专利名称：：一种能够实现同一管内密闭检测核酸扩增产物的反应管的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程领域，涉及一种能够实现同一管内密闭检测核酸扩增产物的反应管。
背景技术：
：近年来，多种烈性传染病诸如SARS，禽流感H5N1，猪链球菌，甲型流感H1N1等在全世界范围内广泛流传，给人类造成巨大经济损失的同时严重威胁人类的生命健康。病原微生物检测方法主要有显微镜形态观察，免疫法检测，核酸检测等等。核酸检测较其他检测病原微生物检测法具有灵敏度高，特异性好，窗口期短，检测时间短等优点。目前病原微生物核酸检测方法主要有聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)，滚环扩增技术(RollingCircleAmplification,RCA)，环介导等温扩增(Loop—mediatedisothermalAmplification,LAMP)等。目前对核酸扩增产物的检测方式主要有电泳检测、荧光检测、紫外吸收检测等。这些检测方法都已作为常规检测方法广泛用于临床核酸扩增产物的检测。其中电泳检测和紫外吸收检测需要在反应结束后将扩增产物取出，有可能造成产物的滞后污染。荧光检测目前大都不需要开管进行检测，但是荧光染料提前加入至扩增体系中会抑制扩增反应，造成扩增效率下降，降低反应灵敏度。以上几种常规核酸产物检测方法均需要扩增反应仪以外的仪器进行检测，增加了核酸检测病原微生物的成本。虽然核酸检测病原微生物技术已经广泛应用于临床，但是以上提到的一些缺点仍然难以根本解决。
发明内容本发明的目的是提供一种能够实现同一管内密闭检测核酸扩增产物的反应管。利用该核酸扩增反应管可实现不开管，在一管内完成核酸扩增反应，进而进行荧光检测。本发明的目的是通过下列技术方案实现的—种能够实现同一管内密闭检测核酸扩增产物的反应管，该反应管管盖内壁吸附有荧光染料，核酸扩增反应结束后，不需要将管盖打开，只需将反应体系与吸附在管盖内壁的荧光染料混合，即可在激发光源下检测荧光产生情况以实现对核酸扩增产物的检测。所述的反应管，其中荧光染料固定吸附于管盖内壁的吸附性材料上，核酸扩增反应时不与反应管底部的核酸扩增体系接触，核酸扩增反应结束后通过倒置反应管使核酸扩增产物与荧光染料混合，使荧光染料解吸附并嵌合入核酸扩增产物发生结构改变，在激发光源下实现对核酸扩增产物的荧光检测。所述的反应管，其中核酸扩增反应主要包括聚合酶链反应、滚环扩增技术、环介导等温扩增。所述的反应管，其中荧光染料为SYBRGreen1(SYBRGreen1染料能够嵌入核酸双链结构内部，并且在激发光照射下产生荧光)。所述的反应管，其中管盖内壁吸附荧光染料的吸附材料为惰性大孔吸附材料。所述的反应管，其中惰性大孔吸附材料主要包括纤维素、大孔吸附树脂、单宁吸附材料、硅胶吸附材料。进一步，所述反应管的制备和使用的详细情况为将惰性大孔吸附材料固定于反应管管盖内侧，固定方式采用Araldite高性能快速粘合剂(爱牢达⑧万能超强胶)粘合。按照说明书操作，将粘合剂涂布于管盖内侧，将惰性大孔吸附材料置于粘合剂表面，并予以合贴轻压，粘合时间8小时。本发明所称的惰性大孔吸附材料可以采用纤维素(如醋酸纤维素，硝酸纤维素，羟丙基甲基纤维素等)、大孔吸附树脂(如D101大孔吸附树脂，XDA-1B大孔吸附树脂，H-60大孔吸附树脂等)、硅胶吸附材料(如细孔硅胶，大孔硅胶，B型硅胶和变压吸附硅胶等)、单宁吸附材料等。进行核酸扩增反应前，根据扩增反应体积选择荧光染料SYBRGreenl的量，按照每10iil加入3ii1采用二甲亚砜(DMS0)20倍稀释的SY服Green1。将反应管倒置，使管盖内侧向上。将选取的合适体积的SYBRGreen1点于固定在反应管管盖内侧的惰性大孔吸附材料表面，待染料全部吸附进入惰性大孔吸附材料内部后，即实现荧光染料的固定。在此反应管内配制反应体系，加入模板进行扩增反应，配制反应体系过程以及核酸扩增过程，不可将反应管倒置，避免反应体系提前接触荧光染料。扩增反应结束后，将反应管取出冷却后，倒置反应管并轻微震荡，使反应管内液体与管盖内侧的惰性大孔吸附材料充分接触，倒置静置5分钟后，正置反应管并离心，使管内液体全部位于反应管底部。此时，吸附于惰性大孔吸附材料的该荧光染料已经进入反应体系(吸附材料为亲水性物质，水溶液能够进入其内部，荧光染料是极性物质，易溶于水溶液中，在解吸附过程，荧光染料能够溶于进入吸附性材料内部的水溶液中，在离心的作用下，绝大部分水溶液能够到达反应管底部，即使有少量水溶液和荧光染料残留，由于荧光染料过量，并且扩增产物很多，仍然能够达到荧光检测的要求)，核酸扩增产物与荧光染料混合，荧光染料嵌合入核酸扩增产物发生结构改变，将此反应管置于紫外灯或其他激发光源下，观察反应管内荧光产生情况，即可对核酸扩增产物进行检测。本发明有益效果本发明提供的反应管能够将核酸扩增反应和荧光检测反应在同一管内偶联进行，不需要打开反应管即可对核酸扩增产物进行荧光检测，可以在减少操作步骤的同时最大可能的避免反应产物的滞后污染，同时避免了荧光染料掺入核酸扩增反应体系造成核酸扩增反应的抑制。本发明以简单的结构实现同一管内荧光染料与反应体系分离，反应结束后只需简单的倒置反应管使荧光染料与核酸扩增产物结合用于荧光检测核酸扩增产物，操作简单易行，成本低廉，适合用于临床快速检测。图1:反应管示意图。其中1、反应管管盖；2、惰性大孔吸附材料；3、反应管。图2:管盖内侧俯视图。具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1利用反应管进行LAMP反应检测猪流感H1N11、制备结合图l，按照Araldite高性能快速粘合剂(爱牢达《万能超强胶)说明书操作，将其涂布于反应管管盖1内壁，将惰性大孔吸附材料2(如0.45i！m纤维素滤纸)置于粘合剂表面，并予以合贴轻压，粘合时间8小时。进行核酸扩增反应前，根据扩增反应体积选择荧光染料SYBRGreenl的量，按照每10iil加入3ii1采用二甲亚砜(DMS0)20倍稀释的SYBRGreen1。将反应管3倒置，使管盖内壁向上。将选取的合适体积的SYBRGreen1点于固定在反应管管盖内壁的0.45ym纤维素滤纸表面，待染料全部吸附进入纤维素滤纸后，即实现荧光染料的固定。2、应用在此反应管内配制LAMP反应体系，反应体系如表1。H1N1LAMP引物SWH1-F3:5'-GGTGCTATAAACACCAGCC-3，SWH1-B3SWHl-LFSWHl-LBSWHl-FIP(Flc+F2)SWHl-BIP(Blc+B2)5，-TGATGGTGATAACCGTACC-3，5'-GGACATTYTCCAATTGTG-3'5'-TTGCCGGTTTCATTGAAGG-3'5'-CTGTRGCCAGTCTCAATTTTGTGttttCTGAAGTYCCATTTCAGAATATACATCCR-3'5'-ATCCCGTCTATTCAATCTAGAGGCttttCTGAAGATCCATCTACCATCCCTGTC-3'Y:t/ll或C;R:g或a。表1:25iiLLAMP反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>LAMP反应程序63。C/1.5h—80°C/5min加入模板进行扩增反应，配制反应体系过程以及核酸扩增过程，不可将反应管倒置，避免反应体系提前接触荧光染料。扩增反应结束后，将反应管取出冷却后，倒置反应管并轻微震荡，使反应管内液体与管盖内侧的惰性大孔吸附材料0.45m纤维素滤纸充分接触，倒置静置5分钟后，正置反应管并离心，使管内液体全部位于反应管底部。此时，吸附于0.45m纤维素滤纸荧光染料已经进入反应体系，将此反应管置于紫外灯或其他激发光源下，观察反应管内荧光产生情况，即可对核酸扩增产物进行检测(如产生荧光则待测样品含有检测病原微生物)。实施例2利用反应管进行LAMP反应检测禽流感H5N11、制备结合图l，按照Araldite高性能快速粘合剂(爱牢达⑧万能超强胶)说明书操作，将其涂布于反应管管盖1内壁，将惰性大孔吸附材料2(如直径为1毫米的B型硅胶颗粒0.5g)置于粘合剂表面，并予以合贴轻压，粘合时间8小时。进行核酸扩增反应前，根据扩增反应体积选择荧光染料SYBRGreenl的量，按照每10iil加入3ii1采用二甲亚砜(DMSO)20倍稀释的SYBRGreen1。将反应管3倒置，使管盖内壁向上。将选取的合适体积的SYBRGreen1点于固定在反应管管盖内壁的B型硅胶颗粒表面，待染料全部吸附进入B型硅胶颗粒后，即实现荧光染料的固定。2、应用在此反应管内配制LAMP反应体系，反应体系如下表2。H5N1LAMP引物F3:5'-TATAGAGGGRGGATGGCA-3'B3:5'CCGTCTTCCATYTTYTTGTT-3'FIP:5'-TCTTTGTCTGCAGCGTAYCCGGATGGGGAATGGTAGATGGTTGG-3，BIP:5'-ATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCATCCCTAAGTTRTTAAATTCCCTTCCAAC-3，Y:t/u或c;R:g或a。表2:12.5iiLLAMP反应体系:Buffer1.25"BIP,FIP各2uLB3，F3各0.5"dNTP(2.5mM)2uLBstDNA聚合酶1"H202.75uL矿物油10uLH5N1模板O早LAMP反应程序63。C/1.5h—80°C/5min加入模板进行扩增反应，配制反应体系过程以及核酸扩增过程，不可将反应管倒置，避免反应体系提前接触荧光染料。扩增反应结束后，将反应管取出冷却后，倒置反应管并轻微震荡，使反应管内液体与管盖内壁的惰性大孔吸附材料B型硅胶颗粒充分接触，倒置静置5分钟后，正置反应管并离心，使管内液体全部位于反应管底部。此时，吸附于B型硅胶颗粒的荧光染料已经进入反应体系，将此反应管置于紫外灯或其他激发光源下，观察反应管内荧光产生情况，即可对核酸扩增产物进行检测(如产生荧光则待测样品含有检测病原微生物)。序列表〈110〉华东医学生物技术研究所〈120〉一种能够实现同一管内密闭检测核酸扩增产物的反应管〈160>10〈210>1〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列6〈220〉〈223〉H1N1LAMP引物F3〈400>1ggtgctataaacaccagcc19〈210>2〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>H1N1LAMP引物B3<400>2tgatggtgataaccgtacc19〈210>3〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>H1N1LAMP引物LF〈400>3ggacattytccaattgtg18〈210>4〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈220><223>H1N1LAMP引物LB〈400>4ttgccggtttcattgaagg19〈210>5〈211>56〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>H1N1LAMP引物FIP〈400>5ctgtrgccagtctcaattttgtgttttctgaagtyccatttcagaatatacatccr56〈210>6〈211>54〈212〉DNA:0104]〈213>人工序列:0105]〈220〉:0106]〈223>H1N1LAMP引物BIP:0107]〈400>6:0108]atcccgtctattcaatctagaggcttttctgaagatccatctaccatccctgtc54:0109]〈210>7:0110]〈211>18:O川]〈212>DNA:0112]〈213>人工序列:0113]〈220〉:0114]〈223>H5N1LAMP弓|物F3:0115]〈400>7:0116]tatagagggrggatggca18:0117]〈210>8:0118]〈211>20:0119]〈212>DNA:0120]〈213>人工序列:0121]〈220〉:0122]〈223>H5N1LAMP引物B3:0123]〈400>8:0124]ccgtcttccatyttyttgtt20:0125]〈210>9:0126]〈211>44:0127]〈212>DNA:0128]〈213>人工序列:0129]〈220〉:0130]〈223>H5N1LAMP引物FIP:0131]〈400>9:0132]tctttgtctgcagcgtayccggatggggaatggtagatggttgg44:0133]〈210>10:0134]〈211>54:0135]〈212>DNA:0136]〈213>人工序列:0137]<220>:0138]〈223>H5N1LAMP引物BIP:0139]〈400>10:0140]atggagtcaccaataaggtcaactcatccctaagttrttaaattcccttccaac5权利要求一种能够实现同一管内密闭检测核酸扩增产物的反应管，其特征在于该反应管管盖内壁吸附有荧光染料，核酸扩增反应结束后，不需要将管盖打开，只需将反应体系与吸附在管盖内壁的荧光染料混合，即可在激发光源下检测荧光产生情况以实现对核酸扩增产物的检测。2.根据权利要求1所述的反应管，其特征是荧光染料固定吸附于管盖内壁的吸附性材料上，核酸扩增反应时不与反应管底部的核酸扩增体系接触，核酸扩增反应结束后通过倒置反应管使核酸扩增产物与荧光染料混合，使荧光染料解吸附并嵌合入核酸扩增产物发生结构改变，在激发光源下实现对核酸扩增产物的荧光检测。3.根据权利要求1所述的反应管，其特征是核酸扩增反应主要包括聚合酶链反应、滚环扩增技术、环介导等温扩增。4.根据权利要求1所述的反应管，其特征是荧光染料为SYBRGreen1。5.根据权利要求1或2所述的反应管，其特征是管盖内壁吸附荧光染料的吸附材料为惰性大孔吸附材料。6.根据权利要求1所述的反应管，其特征是惰性大孔吸附材料主要包括纤维素、大孔吸附树脂、单宁吸附材料、硅胶吸附材料。全文摘要本发明属于基因工程领域，涉及一种能够实现同一管内密闭检测核酸扩增产物的反应管。该反应管管盖内壁吸附有荧光染料，核酸扩增反应结束后，不需要将管盖打开，只需将反应体系与吸附在管盖内壁的荧光染料混合，即可在激发光源下检测荧光产生情况以实现对核酸扩增产物的检测。本发明以简单的结构实现同一管内荧光染料与核酸扩增反应体系分离，反应结束后只需简单的倒置反应管使荧光染料与核酸扩增产物结合，不需要打开反应管即可对核酸扩增产物进行荧光检测，操作简单易行，成本低廉，减少操作污染，适合用于临床快速检测。文档编号C12Q1/68GK101724553SQ20091026406公开日2010年6月9日申请日期2009年12月29日优先权日2009年12月29日发明者周国华,成思佳,梁超申请人:华东医学生物技术研究所