专利名称：水稻黑条矮缩病毒冰冻毒源的活化方法
技术领域：
本发明属于生物学领域，特别是涉及一种水稻病毒冰冻毒源的活化方法。
背景技术：
水稻黑条矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)可侵染水稻、玉 米和小麦，引起水稻黑条矮縮病和玉米粗縮病。自1996年以来，在江苏、浙江、福建、江西等 稻区，水稻黑条矮縮病在沉寂多年后再度爆发流行，流行地区约60%的稻田发病，一般田块 株发病率10 30% ，严重田块可高达40 80%以上。2004年，在浙江省中南部杂交稻种植 区发病面积80万亩，仅台州市发病面积就达48万亩，占水稻播种面积的33%，损失产量2 万余吨。2006 2007年在江苏桐城、盐城、泰州等地区的华粳6号、淮稻5号、11优084等 水稻品种上，病株率一般在20-30% ，严重的在80%左右，有的重病田病株率甚至高达90% 以上。2007年仅江苏省发病面积就达30. 8万亩，200S年更猛增至390. 7万亩，今年有报道 湖南61个县市区发现水稻黑条矮縮病，该病已成为威胁我国水稻生产的重要病毒病。
玉米粗縮病则是一种世界性的玉米病毒病害，自1954年在我国新疆南部和甘肃 西部首次发现以来，曾于上世纪90年代在我国玉米主产区严重流行，据不完全统计，1996 年全国发病面积250万公顷；1997年全国发病面积也达233万公顷以上；一般田块产量损 失40% 50% ，发病较重的田块产量损失在80%以上，严重田块几乎毁种绝收。在沉寂几 年之后，近年又再度在我国山东、河南、河北、江苏等地大爆发，并呈现逐年上升趋势，2005 年在山东省发生247万亩，2006年297万亩，2007年340万亩，2008年高达1200万亩，部分 田块毁种。2008年江苏省发病面积也达到了到236. 89万亩，目前玉米粗縮病已成为玉米生 产上最为严重的病毒病害。 在自然情况下，这两种病害均由灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)以持 久性方式特异性的传播，病毒不经卵传递给下一代。带毒灰飞虱剌吸寄主植物时经口针传 播病毒， 一般雌虫传毒效率较雄虫高。除灰飞虱外，白脊飞虱(Unkanodes s即porona)、白带 飞虱(U. albifascia)也可以传播RBSDV。由于灰飞虱传毒的瞬时性和持久性，病毒病防治 药剂缺乏，防虫治病非常困难，农药的使用也存在许多弊病，因此最为经济有效的途径是利 用品种自身的抗性达到主动防治病毒病害目的。灰飞虱传毒是品种抗病性评价、病毒致病 性、病毒传播机制等研究的基础，由于RBSDV不能通过人工摩擦、土壤、种子等传播，仅依靠 昆虫介体传播，使得植株的抗病性鉴定、致病性和传毒机制等研究难度很大。另外把病毒保 存在活的水稻植株上，但传代过程中，病毒(RNA病毒)分离物发生变异的几率很高，对于大 量分离物的保存也要耗费大量的人力财力。因此可靠的人工接种技术对保证RBSDV病原、 抗病性鉴定、介体传毒机制等工作的连续性、重复性及准确性显得尤为重要。
发明内容
基于上述研究领域中的空白，本发明提供了水稻黑条矮縮病毒冰冻毒源的活化方 法，为植物抗病性鉴定、致病力、传毒机制研究等提供接种手段。
水稻黑条矮縮病毒冰冻毒源的活化方法，包括如下步骤1)采集被水稻黑条矮縮 病毒(RBSDV)侵染的植株新鲜叶片，于-20 -7(TC冰冻保存，2)将冰冻过的叶片充分吸 水，喂饲传播水稻黑条矮縮病毒的介体昆虫，3)将喂饲过的介体昆虫饲养在其喜食的寄主 植株上，以便渡过循回期，4)用渡过循回期的介体昆虫接种到易感染水稻黑条矮縮病毒的 健康植株上，使健康植株被水稻黑条矮縮病毒侵染。
所述步骤1的冰冻温度为_70°C 。
所述植株为水稻、玉米或小麦。 所述介体昆虫为灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)、白脊飞虱 (Unkanodes s即porona)或白带飞風(U. albifascia)。 所述植株为水稻或玉米，所述介体昆虫为灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)。 所述步骤2的介体昆虫在喂饲前于黑暗饥饿3-5小时。
所述步骤2的介体昆虫被喂饲48小时。
所述健康植株为1. 5-2叶期的健康植株。 水稻黑条矮縮病毒是由昆虫来传播的，本发明将侵染水稻黑条矮縮病毒的新鲜叶
片冰冻保存后，然后将其喂饲传播该病毒的昆虫，使昆虫带上该水稻黑条矮縮病毒，再将带
有水稻黑条矮縮病毒的昆虫接种到健康植株上，通过传播昆虫将水稻黑条矮縮病毒带给植
株，使植株被水稻黑条矮縮病毒侵染，该方法使水稻黑条矮縮病毒可以长期冰冻保存，在需
要使用时，利用本发明的方法使其活化即可，既不发生变异，同时又可以按需接种，非常简
单易行。冰冻温度为-20 _70°C，叶片的保存温度越低，越有利于病毒的存活，但叶片易
碎，解冻后不利于灰飞虱吸食，因此选用冰冻温度为-20 _70°C ，优选_70°C 。 易侵染水稻黑条矮縮病毒的植株为水稻、玉米和小麦，传播水稻黑条矮縮病毒的
昆虫为灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)、白脊飞虱(Unkanodes sapporona)禾口白
带飞虱(U. albifascia)，可任意配对选用。 实验证明，经喂食冰冻带水稻黑条矮縮病毒的叶片的灰飞虱也带有水稻黑条矮縮
病毒，足于说明活化成功。该带有水稻黑条矮縮病毒的灰飞虱接种到健康植株上，又把水稻
黑条矮縮病毒传播给了健康植株，足于证明活化成功，可应用与抗病性鉴定等。 本发明把带有水稻黑条矮縮病毒的叶片冰冻后再喂食灰飞虱，使其带毒后由灰飞
虱传给健康植株，使植物病毒冰冻毒源活化，为昆虫传播植物病毒提供了一种新的策略。本发明由转基因重大专项(2009ZX08001-013B) 、"863"计划(2007AA10Z415)和
"i^一五"支撑计划(2006BAD08A06-05)资助，特此致谢！ 说明书附图
图1灰飞虱饲食冰冻RBSDV毒源，
图2单苗接种， 图3饲食16天灰飞虱带毒率的RT-PCR检测， 其中l.DL2000，2.无毒灰飞虱，3.饲食新鲜毒源的灰飞虱，4_9.饲食病毒毒源的 灰飞虱， 图4通过22天循回期灰飞虱带毒率的RT-PCR检测， 其中1.DL200Q，2.无毒灰飞虱，3.饲食新鲜毒源的灰飞虱，4_9.饲食病毒毒源的
图5接种植株的RT-PCR检测 其中1. DL2000，2.健康水稻，3.田间水稻标样，4_7.接种的水稻植株，8_12接种的 玉米植株 图6灰飞虱传播病毒在玉米植株上症状 A.左边为发病植株(矮縮)，右边为健康植株，B.发病植株的症状(蜡质隆起)。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中所用方法如无特殊说明均为常规方法。
1.实验选用的材料 1. 1供试毒源和品种毒源为2008年采自江苏南京的水稻黑条矮縮病毒水稻标 样，经RT-PCR检测为阳性，保存于-7(TC备用。水稻品种为武育粳3号，玉米品种为自交系 Mol7。 1. 2传毒介体灰飞虱由江苏省农业科学院植物保护研究所提供的无毒灰飞虱， 本实验室长期饲养在武育粳3号上，26°C 、 14h/d光照的环境箱中。 1. 3主要试剂RNA提取试剂(RNAiso Plus) 。 Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、 RNase、 DL2000 D應arker购自TaKaRa公司。M-MLV Reverse Transcriptase为Progenia公司产 品。琼脂糖(Agarose)为西班牙进口产品。其他常规化学试剂购自北京试剂公司。
2试验方法
2. 1毒源和介体灰飞虱的准备 将-7(TC保存的RBSDV水稻标样叶片剪成3-4cm左右小段，用湿润的纱布保湿4h， 使病叶充分吸水。同时将1-2龄灰飞虱若虫黑暗饥饿3小时。
2. 2灰飞虱饲食病毒 将准备好的冰冻毒源和经饥饿的无毒灰飞虱放置于500mL三角瓶中，三角瓶的底 部垫有湿润的纱布，按照每段病叶约10头放置灰飞虱小若虫，瓶口罩纱布(图1)。以不取 食任何事物和取食新鲜无毒水稻叶片的灰飞虱作阴性对照，以取食新鲜病叶的灰飞虱作阳 性对照，试验设置3次重复。 22t:黑暗条件下饲食48h后，取食冰冻毒源的灰飞虱死亡率平均为35.7% (46/129)为，阴性对照的死亡率为13.8% (4/29)，阳性对照的死亡率为15.8% (6/38)，说 明灰飞虱取食了 ，相同条件下，未饲食如何食物的灰飞虱全部死亡。这说明灰飞虱取食了冰 冻毒源叶片。 饲毒48h后，将灰飞虱饲养在健康的水稻苗上(26°C、14h/d光照)，以便度过循回期。 2. 3灰飞虱传播病毒 按照每株健康水稻或玉米苗5-7头灰飞虱，将经过20-22天循回期的灰飞虱接种 到1.5叶期的健康水稻(武育粳3好)和玉米(Mol7)(图2)上，48小时后，取出灰飞虱用 于检测带毒率，将苗置于26°C 、 14h光照条件下，观察发病情况。
2. 4灰飞虱带毒率的检测
5
取饲毒后10天、16天和经过循回期灰飞虱，单头置于1.5mL离心管中，用RNAiso 提取总RNA(参照试剂说明)，每头灰飞虱的总RNA溶于20ul的DEPC处理过的水中。仍以饲 毒时的阳性和阴性对照分别作为阳性和阴性对照。以RBSDV特异物Fl和Rl ， Fl :5' -AGA GCT CTT CTAGTT ATT GCG-3'，R1 :5'-TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3'，预期目的片段大小为 510bp (参照吴淑华等，2000农业生物技术学报8 (4) :369-372)，进行反转录PCR(RT-PCR) 扩增。体系和程序如下。 (l)cDNA的合成取灭菌离心管加入DEPC H20 8ul，引物Fl lul，灰飞虱总RNA 5ul，混匀，95。C变性2min，置于冰上2min后，再加入5*MMLV Buffer 4ul， dNTP lul， RNA Nase(HPRI)O. 5ul， M-MLV lul， 37。C孵育60min， 70°C 10min，置于冰上待用。
(2)PCR扩增:PCR :取O. 2或0. 5ml离心管，加入ddH20 17. lul， 10*buffer 2. 5ul， dNTPO. 8ul，引物Fl和Rl各0. 3ul， cDNA 3. 5ul， ExTaq聚合酶0. 5ul，总体积为25ul，混匀 后，置于Eppendorf PCR扩增仪中进行扩增，扩增程序为94。C 2min，94。C 30s，52。C 30s， 72°C lmin，经35个循环后，72t:延长10min。扩增片段在1 %的琼脂糖电泳检测。
对饲食冰冻毒源灰飞虱检测结果表明，饲毒后10天的12头灰飞虱均未扩增到目 的条带，检出率为0% ;饲毒16天的18头灰飞虱中有6头扩增到目的条带(图3)，带毒检 出率为33. 0% ;通过22天循回期的28头灰飞虱中，其中20头扩增到目的条带(图4)，带 毒率为71.4%。取食鲜毒源的灰飞虱分别有0/5、3/5和3/5扩增到目的条带，带毒率分别 为0%、60%%和60%。尽管饲食冰冻毒源灰飞虱的带毒率与阳性对照有出入，这可能是由 于阳性对照取样较少导致的结果，但足以说明冰冻毒源活化成功。
2. 4接种植株的检测 取接种后45天的水稻和玉米叶片，采用RNAiso试剂提取总RNA后，用特异物Fl 和Rl进行RT-PCR扩增，PCR产物经1%的琼脂糖电泳检测，预期目的片断大小为510bp。
接种结果表明，接种水稻和玉米苗45天后，得到了表现矮縮症状的水稻和玉米植 株，在玉米上沿叶脉出现了蜡质隆起(图6)。 RT-PCR检测结果也表明，表现症状的水稻和 玉米苗全部检测到510bp的目的条带(图5)。稻苗发病率3/8株(37. 5% );玉米发病率 为4/8株(50. 0% )。阳性对照发病率为3/5(60% )。取食新鲜健康水稻叶片的灰飞虱经 单虫单苗接虫到10株水稻上，均未显症。 上述结果说明本发明对RBSDV冰冻毒源的活化成功。
权利要求
水稻黑条矮缩病毒冰冻毒源的活化方法，包括如下步骤包括如下步骤1)采集被水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)侵染的植株新鲜叶片，于-20～-70℃冰冻保存，2)将冰冻过的叶片充分吸水，喂饲传播水稻黑条矮缩病毒的介体昆虫，3)将喂饲过的介体昆虫饲养在其喜食的寄主植株上，以便渡过循回期，4)用渡过循回期的介体昆虫接种到易感染水稻黑条矮缩病毒的健康植株上，使健康植株被水稻黑条矮缩病毒侵染。
2. 根据权利要求1所述的活化方法，所述步骤1的冰冻温度为_70°C。
3. 根据权利要求1所述的活化方法，所述植株为水稻、玉米或小麦。
4. 根据权利要求3所述的活化方法，所述介体昆虫为灰飞虱(Laodelphax striatellusFallen)、白脊飞虱(Unkanodes sapporona)或白带飞虱(U. albifascia)。
5. 根据权利要求4所述的活化方法，所述植株为水稻或玉米，所述介体昆虫为灰飞虱 (Xaodelphax striatellus Fallen)。
6. 根据权利要求1所述的活化方法，所述步骤2的介体昆虫在喂饲前于黑暗饥饿3-5 小时。
7. 根据权利要求1所述的活化方法，所述步骤2的介体昆虫被喂饲48小时。
8. 根据权利要求1所述的活化方法，所述健康植株为1. 5-2叶期的健康植株。
全文摘要
本发明涉及“水稻黑条矮缩病毒冰冻毒源的活化方法，”属于生物技术领域。本发明把带有水稻黑条矮缩病毒的叶片冰冻保持活性再喂食介体昆虫使其带毒，再由介体昆虫将水稻黑条矮缩病毒传播给健康植株，使植物病毒冰冻毒源活化，本发明方法可以按需接种，非常简单易行，为昆虫传播植物病毒提供了一种新的策略。
文档编号C12N7/00GK101775373SQ200910241900
公开日2010年7月14日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者刘艳, 吴蓓蕾, 周广和, 李红伟, 李莉, 王锡锋, 董海波 申请人:中国农业科学院植物保护研究所