专利名称：一种适合乳酸菌16SrRNA序列测定的引物设计的制作方法
一种适合乳酸菌16S rRNA序列测定的引物设计
技术领域：
本发明属于基因工程领域，特别是涉及一种适合乳酸菌16S rRNA序列测定的引物，应用该引物扩增乳酸菌16S rRNA片段后进行测序，可完整，准确，快速的测定出16SrRNA片段的碱基组成以及排列顺序，从而精确的完成乳酸细菌的种属鉴定。
背景技术：
乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)，是一群形态代谢性能和生理学特征不完全相同的能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌。目前在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上可以划分为43个属，包括373个种及亚种，其中绝大多数是厌氧菌或兼性厌氧菌。乳酸菌主要存在于人类、动物的肠道中，在自然发酵乳制品中也蕴藏着丰富的乳酸菌。 在人类漫长的发展过程中，人们对乳酸菌的分类鉴定和利用已经有久远的历史，
并积累了丰富经验和知识，形成了至今一直沿用的传统分类鉴定方法，包括形态特征、生理
生化反应及血清学反应等，这些方法都是基于微生物表面受体的特异性，属于表型分类法。
近些年，由于分子生物学的飞速发展，从分子水平来认识乳酸菌的遗传结构、组成和分类已
成为可能，目前已经有许多新的分子标记技术用于乳酸菌的分类和鉴定。 原核生物的rRNA含有3种类型23S、 16S和5S rRNA，它们分别含有2， 900、 1， 540
和120个核苷酸。5S rRNA虽然容易分析，但是核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类
研究；而23S rRNA含有的核苷酸几乎是16S rRNA的两倍，分析十分困难。经过大量的研究
证明16SrRNA的全长约为1， 540bp，片段长度适中信息量较大且易于分析。60年代末，Woese
开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的核糖体RNA特征序
列，认为16S rRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。其主要依
据是它们为细胞所共有，其功能同源且最为古老，既含有保守序列又含有可变序列，分子
大小适合操作，它的序列变化与进化过程中，rRNA分子功能几乎保持恒定，而且其分子排列
顺序有些部位变化非常缓慢，以至保留了古老祖先的一些序列，所以这种排列序列可以检
测出种系发生上的深远关系。rRNA结构既具有保守性，又具有可变性。保守性能够反应生
物物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索；可变性则能够揭示出生物物种的特征核酸
序列，是种属鉴定的重要基础。 16S rRNA为核糖体RNA的一个亚基，而16S rRNA是编码该亚基的基因。在细菌的16S rRNA中有多个区段高度保守，根据这些保守区段人们设计出细菌的通用引物，可以用来扩增出所有细菌的16S rRNA片段，并且这些引物仅仅对细菌是特异的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16S rRNA可变区的差异可以用来区分不同的菌种。因此，16S rRNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸序列测定技术的发展，越来越多的微生物的16SrRNA序列被测定并收入国际基因数据库中。这样用16S rRNA作为目的序列进行微生物群落结构分析更为方便快捷。 在利用16S rRNA片段进行菌种初步鉴定的过程中，测序的质量就显得尤为重要，现在广为采用的是克隆方法测序和扩增产物直接测序法。克隆方法测序固然准确，但是这 样无疑增加了测序费用和工作量。扩增产物直接测序法快速，简单，但由于测序引物采用通 用扩增引物，使得测序结果往往出现较多的双峰或杂峰，这一点是采用通用扩增引物测序 无法克服的弊端。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种适合乳酸菌16S rRNA序列测序扩增引物 和测序引物，应用本发明的扩增引物扩增乳酸菌16SrRNA片段后，再应用本发明的测序引 物进行测序，可完整，准确，快速的测定出16S rRNA片段的碱基组成以及排列顺序，从而精 确的完成乳酸细菌的种属鉴定。本发明提供了一种扩增引物序列对，该序列对为SEQ ID No. 1 (AD27F)和SEQ ID No. 2(AD1495R)，其核苷酸序列信息如下
SEQ ID No. 1 (AD27F): 5' -GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，
SEQ ID No. 2(AD1495R): 5' -AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3' 本发明还提供了一种测序引物序列对，该序列对为SEQ ID No. 3(A27F)和SEQ ID No. 4(A1495R)，其核苷酸序列信息如下 SEQ ID No.3(A27F) :5， -AGCGGATCACTTCACACAGGA-3，
SEQ ID No.4(A1495R) :5， -GCAGAGTTCTCGGAGTCACGA-3， 本发明还提供了一种鉴定乳酸菌种属的方法，该方法应用扩增引物进行PCR方法
扩增乳酸菌基因组中较为保守的16S rRNA基因片段，然后应用测序引物测定16S rRNA基
因片段的序列，从而快速鉴定乳酸菌的种属。 具体地，上述鉴定乳酸菌种属的方法包括如下步骤 (1)基因组DNA的提取； 提取样品中宏基因组DNA，获得样品DNA模版；
(2) 16S rRNA基因片段的扩增用扩增引物序列为SEQ ID No. 1 (AD27F)和SEQ ID No. 2 (AD1495R)对样品DNA模 版中的16S rDNA V3区进行扩增，获得PCR产物，其中引物对的核苷酸序列如下
SEQ ID No. 1 (AD27F): 5' -GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，
SEQ ID No. 2 (AF1495R): 5' -AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3'
(3)琼脂糖凝胶电泳 对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增效果；
(4)序列测定及比对 将扩增产物纯化后，采用测序引物SEQ ID No. 3 (A27F)和SEQ IDNo. 4 (A1495R)进 行测序反应，根据序列测定结果构建系统发育树，获得准确鉴定结果(具体操作是将序列 测定结果上传到NCBI官方网站进行BLAST比对，构建系统发育树，获得准确鉴定结果)；测
5序引物序列的核苷酸序列信息如下 SEQ ID No.3(A27F) :5， -AGCGGATCACTTCACACAGGA-3，
SEQ ID No.4(A1495R) :5， -GCAGAGTTCTCGGAGTCACGA-3， 上述方法中，提取样品中宏基因组DNA采用液氮冻融-CTAB法，液氮冻融-CTAB法 的操作步骤为取1. OmL或1. 0g纯培养的乳酸菌菌液于1. 5mL离心管中，离心洗涤，加入 0. 5mL TE缓冲液，置于液氮中完全冻结，取出后放入65。C水浴中融化，需要时间约5min，反 复冻融3次，加0. lmL 10% SDS和10.0iiL 10mg/mL蛋白酶K，于37。C恒温摇床中200r/ min摇动2h，室温下10303g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中，上清液与等体积 的氯仿于10303g离心10min，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0. 1 倍体积的醋酸钠，1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶得DNA 模板，备用。 上述方法中，上清液与等体积的氯仿于10303g离心10min是为了使沉淀、水相和 有机相分层。 上述方法种，16S rRNA基因片段的扩增采用扩增引物序列SEQ IDNo. 1 (AD27F)和 SEQ ID No. 2(AD1495R)进行，扩增体系为:反应体系50 ii L :IOXPCR Buffer 5iiL，25mmo1/ L Mg2+1. 0 ii L， 2. 5mmol/LdNTPs 4 ii L， 5mmol/L上下游引物AD27F和AD1495R各2 ii L， DNA 模板lOOng左右，5U/ ii L Taq酶(Promega) 0. 5uL， dd H20补足至50 ii L ;
扩增条件为95。C变性5min ;循环30次95。C变性lmin， 58。C退火lmin， 72。C延伸 2min，然后72。C延伸10min，4。C保存。 琼脂糖凝胶电泳的操作步骤将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电 泳20-30min， EB染色，紫外拍照，检测扩增效果。 序列测定及比对的操作步骤为将扩增产物纯化后，采用测序引物SEQ ID No. 3 (A27F)和SEQ ID No. 4 (A1495R)进行测序反应，序列测定结果上传到NCBI官方网站进 行BLAST比对，构建系统发育树，获得准确鉴定结果。 上述方法中的原料物质都是能够从市场上购买得到的产品，本领域技术人员能够 想到应用同类的产品进行替换得到相同的技术效果。 本发明根据乳酸细菌的16S rRNA序列的特点，结合乳酸菌已公布的基因组信息， 设计出了一对适合乳酸细菌16S rRNA序列扩增的扩增引物和适合乳酸菌16S rRNA序列测 定的测序引物，通过本发明的这两对引物的测序方法使得16S rRNA序列分析技术成为一种 快速、准确的乳酸菌分类鉴定方法。
图1、乳酸菌宏基因组DNA电泳图:1 :XZ29301，2 :XZ14303， M :入-DNA/HindIII Markers 图2、16S rRNA区域的PCR扩增产物电泳图:1 :XZ14303，2 :XZ34303，3 :XZ40307， 4 :XZ34301，5 :XZ43303，6 :XZ29301，7 :XZ5302，8 :L. casei AS1. 2435T， M:DL2000 Markers
图3、测序峰图比较，第1 、3列为通用引物直接测序的峰图，多为双峰和杂峰，第2、 4列本发明设计的测序弓I物得出的高质量峰图。
图4、应用MEGA4软件构建的系统发育树
具体实施方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的保护范围。 实施例1 基因组DNA的提取 取1. 0mL纯培养的乳酸菌菌液于1. 5mL离心管中，离心洗涤，加入0. 5mL TE缓冲 液，置于液氮中完全冻结，取出后放入65t:水浴中融化，反复冻融3次，加0. lmL 10% SDS 和10. 0 ii L 10mg/mL蛋白酶K，于37。C恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下10303g离心 10min，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于10303g离心10min，吸 取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0. 1倍体积的醋酸钠，1倍体积的冰 异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用，图1是提取出的的DNA电泳图 谱。 2. 16S rRNA基因片段的扩增 扩增引物为 SEQ ID No. 1 (AD27F): 5' -GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，
SEQ ID No. 2(AD1495R): 5' -AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3'
扩增体系 反应体系50 ii L : 10 X PCR Buffer 5 ii L， 25,1/L Mg2+1. 0 ii L， 2. 5,1/L dNTPs 4 ii L， 5mmol/L上下游引物(AD27F和AD1495R)各2 ii L， DNA模板lOOng左右，5U/ ii L Taq 酶(Promega) 0. 5uL， dd H20补足至50 ii L。
扩增条件95。C变性5min ;循环30次95。C变性lmin，58。C退火lmin，72。C延伸2min，然后 72。C延伸10min，4。C保存。
3.琼脂糖凝胶电泳将PCR产物于1 %琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20_30min， EB染色，紫外拍 照，检测扩增效果，图2显示了扩增的电泳结果。
4.序列测定及比对 将扩增产物纯化后，采用测序引物A27F和A1495R进行测序反应，序列测定结果上
传到NCBI官方网站进行BLAST比对，构建系统发育树，获得准确鉴定结果。测序引物序列为SEQ ID No. 3 (A27F)和SEQ ID No. 4 (A1495R)，其核苷酸序列信息
如下 SEQ ID No.3(A27F) :5， -AGCGGATCACTTCACACAGGA-3，
SEQ ID No.4(A1495R) :5， -GCAGAGTTCTCGGAGTCACGA-3， 通过通用引物SEQ ID No. 5(27F')禾P SEQ ID No. 6(1495R')测序的峰图与通过 本发明的测序列引物SEQ ID No. 3(A27F)和SEQ ID No. 4(A1495R)测序的峰图的比较参见 图3，图3中，第1、3列为通用序列直接测序峰图，多为双峰和杂峰，第2、4列为本发明的测 序引物SEQID No.3和SEQ ID No. 4测序得到的峰图，采用本发明的测序引物得到的峰图质量很高。通用引物信息如下 SEQ ID No. 5(27F')(通用扩增引物) 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' SEQ ID No. 6(1495R，)(通用扩增引物) 5' -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3' 通过本发明的引物AD27F和AD1495R扩增，通过本发明的测序引物A27F和A1495R 测序获得了 7株菌株(XZ14303、 XZ34303、 XZ40307、 XZ34301、 XZ43303、 XZ29301、 XZ5302) 的16S rRNA基因片段序列，其核苷酸序列号分别为SEQ ID No. 7-13，还有一株参考菌株 (L. casei AS1. 2435T)的16S rRNA基因片段序列，其核苷酸序列号为SEQ ID No. 14
由7株乳酸菌16S rRNA序列与5株参考菌株的16S rRAN序列(参考菌株序列 在公共数据库中能获得)用DNAMANV6. 30软件绘制的系统发育树(图4)可知，从总体上 可将这12株乳酸菌分为5大群，即Lactobacillus casei AS1. 2435T， XZ14303, XZ34303 和XZ29301为第一群；XZ40307和Leuconostoc mesenteroides 6055T为第二群;XZ34301 禾口 Lactobacillus fermentum NRIC 0147T为第三群；XZ43303禾口 Enterococcus durans CK11161为第四群；XZ5302和Lactobacillushelveticus ATCC 15009T为第五群。依据形 成的系统发育树，第一类群菌株XZ14303、 XZ34303、 XZ29301为干酪乳杆菌，第二类群菌株 XZ40307为肠膜明串珠菌，第三类群菌株XZ34301为发酵乳杆菌，第四类群菌株XZ43303为 耐久肠球菌，第五类群菌株XZ5302为瑞士乳杆菌，这样通过本发明的引物及其应用引物的 测序方法鉴定了未知菌株的种属。序列表〈110〉内蒙古农业大学〈120〉一种适合乳酸菌16S rRNA序列测定的引物设计〈160>14〈170>PatentIn version 3.3〈210>1〈211>41〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1gcagagttct cggagtcacg aagagtttga tcctggctca g〈210>2〈211>41〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2agcggatcac ttcacacagg actacggcta ccttgttacg a〈210>3〈211>21〈212>DNA
80092]〈213〉人工序列
0093]〈400>3
0094]agcggatcac ttcacacagg a
0095]〈210>4
0096]〈211>21
0097]〈212>DNA
0098]〈213〉人工序列
0099]〈400>4
0100]gcagagttct cggagtcacg a
0101]〈210>5
0102]〈211>20
0103]〈212>DNA
0104]〈213〉人工序列
0105]〈400>5
0106]agagtttgat cctggctcag
0107]〈210>6
0108]〈211>20
0109]〈212>DNA
0110] 0111 ]〈213〉人工序列 〈400>6
0112]ctecggctec cttgttecga
0113]〈210>7
0114]〈211>1418
0115]〈212>DNA
0116]〈213>XZ14303
0117]〈400>7
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1权利要求
一种扩增引物序列对，其特征在于该序列对为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，其核苷酸序列信息如下SEQ ID No.15’-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’SEQ ID No.25’-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。
2. —种测序引物序列对，其特征在于该序列对为SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4，其核苷 酸序列信息如下SEQ ID No. 3 :5' -AGCGGATCACTTCACACAGGA-3， SEQ ID No. 4 :5' -GCAGAGTTCTCGGAGTCACGA-3，。
3. —种鉴定乳酸菌种属的方法，该方法应用扩增引物进行PCR方法扩增乳酸菌基因组 中较为保守的16S rRNA基因片段，然后应用测序引物测定16S rRNA基因片段的序列，从而 快速、完整、准确鉴定乳酸菌的种属，其特征在于所述扩增引物为权利要求1中的扩增引物 对，所述测序引物为权利要求2中的测序引物对。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1) 基因组DNA的提取提取样品中宏基因组DNA，获得样品DNA模版；(2) 16S rRNA基因片段的扩增用扩增引物序列为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2对样品DNA模版中的16S rDNA V3区 进行扩增，获得PCR产物；(3) 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增效果；(4) 序列测定及比对将扩增产物纯化后，采用测序引物SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4进行测序反应，根据序 列测定结果构建系统发育树，获得准确鉴定结果。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于提取样品中宏基因组DNA是采用液氮冻 融-CTAB法。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于液氮冻融-CTAB法的操作步骤为取1. OmL 或l. Og纯培养的乳酸菌菌液于l. 5mL离心管中，离心洗涤，加入0. 5mL TE缓冲液，置于液氮 中完全冻结，取出后放入65t:水浴中融化，需要时间约5min，反复冻融3次，加0. lmL 10% SDS和10. 0 ii L 10mg/mL蛋白酶K，于37。C恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下10303g离 心lOmin，收集上清液转移至另一离心管中，上清液与等体积的氯仿于10303g离心10min， 吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0. 1倍体积的醋酸钠，1倍体积的 冰异丙醇沉淀总DNA，然后70 %乙醇洗涤沉淀2次，回溶得DNA模板，备用。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于上清液与等体积的氯仿于10303g离心 10min是为了使沉淀、水相和有机相分层。
8. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于16S rRNA基因片段的扩增采用扩增引物序 列SEQ ID No. l和SEQ ID No.2进行，扩增体系为反应体系50 ii L :10XPCR Buffer 5 ii L， 25 1/L Mg2+1. Oil L，2. 5,1/L dNTPs 4 ii L， 5mmol/L上下游引物AD27F和AD1495R各2ii L，DNA模板100ng左右，5U/ii L Taq酶O. 5uL，dd !120补足至5011 L ;扩增条件为95。C变 性5min ;循环30次95。C变性lmin，58。C退火lmin，72。C延伸2min，然后72。C延伸10min，4t:保存。
9. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于琼脂糖凝胶电泳的操作步骤将PCR产物 于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min， EB染色，紫外拍照，检测扩增效果。
10. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于序列测定及比对的操作步骤为将扩增产 物纯化后，采用测序引物SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4进行测序反应，序列测定结果上传到 NCBI官方网站进行BLAST比对，构建系统发育树，获得准确鉴定结果。
全文摘要
本发明提供了一种适合乳酸菌16S rRNA序列测序扩增引物和测序引物，应用本发明的扩增引物扩增乳酸菌16S rRNA片段后，再应用本发明的测序引物进行测序，可完整，准确，快速的测定出16S rRNA片段的碱基组成以及排列顺序，从而精确的完成乳酸细菌的种属鉴定，其中扩增引物序列为SEQ ID No.1(AD27F)和SEQ ID No.2(AD1495R)，测序引物序列为SEQ ID No.3(A27F)和SEQ ID No.4(A1495R)。
文档编号C12Q1/68GK101705305SQ20091025067
公开日2010年5月12日 申请日期2009年12月14日 优先权日2009年12月14日
发明者刘文俊, 包秋华, 孙志宏, 张和平, 张家超 申请人:内蒙古农业大学 被以下专利引用 (2),