使植物由低温敏感变为低温不敏感，所以可以将其应用于植物遗传改良等工作，提高植物(如水稻)对低温的耐受力。如可将该基因导入不耐低温的品种中以提高其耐低温能力，从而用于长江中下游地区早稻和我国北方地区水稻育种。图1为LTG1的初步定位和精细定位；a:LTG1的初步定位；b:LTG1的精细定位；c:交换单株验证。图2为LTG1在自然环境下的表型(左Asominori;右NIL(ltgl));a:Asominori和NIL(ltgl)在南京自然条件下的生长变化曲线;b:A達inori和NIL(ltgl)在海南自然条件下的生长变化曲线；c:Asominori和NIL(ltgl)在南京自然条件下的抽穗期表型；d:Asominori和NIL(ltgl)在南京自然条件下的成熟时的表型；e:Asominori和NIL(ltgl)在海南自然条件下的抽穗期表型；f:Asominori和NIL(ltgl)在海南自然条件下的成熟时的表型。图3为LTG1在不同环境下的抽穗期；E1:南京自然环境；E2:南京人工遮光环境；E3:海南温室环境；E4:海南自然环境。图4为LTG1在人工气候室条件下的表型(左Asominori;右NIL(ltgl));a:Asominori和NIL(ltgl)在高温(28-33度)条件下的苗期表型；b:Asominori和NIL(ltgl)在低温(20-25度)条件下的苗期表型；c:Asominori和NIL(ltgl)在高温和低温条件下的抽穗期。图5为转OsCKIl基因植株的表型(左转OsCKIl基因植株；右转空载体对照植株)；a:播种后40天；b:播种后80天。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。CSSL13水稻中国农业科学院作物科学研究所；KuboT等，Developmentofaseriesofindicachromosomesegmentsubstitutionlinesinj即onicabackgro皿dofrice.RiceGenetNewsl，1999，16:104-106;网络链接为http:〃www.shigen.nig.ac.jp/rice/rgn/voll6/vl6p104.html。实施例1、OsCKIl及其编码基因的发现—、水稻控制低温生长基因的遗传分析和初步定位从一套以Asominori为遗传背景携带IR24插入片段的染色体片段置换系(该置换系共66个家系)中发现一个家系CSSL13具有低温敏感表型，该家系在第二染色体长臂上携带IR24插入片段。CSSL13与背景亲本Asominori杂交其Fl表现为Asominori表型，证实对低温敏感的表型是隐性表型。通过调查144个F2植株的分离比，我们发现有36个植株呈现出和CSSL13—样的表型(3:1比例；x2"2.68<3.84;P=0.05)，表明一对单隐性基因控制该低温敏感表型，将该基因命名为LTG1。随后利用该36个极端隐性单株进行初步定位，初步将该基因定位在第2染色体上，位于标记RM3762和RM263之间(如图la所示)。初步定位的方法如下(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于E卯endorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的E卯endorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GEN0/GRINDER仪器上粉碎样品lmin。②加入660ii1提取液(含100mMTris-Hcl(pH8.0)，20mMEDTA(pH8.0)，1.4MNaCl，0.2g/mlCTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。③加入40iU20%SDS，65t:温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。④加入100ill5MNaCl，温和混匀。⑤加入100iil10XCTAB，65。C温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。加入900ii1氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。⑦转移上清液至1.5mLE卯endorf管中，加入600yl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。@弃上清液，沉淀用70%(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。⑨加入100ii1lXTE(121克Tris溶于l升水中，用盐酸调ra值至8.O得到的溶液)溶解DNA。取2iil电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(BechmanlnstrumentInc.U.S.A)。(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/y1，作为模板进行PCR扩增；PCR反应体系(10ii1):DNA(20ng/ul)lul，上游引物(2pmol/ul)lul，下游引物(2pmol/ul)lul，10xBuffer(MgCl2free)lul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl2(25mM)0.6ul，rTaq(5u/u1)0.lul，ddH205.lul，共lOul。PCR反应程序94.(TC变性5min;94.(TC变性30s、55。C退火30s、72。C延伸lmin，共循环35次；72t:延伸7min;1(TC保存。PCR反应在MJResearchPTC-225热循环仪中进行。(3)SSR标记的PCR产物检测扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNALadder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。2、表型描述根据初步定位的结果，进一步构建了近等基因系NIL(ltgl)，该近等基因系仅携带一个初步定位区间的片段。利用该近等基因系，描述LTG1的表型如下在南京自然高温(25°C_39°C)长日照条件下，在成熟以前，NIL(ltgl)的株高只比Asominori稍矮一点，抽穗期无显著差异，成熟后NIL(ltgl)和Asominori的各种农艺性状无显著差异；在海南旱季自然低温(10-30°C)短日环境下，在成熟以前，NIL(ltgl)的株高比Asominori明显要矮并且到Asominori抽穗时株高差异达到最大，这样导致NIL(ltgl)的抽穗期比Asominori明显延迟，然而，成熟以后NIL(ltgl)和Asominori的各种农艺性状又无显著差异(见图2)。为了避免日照长短对抽穗期的影B向，随后设置了两个人工高温(25_45°C)短日环境，结果NIL(ltgl)和Asominori株高和抽穗期均无显著差异，这些结果暗示正是由于海南的自然低温才导致了NIL(ltgl)比Asominori生长速度迟缓，从而导致成熟以前株高变矮以及抽穗期延迟(见图3)。为了进一步确定NIL(ltgl)比Asominori对低温更敏感，又设置了一个高温(28-33°C)和一个低温(20-25°C)两个人工气候室环境，结果证实了以上结果，即在高温条件下，NIL(ltgl)和Asominori无明显差异，而在低温条件下，NIL(ltgl)比Asominori生长要慢导致株高变矮，抽穗期延迟(见图4)。二、水稻控制低温生长基因LTG1的精细定位根据初步定位的结果，在LTGl基因所在区域附近寻找公共图谱上的分子标记，并自行开发SSR标记。用&:3群体中的极端隐性家系验证，在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位LTG1基因。在Asominori与NIL(ltgl)杂交衍生的F2:3群体中选取2213个极端隐性单株用于LTG1基因精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据，自行开发SSR、Indel、dCAPS等分子标记，具体方法如下1、SSR标记开发<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2、InDel标记的开发根据LTG1初定位的结果，从IRGSP(http:〃rgp.dna.affrc.go.jp/IRGSP/index.html)下载界定区域已测序克隆的粳稻品种日本晴序列，利用powerblast软件将下载的日本晴序列与已公布的籼稻品种9311相应的序列进行同源比较，寻找重复次数有差异的或插入缺失4bp以上的序列，然后按10kb左右的距离，利用Primer5.0软件设计扩增长度在200bp左右的引物进行合成。3、dCAPS标记开发dCAPS标记的开发与分析对已确定的SNP位点，利用dCAPSFinder2.0在线程序(htto:〃helix.wustl.edu/dcaDs/dcaos.html)，通过错配1到2个碱基设计5'端引物，引物长度约24-30个碱基，然后沿着3'端方向，在大约150-200bp左右的位置设计3'端引物。PCR扩增产物用合适的酶酶切后在8X的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分析。总共设计了8对有多态SSR、Indel和dCAPs标记(表2)dCAPS标记分析的PCR反应体系DNA(20ng/ul)2ul，Primerl(10pmol/ul)2ul，Primer2(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl2free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl2(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH204lOul，总体积20ul。扩增反应在PTC-200(MJResearchInc.)PCR仪上进行94。C3min;94。C30sec，55°C(引物不同，有所调整)45sec，72"C2.5min，35个循环;72。C5min。PCR产物纯化回收，按试剂盒(北京Tiangen公司)步骤进行。PCR产物酶切消化过夜后，用8%的非变性PAGE胶分离，银染。根据F2:3群体中极端隐性家系的分子数据和表型数据，将LTG1定位于标记dCAPSl和indl4之间约25.4kb，结果如图1所示。图1中，a为初步定位的结果，b为精细定位结果，横线下方数字表示各个标记与LTG1基因位点间的交换家系数，c为重组家系的表型和基因型。三、植物控制低温生长相关蛋白(OsCKIl)及其编码基因的获得根据定位的位点设计引物primerl和primer2。primerl:5'-GTggatccATGGAGCATGTGATCGGG-3，(下划线所示的序列为BamHI酶识别位点)；primer2:5'-TTgagctcTTATTTCCTTCTGTCAGCACT_3，(下划线所示的序列为Sacl酶识别位点)。以primerl和primer2为引物，以Asominori(购自中国农业科学院种质资源库；购买得到，原始来源不清)的cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。扩增反应在PTC-200(MJResearchInc.)PCR仪上进行94。C3min;94。C30sec，58°C30sec，72。C1.5min，35个循环；72。C7min。将PCR产物回收纯化。用限制性内切酶BamHI和Sacl酶切PCR产物，然后连接入pMD18_T(购自大连宝生物有限公司)，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(购自北京Tiangen公司)，挑选阳性克隆后，提质粒进行测序。序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有序列表中序列2所示的核苷酸序列，编码463个氨基酸残基组成的蛋白质(见序列表的序列1)。将序列l所示的蛋白命名为OsCKIl，将序列1所示的蛋白的编码基因命名OsCKIl，将含有OsCKIl的pMD18-T命名为pMD18-0sCKI1。实施例2、转基因植物的获得和鉴定—、重组表达载体构建将实施例1的步骤三构建的pMD18-0sCKI1用HindIII和Sacl双酶切，回收含OsCKIl基因的片段，连接到经HindIII和Sacl双酶切处理的pGA1611载体(uniprotNo:245199，网络链接为http:〃www.uniprot.org/taxonomy/245199;GENBANKACCESSIONN0.AY373338.1)上，得到重组表达载体。将重组表达载体转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。提取质粒进行酶切和测序检测，检测结果表明，获得了含有0sCKIl基因的重组质粒，将其命名为pGA1611-0sCKIl(骨架载体为pGA1611，在HindIII和Sacl位点间插入了序列2所示的OsCKIl基因)。二、重组农杆菌的获得用电击法将pGA1611-0sCKI1转化农杆菌EHA105菌株(购自美国INVITROGEN公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。PCR鉴定用引物primer3:5'-ATGGAGCATGTGATCGGG-3';primer45，-TTATTTCCTTCTGTCAGCACT3，；扩增产物为1.4kb左右即为鉴定阳性。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pGA1611-0sCKI1。三、转基因植物的获得(1)28t:培养EH-pGA1611-0sCKI116小时，收集菌体，并稀释到含有100iimol/L卡那霉素的N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为0D6。。"0.5，获得菌液；(2)将培养至一个月的CSSL13水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24"C共培养3天；(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有150mg/L潮霉素(Sigma公司)的N6固体筛选培养基上进行第一次筛选(16天)；(4)挑取健康愈伤转入含有200mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上进行第二次筛选，每15天继代一次；(5)挑取抗性愈伤转入含有150mg/L潮霉素的分化培养基上分化。得到分化成苗的T。代阳性植株。用电击法将pGA1611转化农杆菌EHA105菌株，得到对照菌株，用对照菌株转化CSSL13水稻，得到转空载体对照植株，方法同上。四、转基因植株的鉴定1、PCR分子鉴定将步骤三获得的T。代阳性植株的种子在海南种植。在苗2叶1心期提取总DNA，以primer3和primer4为引物对进行PCR扩增(primer3:5'-ATGGAGCATGTGATCGGG-3';primer4:5，-TTATTTCCTTCTGTCAGCACT-3，)。PCR反应体系模板DNA(20ng/ul)2ul，Primer3(10pmol/ul)2ul，Primer4(10pmol/ul)2ul，10XBuffer(MgCl2free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl2(25mM)l.2ul，rTaq酶(5u/ul)0.4ul，ddH20410ul，总体积20ul。扩增反应在PTC-200(MJResearchInc.)PCR仪上进行94。C3min;94。C30sec，55°C45sec，72。Clmin，35个循环;72。C5min。用试剂盒(北京Tiangen公司)纯化回收PCR产物。PCR产物用1%的琼脂糖胶分离，结果表明获得15个PCR检测阳性的转OsCKIl基因植株株系。2、低温环境中的表型鉴定12月5日，将T。代转0sCKIl基因植株的种子、Asominori种子、CSSL13水稻种子和T。代转空载体对照植株的种子在海南种植(每个株系50棵)(整个生长期的温度为10-30°C)，整个生长期中观察表型，自播种起，第40天和第85天拍照。播种后40天和85天的株高及从播种至抽穗所需的时间的统计结果见表3。其中一个转OsCKIl基因植株和转空载体对照植株的的表型见图5。表3播种后40天和80天的株高及从播种至抽穗所需的时间(50棵的平均值)转OsCKIl基因植株AsominoriCSSL13转空载体对照播种后40天株高35.12cm34.23cm27.12cm26.81cm播种后85天株高82.3cm81.5cm64.4cm63.3cm从种植种子至抽穗的时间82.5天81.8天98.7天99.2天3、高温环境中的表型鉴定播种期，将T。代转0sCKI1基因植株的种子、Asominori种子、CSSL13水稻种子和T。代转空载体对照植株的种子在南京种植(每个株系50棵)(整个生长期的温度为25-39°C)，整个生长期中观察表型。播种后40天和90天的株高及从播种至抽穗所需的时间的统计结果见表4。表4播种后40天和90天的株高及从播种至抽穗所需的时间(50棵的平均值)转OsCKIl基因植株AsominoriCSSL13转空载体对照播种后40天株高36.93cm36.15cm36.59cm37.18cm播种后95天株高79.10cm78.15cm79.13cm79.34cm从种植种子至抽穗的时间89.3天91.2天89.5天90.6天结果表明，所有转OsCKIl基因植株的表型均为低温不敏感，与Asominori的表型相同；CSSL13水稻和T。代转空载体对照植株的表型均为低温敏感。结果表明，转基因前的<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求一种蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物低温生长相关的由序列1衍生的蛋白质。2.编码权利要求l所述蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下l)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物低温生长相关蛋白的DNA分子；3)与l)或2)限定的DNA序列具有90X以上同源性且编码植物低温生长相关蛋白的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是将权利要求2或3所述基因插入pGA1611质粒的多克隆位点得到的重组质粒。6.扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。7.—种培育温度不敏感转基因水稻的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的水稻中，得到与所述目的植物相比温度不敏感的转基因水稻。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的水稻中。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述目的水稻为CSSL13水稻；所述温度不敏感体现在株高和/或生长速度和/或抽穗期时间性状上。10.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4或5所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或权利要求7至9中任一所述方法在水稻育种中的应全文摘要本发明公开了一种植物低温生长相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物低温生长相关的由序列1衍生的蛋白质。将该蛋白导入植物后，可以使植物由低温敏感变为低温不敏感，所以可以将其应用于植物遗传改良等工作，提高植物(如水稻)对低温的耐受力。如可将该基因导入不耐低温的品种中以提高其耐低温能力，从而用于长江中下游地区早稻和我国北方地区水稻育种。文档编号C12N15/82GK101701038SQ20091023696公开日2010年5月5日申请日期2009年10月29日优先权日2009年10月29日发明者万建民,吴伟勋,张欣,王久林,程志军,苏宁,郭秀萍,陆广文,雷财林申请人:中国农业科学院作物科学研究所