专利名称：利用固定化技术生产富含共轭亚油酸酸奶及方法
技术领域：
本发明涉及一种利用固定化技术生产富含共轭亚油酸的酸奶及方法，属于利用生
物技术来生产功能性食品领域。
背景技术：
酸奶，它是以新鲜的牛奶为原料，经过巴氏杀菌后再向牛奶中添加有益菌(发酵 剂)，经发酵后，再冷却灌装的一种牛奶制品。目前市场上酸奶制品多以凝固型、搅拌型和添 加各种果汁果酱等辅料的果味型为多。酸奶不但保留了牛奶的所有优点，而且某些方面经 加工过程还扬长避短，成为更加适合于人类的营养保健品。 共轭亚油酸是含有共轭双键的一系列十八碳二烯酸，是由必需脂肪酸亚油酸衍 生的共轭双烯的多种位置与几何异构体的总称。共轭亚油酸双键在碳链上有多种位置及 排列方式，包括8-10，9-10， 10-12和11-13等，每种位置上又存在顺顺(cis-cis)，顺反 (cis-trans)，反顺(trans-cis)和反反(trans-trans) 4种构象，因此共轭亚油酸的种类十 分丰富。其中顺_9、反-11和反_10、顺-12共轭亚油酸两种异构体被证实具有很强的生 理活性，前者是与人类和动物营养最为相关的，存在于瘤胃动物来源的食品中，被称为瘤胃 酸，具有抗癌作用，后者具有减肥的功效。 目前，科学界已经公认了共轭亚油酸的抗癌、减肥、抗糖尿病等功能，因此生产富 含共轭亚油酸的酸奶对于人类的健康具有非常重大的意义，并且有极好的商业价值。近年 越来越多研究微生物产共轭亚油酸的报道表明大部分细菌产生共轭亚油酸异构体组成较 单一，与天然食物中共轭亚油酸异构体组成相似，无毒副作用，有利于产品开发应用。乳酸 菌是其中的代表，乳酸菌具有将游离亚油酸转化为共轭亚油酸的功能特性，且无毒、无害、 易于培养。目前，国内外有关乳酸菌合成共轭亚油酸的研究尚处在菌种筛选和转化条件研 究阶段，因此获得具有较高转化亚油酸为共轭亚油酸能力的乳酸菌，并将其应用于功能性 乳制品生产中，提高(或强化)乳品中共轭亚油酸的含量，能够增强乳品的保健功效，形成 新一类的功能性乳制品。 固定化细胞技术是20世纪70年代兴起的一种生物技术。所谓固定化细胞技术是 指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持生物活性、反复使 用的方法。 固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的。它的优点如下
(1)省去了细胞的分离手续。为多细胞系统，无须辅因子再生。 [OOOS] (2)细胞生长快、数量多。 (3)可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边排 出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。 (4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定性，特别是对污染因子的抵抗力 增加。 将固定化细胞技术应用于生产富含共轭亚油酸的酸奶中，不仅有效的提高了酸奶
3中共轭亚油酸的含量，进而提高了酸奶的营养保健功能。而且固定化后的细胞作为催化剂 可以在之后的酸奶生产中重复使用，还节约了生产成本，易于应用于工业化生产，创造巨大 的社会及经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用生物技术和固定化细胞技术生产富含共轭亚油酸、 共轭亚油酸含量转化率高、共轭亚油酸异构体单一的酸奶及方法。 本发明为实现上述目的，采用的技术方案为提供一种利用固定化技术生产富含 共轭亚油酸酸奶，以鲜牛奶、糖、亚油酸为底物，通过菌种生物转化技术制备酸奶，其底物的 组分为 鲜牛奶 85-95%
糖 5-15%
亚油酸 0.055-1% 根据本发明所述利用固定化技术生产富含共轭亚油酸酸奶的制备工艺一优选技 术方案，酸奶的制备工艺为 (1)将鲜牛奶预热至50 6(TC，加糖溶解过滤，同时加入经过0. 22iim滤膜过滤 的无菌亚油酸，由均质机均质； (2)将均质后的溶液，85t:灭菌5min或95t:灭菌15s ; (3)将灭菌后的溶液，用冰水冷却至30 4(TC加入细胞固定化得到的凝珠；
(4)将上述溶液30-40。C反应10-50h ; (5)在上述溶液酸度达到80-90° T、 pH4_5停止发酵，反应结束后过滤除去凝珠， 冷却后经0-5°C、10-12h后熟制成成品。 根据本发明所述的利用固定化技术生产富含共轭亚油酸酸奶制备工艺一优选技 术方案所述接种其中包括细胞固定化法得到的凝珠、嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌。
根据本发明所述的利用固定化技术生产富含共轭亚油酸酸奶制备工艺一优选 技术方案所述接种细胞固定化法得到的凝珠、嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌比例为
i : o.i-i : 1，接种量为2%-6%。 根据本发明所述的利用固定化技术生产富含共轭亚油酸酸奶制备工艺一优选技 术方案所述细胞固定化得到的凝珠工艺方法为将在脱脂乳中培养10 40h的菌液离心
若干次，直至上清液澄清为止，取下层固相，稀释倍数为i : 0.5-1 : 4，取占鲜奶体积的
2_6%的菌液与无菌的浓度为0. 5-3%海藻酸钠溶液混合，充分搅拌混匀；将上述混合菌液 注入灭菌注射器中，选择7G-27G型号的针头，以一定的速度滴入无菌的浓度为1_5%氯化 钙溶液中，使其凝固成珠状；凝珠在氯化钙溶液中固定化O. l-2h后捞出，用无菌水冲洗，洗 去凝珠表面的氯化钙溶液；风干表面水分后待用。 根据本发明所述的利用固定化技术生产富含共轭亚油酸酸奶制备工艺一优选技
术方案所述的菌种制备方法为，将4t:保藏的可产共轭亚油酸的乳酸菌的斜面菌种，接种
至MRS斜面培养基中，于30-45t:恒温培养。传代两次，以充分恢复菌种活力。从活化斜面 上挑起一个完整的单菌落接入脱脂乳培养基，37t:静置培养24-60h，获得菌体活力较好的 菌液。
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本发明有益效果在于 1、对海藻酸钠浓度、氯化钙浓度及胶粒大小及菌种稀释比等条件的摸索，成功的得到了显著提高共轭亚油酸产量的细胞固定化方法，使得酸奶中的共轭亚油酸含量显著提高成为可能。 2、本发明在微生物转化共轭亚油酸的基础上，加之细胞固定化技术的运用，使得培养基中共轭亚油酸的含量达到30% 50%的提升。 3、共轭亚油酸转化率高目前国内生物合成共轭亚油酸的转化率在30%左右，而采用细胞固定化技术之后，共轭亚油酸转化率可以提高到50%以上。 4、安全性好，异构体单一。生物合成法相比化学合成法，反应条件温和且污染小，安全性高，可以放心的应用于食品等领域。生物合成的共轭亚油酸异构体主要以顺-9，反-11和反-10，顺-12两种异构体为主，大大提高了其生物活性，具有明显的保健功能。
5、可以重复使用固定化之后的乳酸菌细胞可以重复利用，大大的节约了成本，为全自动化生产共轭亚油酸牛奶提供了可能。
具体实施方式
实施例1 利用固定化技术生产富含共轭亚油酸的酸奶 1、将4t:保藏的可产共轭亚油酸的乳酸菌的斜面菌种，接种至MRS斜面培养基中，于4(TC恒温培养。传代两次，以充分恢复菌种活力。从活化斜面上挑起一个完整的单菌落接入脱脂乳培养基，37t:静置培养40h，获得菌体活力较好的菌液。 2、将在脱脂乳中培养40h的菌液离心若干次，直至上清液澄清为止，取下层固相，稀释倍数为l : 3，取菌液0.2mL与无菌的浓度为2.5X海藻酸钠溶液混合，充分搅拌混匀；将上述混合菌液注入灭菌注射器中，选择7G型号的针头，以一定的速度滴入无菌的浓度为2.5%氯化钙溶液中，使其凝固成珠状；凝珠在氯化钙溶液中固定化2h后捞出，用无菌水冲洗，洗去凝珠表面的氯化钙溶液；风干表面水分后待用。 3、将鲜牛奶10ml预热至6(TC，加糖0. 5g溶解过滤，同时加入经过O. 22y m滤膜过滤的无菌亚油酸0. lml，由均质机均质；
4、将均质后的溶液，85"灭菌5min ; 5、将灭菌后的溶液，用冰水冷却至30 4(TC加入细胞固定化得到的凝珠；凝珠、嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌比例为1:1
6 、将上述溶液40 °C反应24h ; 7、在上述溶液酸度达到80-90° T、pH4-5停止发酵，反应结束后过滤除去凝珠，冷却后经0-5°C 、 10-12h后熟制成成品。 8、测定酸奶中共轭亚油酸的最大积累量为523. 39 y g/mL。
实施例2 : 利用固定化技术生产富含共轭亚油酸的酸奶 1、将4t:保藏的可产共轭亚油酸的乳酸菌的斜面菌种，接种至MRS斜面培养基中，于45t:恒温培养。传代两次，以充分恢复菌种活力。从活化斜面上挑起一个完整的单菌落接入脱脂乳培养基，37t:静置培养30h，获得菌体活力较好的菌液。
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2、将在脱脂乳中培养40h的菌液离心若干次，直至上清液澄清为止，取下层固相，稀释倍数为l : 2，取菌液0.2mL与无菌的浓度为2X海藻酸钠溶液混合，充分搅拌混匀；将上述混合菌液注入灭菌注射器中，选择7G型号的针头，以一定的速度滴入无菌的浓度为3X氯化钙溶液中，使其凝固成珠状；凝珠在氯化钙溶液中固定化2h后捞出，用无菌水冲洗，洗去凝珠表面的氯化钙溶液；风干表面水分后待用。 3、将鲜牛奶10ml预热至6(TC，加糖0. 5g溶解过滤，同时加入经过O. 22y m滤膜过滤的无菌亚油酸0. lml，由均质机均质；
4、将均质后的溶液，85"灭菌5min ; 5、将灭菌后的溶液，用冰水冷却至30 4(TC加入细胞固定化得到的凝珠；凝珠、嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌比例为1:1
6 、将上述溶液40 。C反应24h ; 7、在上述溶液酸度达到80-90° T、pH4-5停止发酵，反应结束后过滤除去凝珠，冷却后经0-5°C 、 10-12h后熟制成成品。 8、测定酸奶中共轭亚油酸的最大积累量为517. 60 y g/mL。 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种利用固定化技术生产富含共轭亚油酸的酸奶，其特征在于以鲜牛奶、糖、亚油酸为底物，通过菌种生物转化技术制备的酸奶，其底物的组分为鲜牛奶85-95％糖5-15％亚油酸0.055-1％
2. —种制备利用固定化技术生产富含共轭亚油酸酸奶的方法，其特征在于酸奶的制 备工艺为，(1) 将鲜牛奶预热至50 6(TC，加糖溶解过滤，同时加入经过O. 22iim滤膜过滤的无 菌亚油酸，由均质机均质；(2) 将均质后的溶液，85t:灭菌5min或95。C灭菌15s ;(3) 将灭菌后的溶液，用冰水冷却至30 4(TC加入细胞固定化得到的凝珠；(4) 将上述溶液30-40。C反应10-50h ;(5) 在上述溶液酸度达到80-90° T、 pH4-5停止发酵，反应结束后过滤除去凝珠，冷却 后经0-5°C 、 10-12h后熟制成成品。
3. 根据权利要求2所述的利用固定化技术生产富含共轭亚油酸酸奶的制备方法，其特 征在于所述接种其中包括细胞固定化法得到的凝珠、嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌。
4. 根据权利要求2所述的利用固定化技术生产富含共轭亚油酸酸奶的制备方法， 其特征在于所述接种细胞固定化法得到的凝珠、嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌比例为i : o.i-i : 1，接种量为2%-6%。
5. 根据权利要求3、4所述的利用固定化技术生产富含共轭亚油酸酸奶的制备方法，其 特征在于所述细胞固定化得到的凝珠工艺方法为将在脱脂乳中培养10-40h的菌液离心若干次，直至上清液澄清为止，取下层固相，稀释倍数为i : 0.5-1 : 4，取取占鲜奶体积的2-6%的菌液菌液与无菌的浓度为0. 5-3%海藻酸钠溶液混合，充分搅拌混匀；将上述混合 菌液注入灭菌注射器中，选择7G-27G型号的针头，以一定的速度滴入无菌的浓度为1-5% 氯化钙溶液中，使其凝固成珠状；凝珠在氯化钙溶液中固定化O. l-2h后捞出，用无菌水冲 洗，洗去凝珠表面的氯化钙溶液；风干表面水分后待用。
6. 根据权利要求5所述的细胞固定化得到的凝珠工艺方法，其特征在于所述的菌种 制备方法为，将4t:保藏的可产共轭亚油酸的乳酸菌的斜面菌种，接种至MRS斜面培养基 中，于30-45t:恒温培养。传代两次，以充分恢复菌种活力。从活化斜面上挑起一个完整的 单菌落接入脱脂乳培养基，37t:静置培养24-60h，获得菌体活力较好的菌液。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，提供一种富含共轭亚油酸酸奶及生产方法。共轭亚油酸是由必需脂肪酸亚油酸衍生的共轭双烯的多种位置与几何异构体的总称，被证实具有很多的生理活性。固定化细胞技术是指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持生物活性、反复使用的方法。我们研究发现通过固定化细胞技术可以大幅度提高酸奶中共轭亚油酸含量，而目前市售酸奶中的共轭亚油酸的含量普遍较低，故将本发明应用于酸奶生产中，利用固定化细胞技术生产富含共轭亚油酸的酸奶，使其中的共轭亚油酸的含量大幅提高，使其生理功能更加突出。
文档编号A23C9/13GK101755911SQ20091024873
公开日2010年6月30日 申请日期2009年12月23日 优先权日2009年12月23日
发明者李鹏, 王际辉 申请人:大连工业大学