专利名称：DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组腺病毒，特别涉及一种DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病 毒，还涉及该重组腺病毒的制备方法和应用。
背景技术：
随着人民生活水平的提高以及生活方式的改变，糖尿病的发病率日益增加，已成 为继心血管疾病和肿瘤之后影响群众健康和生命的第三大疾病。胰岛移植具有简便、安全、 有效的特点，术后患者不需要依赖外源胰岛素即能纠正体内糖代谢紊乱，明显提高生活质 量，在糖尿病特别是1型糖尿病的治疗中备受瞩目。但是，由于供受体的遗传背景差异，胰 岛移植容易受到宿主的免疫排斥以致发生移植后并发症，从而影响治疗效果。而诱导特异 性T细胞耐受对胰岛移植排斥是一种很有希望的治疗策略。迄今报告的胰岛候选自身抗原已逾20种，其中谷氨酸脱羧酶65 (glutamic acid decarboxylase 65，GAD65)被认为是最重要的自身抗原，并极有可能是1型糖尿病的始动 靶抗原，在早期的1型糖尿病患者中有大量GAD65特异性T细胞存在。因此，可以利用GAD65 诱导特异性T细胞耐受以避免胰岛移植排斥。诱骗受体(decoy receptor)是指那些细胞膜 外区与功能性受体细胞外区结构相似，能结合配体，但细胞质区缺乏转导信号能力的受体。 诱骗受体通过与功能性受体竞争性结合相同的配体，从而在受体水平对细胞活性和分化以 及免疫功能发挥调控作用。诱骗受体3 (decoy receptor, DcR3)是新近发现的肿瘤坏死因 子受体超家族成员，具有调节细胞凋亡和免疫细胞活性及分化的生物学特性，在肿瘤免疫、 自身免疫、移植免疫及抗感染免疫中发挥着重要作用。转基因非肥胖型糖尿病大鼠模型实 验证明，DcR3能阻止自身免疫细胞及环磷酰胺对胰岛0细胞的自身免疫性损伤，防止糖尿 病的发生，还能明显减轻胰岛炎性反应。此外，动物移植模型实验证明，DcR3转基因胰岛细 胞移植成功率明显高于野生型胰岛细胞。基因联合治疗的方式主要有两种一是将多种分别携带不同基因的重组表达载体 同时转染靶细胞，这种方式可以自由调节各重组表达载体的比例，但需要分别构建携带不 同基因的重组表达载体，构建工作繁琐、费时，影响因素多；此外，由于转染过程具有一定随 机性，转染后的细胞存在基因拷贝不均一的问题，既不利于目的基因的表达及后续治疗，又 导致实验结果难于评估分析；上述缺点限制了此种方式的进一步应用。二是将两个或两个 以上的基因由一个载体携带表达，这种方式可以通过多启动子载体、多顺反子载体或融合 基因等调控手段提高基因转染效率，增加表达强度，并维持相对的表达比例，从而克服了前 一种方式的不足，近年来日益受到研究者的重视。树突状细胞不仅是机体内功能最强大的抗原递呈细胞，可以有效激活初始T细胞 启动免疫应答反应，而且树突状细胞本身具有调节免疫反应、诱导免疫耐受的作用。体外构 建携带免疫抑制分子基因的重组病毒并转染树突状细胞制成树突状细胞疫苗，再将其回输 体内，已广泛应用于诱导免疫耐受等方面的治疗。有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒，能够诱导特异性T细胞耐受，有效抑制胰岛β细胞的破坏，并延长移植胰岛的生存期； 目的之二在于提供所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的制备方法；目的之三在于 提供所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的应用。
发明内容
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案1、DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒，所述重组腺病毒基因组中包含一个 DcR3和GAD65双基因表达盒，所述DcR3和GAD65双基因表达盒由上游至下游依次包含CMV 启动子、DcR3全长编码基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、GAD65全长编码基因和终
止子。 2、所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤a、RT-PCR 扩增 DcR3 全长 cDNA ；b、RT-PCR 扩增 GAD65 全长 cDNA ；C、将步骤a所得DcR3全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，步骤b所得GAD65 全长cDNA插入pStar载体的IRES下游，得重组载体pStar-DcR3-IRES_GAD65 ；d、以步骤c所得重组载体pStar-DcR3-IRES-GAD65为模板，PCR扩增 DcR3-IRES-GAD65片段并更换该片段两端的酶切位点；e、将步骤d所得DcR3-IRES_GAD65片段插入腺病毒穿梭载体pShuttle_CMV的CMV 启动子下游，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65 ；f、将步骤e所得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65与腺 病毒骨架载体PAdEasy-I在大肠杆菌BJ5183中进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体 pAd-DcR3/GAD65 ；g、将重组腺病毒载体pAd-DcR3/GAD65在293细胞中包装成重组腺病毒Ad_DcR3/ GAD65。进一步，步骤a的具体方法为提取人肝组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总 cDNA为模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带 有Pst I和EcoR I酶切位点的DcR3全长cDNA，PCR循环条件参数为94°C预变性5分钟； 然后94°C变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分 钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT_DcR3 ；进一步，步骤b的具体方法为提取人胰腺组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该 总cDNA为模板，以SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分 别带有BamH I和Sal I酶切位点的GAD65全长cDNA，PCR循环条件参数为94°C预变性5 分钟 ’然后94°C变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸 10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT_GAD65 ；进一步，步骤c的具体方法为自重组载体pT_DcR3中用Pst I和EcoR I双酶 切出DcR3全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切的pStar载体连接，得重 组载体pStar-DcR3 ；再自重组载体pT_GAD65中用BamH I和Sal I双酶切出GAD65全长 cDNA，经纯化后与同样用BamH I和Sal I双酶切的重组载体pStar-DcR3连接，得重组载体 pStar-DcR3-IRES-GAD65 ；进一步，步骤d的具体方法为以重组载体pStar-DcR3-IRES-GAD65为模板，以SEQID No. 7和SEQ ID No. 8所示序列为上下游引物进行PCR，将DcR3_IRES_GAD65片段两端的 酶切位点更换为Sal I酶切位点和Not I酶切位点，PCR循环条件参数为94°C预变性5分 钟；然后94°C变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10 分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-DcR3-IRES_GAD65 ；进一 步，步骤e的具体方法为自重组载体pT-DcR3-IRES-GAD65中用Sal I和 Not I双酶切出DcR3-IRES-GAD65片段，经纯化后与同样用Sal I和Not I双酶切的腺病毒 穿梭载体pShuttle-CMV连接，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65 ；进一步，步骤f的具体方法为将重组腺病毒穿梭载体 pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65用Pme I酶切线性化，再与腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι同 时电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd-DcR3/ GAD65 ；进一步，步骤g的具体方法为将人胚胎肾293细胞以40% 60%的细胞密度接 种至培养瓶中，待细胞生长至30 % 50 %融合时，采用Lipofectamine 2000试剂将重组腺 病毒载体pAd-DcR3/GAD65转染293细胞，待细胞出现明显病变时离心收集细胞，用磷酸盐 缓冲液重悬后，反复冻融使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重组 腺病毒 Ad-DcR3/GAD65。3、所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒在制备抗胰岛移植排斥的树突状 细胞疫苗中的应用。本发明的有益效果在于本发明将胰岛特异性抗原GAD65与新型免疫抑制分子 DcR3进行联合表达，可以诱导GAD65特异性的淋巴细胞免疫耐受，使胰岛细胞能局部性 逃逸免疫系统的识别和攻击，而其他正常组织和器官不会受到影响。将本发明的DcR3和 GAD65双基因共表达重组腺病毒体外转染树突状细胞再回输糖尿病易患性NOD小鼠并同 时进行胰岛移植，结果发现，本发明的重组腺病毒能够降低糖尿病易患性NOD小鼠淋巴细 胞的增殖能力和细胞因子分泌能力，能够延迟NOD小鼠糖尿病的发病时间并降低发病率， 而且能够延长移植胰岛的生存期，表明本发明的重组腺病毒能够有效诱导特异性T细胞耐 受，有效抑制胰岛β细胞的破坏，并延长移植胰岛的生存期，可以用于制备抗胰岛移植排 斥的树突状细胞疫苗，在1型糖尿病治疗领域具有良好的开发应用前景。同时，本发明重组 腺病毒的制备方法简单，成本低。为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中
图1显示了 DcR3全长cDNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果(1泳道为DNA分子 量标准，2泳道为PCR产物)；图2显示了 GAD65全长cDNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果(1泳道为DNA分子 量标准，2泳道为PCR产物)；图3显示了 DcR3和GAD65双基因共表达的免疫印迹(Western Blot)结果(1泳 道为Ad-DcR3/GAD65病毒转染树突状细胞的总蛋白，2泳道为空病毒转染树突状细胞的总 蛋白)；图4显示了淋巴细胞增殖能力的检测结果；
图5显示了淋巴细胞分泌细胞因子能力的检测结果；图6显示了 NOD小鼠糖尿病的平均发病率；图7显示了胰岛平均生存期检测结果。以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
具体实施例方式一、重组腺病毒Ad_DcR3/GAD65的制备1、DcR3 全长 cDNA 的克隆按Trizol试剂盒说明书提取人肝组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总cDNA 为模板，以 F1 :5，-aat￡i￡^gtcgcgagcggccgcacaacttt-3，(SEQ ID No. 1，下划线部分为 Pst I 酶切位点)禾口 R1 5' -tacgaattcgtgcacagggaggaagcgctcacg-3' (SEQID No. 2，下划 线部分为EcoR I酶切位点)为上下游引物，PCR扩增DcR3全长cDNA，PCR体系为50iU，循 环条件参数为94°C预变性5分钟；然后94°C变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟， 共30个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切 胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，用含有氨 苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pT-DcR3。琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约900bp处呈单一特异性条带(图1)，与预 期结果相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列(SEQ ID No. 3)与GenBank登录 号为NM_003823的DcR3全长cDNA序列一致。2、GAD65 全长 cDNA 的克隆按Trizol试剂盒说明书提取人胰腺组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该 总 cDNA 为模板，以 F2 :5，-gatcggatcctaccgtagaggccc-3‘ (SEQ ID No. 4，下划线部分为 BamH I 酶切位点)禾口 R2 :5，-acgcgtcgacaatatttagaacaggttcc-3‘ (SEQ ID No. 5,下划线 部分为Sal I酶切位点)为上下游引物，PCR扩增GAD65全长cDNA，PCR体系为50iU，循环 条件参数为94°C预变性5分钟；然后94°C变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共 30个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶 回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，用含有氨苄 青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为PT-GAD65。琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约1800bp处呈单一特异性条带(图2)，与预 期结果相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列(SEQ ID No. 6)与GenBank登录 号为NM_000818的GAD65全长cDNA序列一致。3、重组载体 pStar-DcR3-IRES_GAD65 的构建根据DcR3和GAD65全长cDNA两端所设计的酶切位点，首先将DcR3全长cDNA插 入pStar载体的IRES上游，再将GAD65全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。具体方 法为先将pT-DcR3载体用Pst I和EcoR I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶 回收纯化后，与同样经Pst I和EcoR I双酶切的pStar载体连接，连接产物转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，Pst I和EcoR I 双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pStar-DcR3 ；再将pT-GAD65载体用BamH I和Sal I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经BamH I和Sal I双酶切 的pStar-DCR3载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，用含有氨苄青霉素 的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，BamH I和Sal I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为 pStar-DcR3-IRES-GAD65。4、重组载体 pShuttle-CMV-DcR3-IRES_GAD65 的构建以 pStar-DcR3-IRES-GAD65 载体为模板，以 F3 5‘ -acgcgtcgactcgcgagcggccg-ca caacttt-3，(SEQ ID No. 7，下划线部分为 Sal I 酶切位点)和 R3 :5，-agaatcgcggccgc-aa tatttagaacaggttcc-3，(SEQ ID No. 8，下划线部分为Not I酶切位点)为上下游引物，PCR 扩增DcR3-IRES-GAD65片段并将该片段两端的酶切位点更换为Sal I酶切位点和Not I 酶切位点，PCR体系和循环条件参数同前。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试 剂盒切胶回收纯化后，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞， 用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为 pT-DcR3-IRES-GAD65。将pT-DcR3-IRES_GAD65载体用Sal I和Not I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试 剂盒切胶回收纯化后，与同样经Sal I和Not I双酶切的pShuttle-CMV载体连接，连接产 物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒， Sal I和Not I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65。5、重组腺病毒载体pAd_DcR3/GAD65的构建将pShuttle-CMV-DcR3-IRES_GAD65 载体用 Pme I 酶切线性化，再与 pAdEasy-1 载 体同时电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞，进行胞内同源重组，用含有卡那霉素的LB平板 培养，挑取较小菌落，用含有卡那霉素的LB液体培养基培养过夜，提取质粒，Pac I酶切鉴 定，将阳性质粒命名为pAd-DcR3/GAD65。6、重组腺病毒载体pAd_DcR3/GAD65的包装将人胚胎肾293细胞以40% 60%的细胞密度接种至T_25培养瓶中，待细胞生 长至30 % 50 %融合时弃去培养液，用Lipofectamine 2000试剂将pAd_DcR3/GAD65载体 转染293细胞，通过显微镜观察细胞病理改变，待出现明显细胞病变效应时离心收集细胞， 细胞沉淀用PBS重悬后，反复冻融4次使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清 液，即得Ad-DcR3/GAD65病毒原液；将病毒原液按1 10的比例重新感染293细胞，收集含 病毒的上清液，重复上述操作3次，得第四代重组腺病毒Ad-DcR3/GAD65。二、重组腺病毒Ad-DcR3/GAD65转染树突状细胞疫苗的制备1、树突状细胞的分选取4周龄Balb/c小鼠，脱颈处死，用体积分数为75%的乙醇溶液浸泡5分钟，无 菌条件下切开皮肤及皮下组织，分离小鼠股骨和胫骨，用浓度为0. Olmol/L的无菌PBS清洗 3 5次，剪断股骨和胫骨两端，用浓度为0. 01mol/L的无菌PBS反复冲洗骨髓腔，制成单 细胞悬液，1000r/min离心5分钟去掉脂肪层，细胞用浓度为0. 01mol/L的无菌PBS重悬， 再缓慢加入等体积Percoll细胞分离液，3000r/min离心30分钟，收集单核细胞，用浓度为 0. 01mol/L的无菌PBS洗涤2次，再用含血清的DMEM培养基重悬，所得单细胞悬液接种于 T-25培养瓶内，并补充粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4 (IL-4)，置温 度为37°C、C02气体体积分数为5%和饱和湿度的培养箱内培养，隔日半量换液补充细胞因
8子，第7天收获细胞，即得树突状细胞。2、重组腺病毒Ad_DcR3/GAD65转染树突状细胞将树突状细胞以细胞浓度为1X106个/ml接种于6孔板，按感染复数(M0I)为100 加入第四代重组腺病毒Ad-DcR3/GAD65，感染后48小时收集细胞，用PBS洗涤并重悬，即得 Ad-DcR3/GAD65病毒转染树突状细胞。Western Blot检测分别超声裂解Ad_DcR3/GAD65病毒转染树突状细胞和空病毒 转染树突状细胞，收集细胞总蛋白进行SDS-PAGE，电泳完毕后电转印PVDF膜，洗膜，封闭， 加入兔抗人DcR3或GAD65多克隆抗体，37°C孵育1小时，洗膜，再加入羊抗兔IgG，37°C孵 育1小时，洗膜，显色。结果见图3，Ad-DcR3/GAD65病毒在树突状细胞中可以表达DcR3和 GAD65。三、重组腺病毒Ad_DcR3/GAD65转染树突状细胞疫苗抗胰岛移植排斥能力检测取2月龄糖尿病易患性NOD小鼠，随机分为两组实验组和对照组，实验组尾静脉 回输Ad-DcR3/GAD65病毒转染树突状细胞疫苗，连续回输3次，每周1次，每次输入1 X 106 个细胞；对照组正常饲养。1、淋巴细胞增殖能力检测末次回输后1周，断颈处死两组小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏，用100目筛网碾 磨成细胞悬液，用常规聚蔗糖-泛影葡胺分层液梯度离心法分离获得脾淋巴细胞，用含有 体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为1X106个/ml，接种至 96孔板，每孔100 iU，每组设3个复孔，每孔加入GAD65重组蛋白至终浓度为lmg/ml，置 温度为37°C、0)2气体体积分数为5%的培养箱内培养96小时，再每孔加入0. lml浓度为 1X10、Ci/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)溶液，继续培养12小时，用PBS漂洗细胞3次， 甲醛固定10分钟，再用温度4°C预冷的体积分数为5%的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入 0. 5ml浓度为0. 3mol/L的NaOH溶液，60°C水浴反应30分钟，冷却至室温，转移入闪烁瓶中， 加入5ml闪烁液，用液体闪烁计数器计数每分钟的闪烁次数(cpm)，测定DPM值(反映细胞 DNA合成速率)，重复测定3次。结果见图4，实验组小鼠淋巴细胞的cpm值为38000士3100，而对照组小鼠淋巴细 胞的cpm值为54000 士6500，证实Ad-DcR3/GAD65病毒转染树突状细胞疫苗能够有效降低淋 巴细胞的增殖能力。2、淋巴细胞分泌细胞因子能力检测末次回输后1周，断颈处死两组小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏，用100目筛网碾磨 成细胞悬液，用常规聚蔗糖-泛影葡胺分层液梯度离心法分离获得脾淋巴细胞，用含有体 积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为1 X 106个/ml，接种至96孔 板，每孔100 u 1，每组设3个复孔，每孔加入GAD65重组蛋白至终浓度为lmg/ml，置温度为 371、0)2气体体积分数为5%的培养箱内培养96小时，用￡1^154法检测白介素2(11^2)和 干扰素-Y (IFN-y)的含量。结果见图5，实验组小鼠淋巴细胞的IL-2和IFN-y含量分别为51. 3 士 5. 7pg/ ml和45. 6 士4. 9pg/ml,而对照组小鼠淋巴细胞的的IL-2和IFN- y含量分别为 114. 8 士 12. 3pg/ml和99. 3 士 102pg/ml，证实Ad_DcR3/GAD65病毒转染树突状细胞疫苗能够 有效降低淋巴细胞分泌细胞因子的能力。
3、NOD小鼠糖尿病发病率检测监测实验组和对照组小鼠的血糖水平。结果见图6，实验组小鼠18周龄开始出现血糖异常，30周龄的糖尿病发病率为 30%，而对照组小鼠14周龄开始出现血糖异常，30周龄的糖尿病发病率高达80% ；证实 Ad-DcR3/GAD65病毒转染树突状细胞疫苗能够有效延迟NOD小鼠糖尿病的发病时间，并降 低糖尿病的发病率。4、移植胰岛生存期检测胰岛细胞分离和纯化将C57BL/6J小鼠颈椎脱臼处死后，用体积分数为75%的乙 醇溶液浸泡消毒，无菌条件下打开腹腔，暴露胆总管，在解剖显微镜下结扎胆胰管在十二指 肠的开口，沿胆总管逆行灌注Hank' s液(含有浓度为0. lg/L的胶原酶P和浓度为10mg/ L的DNase-I)，待胰腺膨胀后，立即摘除胰腺组织，置温度4°C预冷的Hank' s液中清洗2 次，剪成0. 5 1mm3的小块，温度37°C振荡消化10 15分钟至成絮状，立即加入温度4°C 预冷的Hank' s液终止消化，用Hank' s液洗涤2次，细胞沉淀用Hank' s液重悬，再依 次加入质量分数为84%、67%、50%的Histopaque，1500g离心10分钟，吸取84% 67% 和67% 50%层面的细胞沉淀，用Hank' s液洗涤2次，再用DMEM培养基(含有浓度为 5. 6mmol/L的葡萄糖、体积分数为10%的胎牛血清、浓度为100000U/L的青霉素和浓度为 100mg/L的链霉素)重悬，取样进行胰岛细胞计数。胰岛细胞移植分别在实验组和对照组N0D小鼠检测到血糖异常后1周，将5X105 个C57BL/6J小鼠的胰岛细胞移植至N0D小鼠的腹膜下，每天检测小鼠血糖，当血糖水平恢 复到11. ImM时认为移植成功，考察两组小鼠移植胰岛的生存期。结果如图7所示，实验组小鼠移植胰岛的平均生存期为11天，而对照组小鼠移植 胰岛的平均生存期为4天，证实Ad-DcR3/GAD65病毒转染树突状细胞疫苗能够有效延长N0D 小鼠移植胰岛的生存期。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。序列表<110>中国人民解放军第三军医大学<120>DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用<160>8<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 F1<400>1
aatctgcagt cgcgagcggc cgcacaactt31<210>2<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 Rl<400>2tacgaattcg tgcacaggga ggaagcgctc acg 39<210>3<211>903<212>DNA<213> 智人(homo sapiens)<400>3atgagggcgc tggaggggcc aggcctgtcg ctgctgtgcc tggtgttggc gctgcctgcc 60ctgctgccgg tgccggctgt acgcggagtg gcagaaacac ccacctaccc ctggcgggac 120gcagagacag gggagcggct ggtgtgcgcc cagtgccccc caggcacctt tgtgcagcgg 180ccgtgccgcc gagacagccc cacgacgtgt ggcccgtgtc caccgcgcca ctacacgcag 240ttctggaact acctggagcg ctgccgctac tgcaacgtcc tctgcgggga gcgtgaggag 300gaggcacggg cttgccacgc cacccacaac cgtgcctgcc gctgccgcac cggcttcttc 360gcgcacgctg gtttctgctt ggagcacgca tcgtgtccac ctggtgccgg cgtgattgcc 420ccgggcaccc ccagccagaa cacgcagtgc cagccgtgcc ccccaggcac cttctcagcc 480agcagctcca gctcagagca gtgccagccc caccgcaact gcacggccct gggcctggcc 540ctcaatgtgc caggctcttc ctcccatgac accctgtgca ccagctgcac tggcttcccc 600ctcagcacca gggtaccagg agctgaggag tgtgagcgtg ccgtcatcga ctttgtggct 660ttccaggaca tctccatcaa gaggctgcag cggctgctgc aggccctcga ggccccggag 720ggctggggtc cgacaccaag ggcgggccgc gcggccttgc agctgaagct gcgtcggcgg 780ctcacggagc tcctgggggc gcaggacggg gcgctgctgg tgcggctgct gcaggcgctg 840cgcgtggcca ggatgcccgg gctggagcgg agcgtccgtg agcgcttcct ccctgtgcac 900tga903<210>4<211>24<212>DNA<213>人工 序列<220><223> 引物 F2<400>4gatcggatcc taccgtagag gccc24<210>5
<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 R2<400>5acgcgtcgac aatatttaga acaggttcc29<210>6<211>1758<212>DNA<213> 智人(homo sapiens)<400>6
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<210>7
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物 F3
<400>7
acgcgtcgac tcgcgagcggccgcacaacttt32
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物 R3
<400>8
agaatgcggc cgcaatatttagaacaggttcc3权利要求
DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒，其特征在于所述重组腺病毒基因组中包含一个DcR3和GAD65双基因表达盒，所述DcR3和GAD65双基因表达盒由上游至下游依次包含CMV启动子、DcR3全长编码基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、GAD65全长编码基因和终止子。
2.权利要求1所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于 包括以下步骤a、RT-PCR扩增 DcR3 全长 cDNA ；b、RT-PCR扩增 GAD65 全长 cDNA ；C、将步骤a所得DcR3全长cDNA插入pStar载体的IRES上游，步骤b所得GAD65全长 cDNA插入pStar载体的IRES下游，得重组载体pStar-DcR3-IRES_GAD65 ；d、以步骤c 所得重组载体 pStar-DcR3-IRES-GAD65 为模板，PCR 扩增 DcR3_IRES_GAD65 片段并更换该片段两端的酶切位点；e、将步骤d所得DcR3-IRES-GAD65片段插入腺病毒穿梭载体pShuttle_CMV的CMV启 动子下游，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65 ；f、将步骤e所得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65与腺病毒骨架 载体pAdEasy-Ι在大肠杆菌BJ5183中进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd_DCR3/ GAD65 ；g、将重组腺病毒载体pAd-DcR3/GAD65在293细胞中包装成重组腺病毒Ad_DcR3/ GAD65。
3.根据权利要求2所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征 在于步骤a的具体方法为提取人肝组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模 板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有Pst I 和EcoR I酶切位点的DcR3全长cDNA，PCR循环条件参数为94°C预变性5分钟；然后94°C 变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟；PCR产 物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT_DcR3。
4.根据权利要求3所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在 于步骤b的具体方法为提取人胰腺组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模 板，以SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有BamH I 和Sal I酶切位点的GAD65全长cDNA，PCR循环条件参数为94°C预变性5分钟；然后94°C 变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟；PCR产 物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT_GAD65。
5.根据权利要求4所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特 征在于步骤c的具体方法为自重组载体pT-DcR3中用Pst I和EcoR I双酶切出DcR3 全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切的pStar载体连接，得重组载体 pStar-DcR3 ；再自重组载体pT_GAD65中用BamH I和Sal I双酶切出GAD65全长cDNA， 经纯化后与同样用BamH I和Sal I双酶切的重组载体pStar-DcR3连接，得重组载体 pStar-DcR3-IRES-GAD65。
6.根据权利要求5所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在 于步骤d的具体方法为以重组载体pStar-DcR3-IRES-GAD65为模板，以SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示序列为上下游引物进行PCR，将DcR3-IRES-GAD65片段两端的酶切位点更 换为Sal I酶切位点和Not I酶切位点，PCR条件为94°C预变性5分钟；然后94°C变性50 秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟；PCR产物经纯化 后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-DcR3-IRES_GAD65。
7.根据权利要求6所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征 在于步骤e的具体方法为自重组载体pT-DcR3-IRES-GAD65中用Sal I和Not I双酶 切出DcR3-IRES-GAD65片段，经纯化后与同样用Sal I和Not I双酶切的腺病毒穿梭载体 pShuttIe-CMV 连接，得重组腺病毒穿梭载体 pShuttle-CMV-DcR3-IRES_GAD65。
8.根据权利要求7所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征 在于步骤f的具体方法为将重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65用 Pme I酶切线性化，再与腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι同时电转化大肠杆菌BJ5183感受态细 胞，进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd-DcR3/GAD65。
9.根据权利要求8所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征 在于步骤g的具体方法为将人胚胎肾293细胞以40% 60%的细胞密度接种至培养 瓶中，待细胞生长至30 % 50 %融合时，采用Lipofectamine 2000试剂将重组腺病毒载 体pAd-DcR3/GAD65转染293细胞，待细胞出现明显病变时离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液 重悬后，反复冻融使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重组腺病毒 Ad-DcR3/GAD65。
10.权利要求1所述DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒在制备抗胰岛移植排斥的 树突状细胞疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种DcR3和GAD65双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用，该重组腺病毒基因组中包含一个DcR3和GAD65双基因表达盒，该表达盒由上游至下游依次包含CMV启动子、DcR3全长编码基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、GAD65全长编码基因和终止子；该重组腺病毒的制备方法简单；将其体外转染树突状细胞再回输体内，能够诱导特异性T细胞耐受，有效抑制胰岛β细胞的破坏，并延长移植胰岛的生存期，可用于制备抗胰岛移植排斥的树突状细胞疫苗，在1型糖尿病治疗领域具有良好的开发应用前景。
文档编号C12N15/85GK101875920SQ20091025108
公开日2010年11月3日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者吴玉章, 杨曌 申请人:中国人民解放军第三军医大学