专利名称：：一种采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法
技术领域：
：本发明涉及一种采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法。
背景技术：
：核酸的提取与纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术。随着分子生物学技术广泛应用于生物学、医学及其相关领域，核酸的提取与纯化技术也得到进一步发展。核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起。核酸的提取主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分离。大多数核酸的提取方法，一般都包括细胞裂解，去除与核酸结合的蛋白质及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等步骤。1.细胞裂解细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。(1)机械作用包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法，这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起核酸链的断裂，因而不适用于高分子量长链核酸的分离；(2)化学作用在一定的pH环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相，变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、TritonX-100、Tween20、NP-40、CTAB、sar-cosyl、Chelex-IOO等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍等)而获得；(3)酶作用主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)以使细胞破裂，核酸释放。2.酶处理在核酸提取过程中，可通过加入适当的酶使不需要的物质降解，以利于核酸的分离与纯化，如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K或链酶蛋白酶)可以降解蛋白质，灭活核酸酶(DNase和RNase)，DNase和RNase也用于去除不需要的核酸。3.核酸的分离和纯化核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化，现有分离纯化核酸的常规方法有(1)酚提取/沉淀法将细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚氯仿异戊醇(25:24:i体积)混合液，两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸)或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸)后离心分离，再将核酸盐用有机溶剂沉淀，通过沉淀浓縮核酸，改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子；(2)密度梯度离心法双链DNA、单链DNA、RNA和蛋白质具带，该法适用于大量核酸样本的制备；(3)层析法，层析法是利用不同物质某些理化性质的差异而建立的分离分析方法，包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法，在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离；另外一些选择性吸附方法，以经修饰或包被的磁珠作为固相载体，磁珠可通过磁场分离而无需离心，结合至固相载体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱。磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法，其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂，提取纯化的核酸质量好、产量高，提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化，这些优点及特点使其提取核酸的方法有替代所有其它方法的发展趋势。磁珠是由磁性粒与各种含活性功能基团的材料复合而成的具有一定磁性及特殊表面结构的粒子。在生物磁性分离中，磁珠表面活性基团是一个非常重要的因素。目前使用较多的磁珠表面配基有单克隆抗体(Monoclonalantibody)、链霉亲和素(Str印tavidin)、寡聚核苷酸(Oligo皿cleotides)，以及用硅烷化试剂在磁性微球表面引入氨基(-NH2)，羟基(-0H)，巯基(-SH)，羧基(-C00H)，磺酸基(S03-)等，在此基础上，还可引入多糖类化合物(如纤维素、琼脂糖)、生物素、抗生物素等。表面结合抗体的磁性微球，即所谓"免疫磁珠"，运用抗体与特异性细胞表面抗原结合的原理，用于血液中细胞的快速分离、骨髓中干细胞的分离富集。链霉亲和素修饰的磁珠可用来提取分离核醣核蛋白/脱氧核醣核蛋白(DNP/RNP)。结合有生物素的DNA或RNA序列与链霉亲和素修饰的磁珠相互作用，蛋白质识别了这些序列，就可结合到固定化DNA/RNA上，这种方法被用来分离转录因子、限制性内切酶、复制蛋白等。Oligo(dT)25磁性微球被用于从复杂溶菌液中提取mRNA。Poly(A)-tail是mRNA序列上普遍存在的一段碱基，因此磁珠表面只需要有01igo(dT)25序列，就可以有效地与mRNA上的Poly(A)-tail杂交，并能除去rRNA，tRNA以及其他RNA。MagneSilTM超顺磁性磁珠是磁性粒子与Si02形成的表面带硅羟基而中心为磁性核的磁珠。DNA与硅羟基相互作用形成复合物，此复合物在磁场中有一定的响应性。这些由链霉亲和素、生物素、抗体或寡核酸片断等活性识别分子修饰的磁珠，由于在储存运输过程中不利于识别分子活性的保存，使用范围狭窄，吸附效率不高，价格极为昂贵等原因而未广泛应用。
发明内容本发明的目的是提供一种磁珠可置于4'C或-2(TC保存，且方便运输，使用范围广泛，吸附效率高，价格较低的采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法。本发明之采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法包括以下步骤(1)肽-寡核苷酸(p印tide-oligonucleotide)修饰磁珠以yFe203和Fe304磁性材料合成的均一、超顺磁、单发散性多聚微球为磁性来源，每个微球体包被一层多聚材料，通过乳液聚合或者分散聚合的方法制备携带羧酸盐的磁性高分子微球；经羧酸盐修饰的多聚材料核心粒子表面覆被一层磁铁，oligo(dT)14再共价结合在此表面上，核酸分子能够很好的锚定在此寡核苷酸上；(2)细胞裂解将含有靶核酸的待分离样品加入离心管中，再加入裂解液裂解细胞，以释放核酸；(3)核酸吸附向溶液中加入肽-寡核苷酸修饰的磁珠，核酸被磁珠表面吸附，蛋白质以及其他的杂质则不被吸附；将离心管置于磁性分离器，磁珠完全吸附于试管壁；(4)去除杂质加入水相缓冲液，对表面吸附有核酸并附着于试管壁的磁珠进行洗涤，将磁珠上的杂质冲洗分离；(5)核酸回收吸附在磁珠表面的核酸可直接作为PC財广增的模板，或者加入洗脱液，使吸附在磁珠表面的核酸分子解吸，进入洗脱液中，再用于下游实验。所述多聚材料优选聚苯乙烯。所述磁性微球(即磁珠)表面可修饰以不同配基(羧酸盐、寡核苷酸等)，作为吸附和结合相应分子的载体。所述待分离样品包括病毒，细菌，真菌，组织，血液，植物，口腔细胞，PCR反应产物，法医学样品及环境样品等。所述核酸指的是双链或单链DNA、RNA或核酸类似物。所述裂解液为含表面活性剂的溶液，优选含0.0P/。10。/。的SDS、LLS、Chelex-100、TritonX-100、Tween20或NP-40的溶液。所述磁珠溶液是指P朋.5±0.2，由100mmol/L2M/L的HEPES和100mmol/L2M/LNaCl构成的缓冲溶液。所述水相缓冲液为由O.1%至1」2%(体积比)的TritonX-100、100mmol/L2M/L的NaCl、KCl或LiCl组成的溶液。所述洗脱液可以为10mMTris-HCl和lmMEDTA，pH8.0的溶液。所述提取的核酸可应用于病原微生物的诊断，法医学分析，组织和血液分型，基因突变的检测，基因测序等领域。所述下游实验指检测、克隆、序列分析、PCR扩增、分子杂交和cDNA合成等。本发明运用肽-寡核苷酸修饰磁性微球(磁珠)表面，修饰过的磁珠表面将核酸吸附于其上，蛋白质以及其他的杂质则不被吸附，用水相缓冲液将其他杂质冲洗干净；吸附在磁珠表面的核酸可直接作为PC財广增的模板，或者加入洗脱缓冲液，吸附在磁珠表面的核酸分子被释放进入缓冲液中而用于下游实验。本发明中的经羧基修饰的磁性高分子微球，具有从生物样品中非特异性富集目标细胞和提取DNA的多功能性质。如在乙型肝炎病毒核酸(HBVDNA)的应用上乙肝病毒的基因组是一个有部分单链区的环状双链DNA分子，两条单链长度不一样。长链L(3.2kb)为负链，而短链S为正链，其长度不确定，约为负链的50%-80%左右。因为它的3'末端随不同来源毒株而有不同的缺失，所以位置可变，产生了部分环状结构。基因组依靠正链5'端约240bp的粘性末端与负链缺口部位的互补维持了环状结构。长链的5'末端有一个共价结合的末端蛋白，可能是引物酶。而短链5'端则通过共价键与具有帽子结构的短RNA结合。羧基修饰的磁珠能够很好的与5'末端的引物酶结合，而其他分子和杂质则不被磁珠吸附从而使乙型肝炎病毒DNA得到很好的分离和纯化。在磁珠表面再共价结合oligo(dT)14，由于Poly(A)-tail是mRNA序列上普遍存在的一段碱基，磁珠表面有01igo(dT)14序列，就可以有效地与mRNA上的Poly(A)-tail杂交，因此对于核酸为RNA的病原体及其他样品也具有很好的吸附效果。本发明的优点以肽-寡核苷酸修饰的磁珠，DNA、mRNA能够很好的锚定在此经修饰的磁珠上，而蛋白质、rRNA、tRNA以及其他杂质则可得到有效的去除，从而使DNA、RNA能够得到有效的分离和纯化。磁珠可置于4'C或-2(TC保存，且运输方便；运用此方法分离纯化所得目的核酸产量高，纯度高，同时不需要使用酚氯仿等有毒的有机试剂，而且操作快速、简便、节省人力，易于实现自动化。本发明几乎适合于从任何一种原料中分离高产量高纯度的DNA和RNA，包括病毒、细菌、真菌、质粒、组织、血液、植物、口腔细胞、PCR反应产物，以及法医学样品等。所获得的核酸可用于核酸检测、克隆、序列分析，PC財广增，分子杂交和cDNA合成等，广泛应用于病原微生物的诊断，法医学分析，组织和血液分型，基因突变的检测等领域。图l(a)为肽-寡核苷酸修饰磁珠流程图；图l(b)为磁珠法提取DNA操作流程图；图2为血清中HBVDNA的荧光定量PCR检测结果；图3为血清中HBVDNA的荧光定量PCR检测结果；图4(a)为血清中HBVDNA的荧光定量PCR检测结果(20IU/ml);图4(b)为血清中HBVDNA的荧光定量PCR检测结果(10IU/ml);图4(c)为血清中HBVDNA的荧光定量PCR检测结果(5IU/ml);图5(a)为血清中HBVDNA的荧光定量PCR检测结果(本发明磁珠)；图5(b)为血清中HBVDNA的荧光定量PCR检测结果(Dynal磁珠)；图5(c)为血清中HBVDNA的荧光定量PCR检测结果(Carboxylatespeed磁珠)；图5(d)为血清中HBVDNA的荧光定量PCR检测结果(Carboxylate磁珠)；图6为血清中HCVRNA的荧光定量PCR检测结果。图2-图6中横坐标为扩增循环数，纵坐标为荧光信号。具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细说明实施例l:肽-寡核苷酸磁珠分离纯化血清中HBVDNA本实施例包括以下步骤(1)肽-寡核苷酸修饰磁珠以yFe203和Fe304磁性材料合成的均一、超顺磁、单发散性多聚微球为磁性来源，每个微球体包被一层聚苯乙烯，通过乳液聚合或者分散聚合的方法制备携带羧酸盐的磁性高分子微球；经羧酸盐修饰的聚苯乙烯核心粒子表面覆被一层磁铁，oligo(dT)14再共价结合在此表面上，核酸分子能够很好的锚定在此寡核苷酸上[参见图l(a)];(2)细胞裂解将HBVDNA阳性血清200yl加入l.5ml离心管，随后加入300yl裂解液，裂解液由O.5%(W/V)的SDS、2%(V/V)的TritonX-100、lmol/L的GuScN混合组成，混匀，以释放核酸；(3)核酸吸附简单离心后，加入IOOyl经肽-寡核苷酸修饰的磁珠溶液，加入由200mmol/Lp朋.5±0.2的HEPES、200mmol/LNaCl、200yg/ml经肽-寡核苷酸修饰的磁珠溶液，震荡混匀，核酸被磁珠表面吸附，蛋白质及其他的杂质则不被吸附，室温放置10min后简单离心，将离心管置于磁性分离器，5min后待磁珠完全吸附于离心管壁，从离心管底部缓慢将上清液吸出；(4)去除杂质加入600yl水相洗涤液(0.2。/。(V/V)的TritonX-100、200mmol/L的NaCl组成)，震荡混匀，使磁珠完全悬浮，简单离心后，将样品管置于磁珠分离器，待磁珠完全吸附于试管壁，从试管底部将液体完全吸出，实现其他杂质被冲洗分离；(5)核酸回收加入100ul10mMTris-HC1，lmMEDTA，pH8.0组成的洗脱液，用移液枪吸打磁珠，使DNA与磁珠解吸，并进入洗脱液中[所述(2)—(5)步参见图l(b)]。将装有磁珠与洗脱液的离心管重新置于磁性分离器，磁珠被吸附于离心管壁，将100yl洗脱液及其中的DNA全部转入100yl狭缝比色皿中，使用紫外分光光度计测量DNA纯度。即测量上述DNA溶液在260nm和280nm的吸光度。DNA吸收260nm处的紫外光，而蛋白质吸收280nm处的。较纯的DNA样品应该基本不含蛋白质，260/280的吸光度比值应该较高，水或TE中纯的DNAOD，/OD28o比例一般在1.71.9。运用本方法分离纯化的DNA其OD，/OD28o比值为1.84(0D260=0.046，0D280=0.025)。实施例2:血清中HBVDNA的分离纯化及荧光定量PCR检测按照实施例l所述的方法，吸附、洗涤后，用移液器取50ylPCR反应液反复几次将吸附于离心管壁的磁珠完全洗脱，转移至PCR反应管中，运用荧光定量PCR仪进行定量检测。l)以中国生物制品检定所(中检所)乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量标准品标定的3种浓度的HBVDNA阳性血清为待测样本，浓度分别为5.0Xl()6lU/ml，5.0X104IU/ml，5.OX102IU/ml，每一浓度重复实验8次，结果如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>如图2所示，运用本发明的方法分离纯化核酸，重复性好，即使是不同的人操作，也能得到一致的结果。从而保证了后续实验的稳定，避免人工操作引起的差异及错误。2)以中检所乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量标准品标定的HBV强阳性血清为初始样本，稀释至2.0X109IU/ml，然后依次向下梯度稀释至2.0X108IU/ml，2.0X107IU/ml，2.OX106IU/ml，2.0X105IU/ml，2.0X104IU/ml，2.0X103IU/ml，200IU/ml，20IU/ml，每一浓度重复两次，如图3，由此9个浓度梯度标准品制定的标准曲线的线性相关性为0.998，可测定的线性定量范围可达2.0X109IU/ml2.0Xlc/lU/ml。取低浓度样品2.0X103lU/ml稀释到20IU/ml，10IU/ml，5IU/ml，每一浓度重复8次，如图4(a)、(b)、(c)，20IU/ml，10IU/ml均100%的扩增，而5IU/ml的仅12.5%的样本无扩增。运用本发明分离纯化的DNA进行荧光定量PCR检测具有线性范围宽，灵敏度高的特点。即使待测样本中核酸的量极低，也可以通过本发明的方法得到分离纯化。3)以HBV国家标准品中的线性灵敏度参考品为待测样本，以梯度稀释的阳性标准品(浓度分别为5.0X10IU/ml，5.0X10IU/ml，5.0X10IU/ml，5.0X10IU/ml)采用本发明的方法分离纯化核酸并应用荧光定量PCR检测，分析检测值与理论值的符合性。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>理论浓度和检测浓度的双对数曲线线性相关系数(r)为0.9997，可见运用此方法分离纯化的核酸无损失，提取效率高，应用于后续定量实验结果准确。实施例3:本发明的肽-寡核苷酸磁珠HBVDNA提取与目前市场上已有的磁珠法分离纯化核酸的比较运用三种不同处理方式的磁珠与本发明的经肽-寡核苷酸处理的磁珠对血清中HBVDNA分离纯化并进行荧光定量PCR检测比较。三种磁珠分别为InvetrogenDynal磁珠，Carboxylate(羧酸盐)speed磁珠，Carboxylate磁珠。以中检所乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量标准品标定的HBV阳性血清为初始样本，梯度稀释至105111/1111，104IU/ml，103IU/ml，102IU/ml，10IU/ml，5个阳性血清及一个阴性血清作为待测样本，采用上述三种磁珠及本发明的肽-寡核苷酸磁珠按照实施例l的方法对HBVDNA进行分离纯化。运用ABI7300对上述分离的核酸进行荧光定量PCR检测。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>如图5(a)、(b)、(c)、(d)分别为本发明的磁珠，Dynal磁珠，Carboxylatespeed磁珠，Carboxylate磁珠分离纯化DNA的荧光定量PCR检测图。Carboxylatespeed和Carboxylate磁珠的检测结果近似，Dynal磁珠在10"5IU/ml以下已经无法检测到Ct，这三种磁珠分离纯化的DNA均有较多的损失，产率不高，从而较低浓度的样本运用荧光定量PCR无法检测到。而本发明的肽-寡核苷酸磁珠分离纯化的DNA产率较高，无损失，可检测浓度低至10IU/ml的样本。实施例4:血清中HCVRNA的分离纯化及荧光定量PCR检测以已知HCVRNA浓度为5X105lU/ml的血清样本稀释至5X104lU/ml，5X103IU/ml，5X102IU/ml，50IU/ml，25，12.5以及三个丙型肝炎阴性的血清作为待测样本。1.5ml离心管中加入丙型肝炎核醣核酸(HCVRNA)阳性血清200y1，随后加入600yl提取液l:0.5%(W/V)的LLS、2%(V/V)的TritonX-100、lmol/L的GuScN、200yg/ml磁珠(以肽-寡核苷酸修饰)混合组成，混匀；简单离心后加入100yl提取液2，本实施例提取液2由200mmol/L的HEPES(p朋.5±0.2)、200mmol/LNaCl组成;震荡混匀10s，室温放置10min后简单离心。将样品试管置于磁性分离器，5min后待磁珠完全吸附于试管壁，从试管底部缓慢将上清液吸出；加入600yl洗涤液(0.2%(V/V)的TritonX-100、200mmol/L的KC1组成)，震荡混匀使磁珠完全悬浮，简单离心后将样品管置于磁珠分离器，待磁珠完全吸附于试管壁，从试管底部将液体完全吸出。用移液器取50ulPCR反应液反复几次将吸附于管壁的磁珠完全洗脱，转移至PCR反应管中，运用荧光定量PCR仪进行定量检测。PCR反应程序为:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1.一种采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)肽寡核苷酸修饰磁珠以γFe2O3和Fe3O4磁性材料合成的均一、超顺磁、单发散性多聚微球为磁性来源，每个微球体包被一层多聚材料，通过乳液聚合或者分散聚合的方法制备携带羧酸盐的磁性高分子微球；经羧酸盐修饰的多聚材料核心粒子表面覆被一层磁铁，oligo(dT)14再共价结合在此表面上，核酸分子能够很好的锚定在此寡核苷酸上；(2)细胞裂解将含有靶核酸的待分离样品加入离心管中，再加入裂解液裂解细胞，以释放核酸；(3)核酸吸附向溶液中加入肽寡核苷酸修饰的磁珠，核酸被磁珠表面吸附，蛋白质以及其他的杂质则不被吸附；将离心管置于磁性分离器，磁珠吸附于试管壁；(4)去除杂质加入水相缓冲液，对表面吸附有核酸并附着于试管壁的磁珠进行洗涤，将磁珠上的杂质冲洗分离；(5)核酸回收吸附在磁珠表面的核酸直接作为PCR扩增的模板，或者加入洗脱液，使吸附在磁珠表面的核酸分子解吸，进入洗脱液中，再用于下游实验。2根据权利要求l所述的采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法，其特征在于，所述磁珠表面修饰以不同配基，作为吸附和结合相应分子的载体。3根据权利要求2所述的采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法，其特征在于，所述配基为羧酸盐和寡核苷酸。4根据权利要求l所述的采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法，其特征在于，所述核酸为双链或单链DNA、RNA或核酸类似物。5根据权利要求1或2所述的采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法，其特征在于，所述裂解液为含表面活性剂的溶液。6根据权利要求5所述的采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法，其特征在于，所述含表面活性剂的溶液为含0.01。/。10。/。的SDS、LLS、Chelex-100、TritonX-100、Tween20或NP-40的溶液。7.根据权利要求1或2所述的采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法，其特征在于，所述磁珠溶液是指P朋.5±0.2，由100mmol/L2M/L的HEPES禾口100mmol/L2M/LNaCl构成的缓冲溶液。8.根据权利要求1或2所述的采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法，其特征在于，所述水相缓冲液为由O.1%到2%(体积比)的TritonX-100、100mmol/L2M/L的NaCl、KCl或LiCl组成的溶液。9.根据权利要求1或2所述的采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法，其特征在于，所述洗脱液为10mMTris-HCl和lmMEDTA，pH8.0的溶液。10.一种如权利要求l或2所述采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法所提取的核酸在病原微生物的诊断、法医学分析、组织和血液分型、基因突变检测、基因测序中的应用。全文摘要一种采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法，其包括以下步骤(1)磁珠处理以肽-寡核苷酸修饰磁珠；(2)细胞裂解将含有靶核酸的待分离样品加入离心管中，再加入裂解液裂解细胞；(3)核酸吸附向溶液中加入经肽-寡核苷酸修饰的磁珠，核酸被磁珠表面吸附；将离心管置于磁性分离器，磁珠吸附于试管壁；(4)去除杂质加入水相缓冲液，对表面吸附有核酸并附着于试管壁的磁珠进行洗涤，将磁珠上的其他杂质冲洗分离；(5)核酸回收吸附在磁珠表面的核酸直接作为PCR扩增的模板，或者加入洗脱缓冲液，使吸附在磁珠表面的核酸分子释放进入缓冲液，用于下游实验。本发明方法所用磁珠可置于4℃或-20℃保存，且运输方便，吸附效率高，价格较低。使用本发明方法提取并纯化的核酸，应用范围广泛。文档编号C12N15/10GK101665785SQ20091030763公开日2010年3月10日申请日期2009年9月24日优先权日2009年9月24日发明者戴立忠,熊晓燕申请人:戴立忠