专利名称：西瓜细菌性果斑病菌免疫pcr的检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型是一种西瓜细菌性果斑病菌的基因检测试剂盒，属于植物病原菌的检测领域，专一针对西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenaesubsp. citrulli，Aac)的检测。适用于西瓜细菌性果斑病菌的田间预防及进出口植物检疫中Aac快速检测。
背景技术：
西瓜细菌性果斑病又称细菌斑点病、西瓜水浸病、果实腐斑病等，是西瓜、籽瓜风险最高的一种种子传播病害。苗期和成株均可发病。瓜苗染病沿中脉出现不规则褐色病变，有的扩展到叶缘，从叶背面看呈水渍状，有时被一个黄色组织带包围。种子带菌的瓜苗在发病后l-3周即死亡。西瓜果实染病，初期在果实上部表面现数个几毫米大小灰绿色至暗绿色水渍状斑点，后迅速扩展成大型不规则的水浸状斑，3 5d内便布满除接触地面部分的整个果面。早期形成的病斑老化后表皮龟裂，常溢出黏稠、透明的琥珀色菌脓，果实很快腐烂。该病多始于成瓜向阳面，与地面接触处未见发病，瓜蔓不萎蔫，西瓜细菌性果斑病的病原菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚禾中(Acidovorax avenaesubsp. citrulli，A. a. c) 。 i亥菌属原核生物界(Procaryotae)、薄壁菌门(Gracilicutes)、暗细菌纲(Scotobacteria)、假单孢菌科(Pseudomonadaceae)、嗜酸菌属(Acidovorax)。 由于该病主要通过种子带菌进行远距离传播，且病瓜种子带菌率较高，所以对种子进行严格检测是防止该病害传播的最重要手段。目前国内对西瓜果斑病菌检测采用的方法主要有育苗检测、分离培养检测、免疫血清学和PCR检测等方法。育苗检测、分离检测所需检测时间较长，无法满足多批次种子进出口检测要求；免疫血清学如ELISA检测灵敏度相对较低，有时甚至出现假阴性现象。而只有少量种子携带病原这一实际情况，更使得以上检测方法的灵敏度和检出率受到限制，发展一种将病原富集和基因水平检测有效结合的方法，是进出口种子西瓜细菌性果斑病菌检测急需解决的问题。
实用新型内容本实用新型的目的在于避免现有技术的不足提供一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒。以克服现有的植物病原菌检测方法灵敏性低、特异性差、费时不稳定的不足，将病原富集和基因水平检测有效结合的方法，用免疫学方法先将样品中的病原富集，然后进行PCR扩增，可以极大的提高检测灵敏度，同时大大提高了种子检测的效率。[0005] 为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案为一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，包括有盒体(1)，衬垫(2)，在衬垫(2)上设有数个容器孔，其特征是在容器孔中分别放置8-10XPCR缓冲液(3);氯化镁20-25mmol/L(4) ;dNTP 8-10mmol/L(5) ;Taq酶l-5IU/ii L(6);引物5，-GACCAGCCACACTGGGAC-3，8-10pmol/ii L(7);引物5，-CTGCCGTACTCCAGCGAT-3， 8-10pmo1/y L(8);双蒸水99% 100% (9);包被了 Aac单克隆抗体的检测PCR管3个(10);包被了 Aac单克隆抗体的阳性对照PCR管3个(11);包被了 Aac单克隆抗体的阴性对照PCR管3个(12);阳性对照1管(13);阴性对照1管(14)。[0006] 使用该试剂盒对参试细菌进行免疫PCR扩增，西瓜细菌性果斑病菌产生分子量为 360bp的特异性扩增产物。 其扩增条件是PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放DNA作为扩增 模板；PCR扩增条件94t:变性20秒，35。C退火20秒，72。C延伸35秒，35次循环完成后72°C
延伸7分钟，最后4t:保持。 西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp. citrulli， Aac)免疫PCR检测 试剂盒，属于农作物病害防治和植物检疫范畴，基因位于16SrDNA。使用本实用新型试剂盒 对8个参试菌株进行检测，Acc得到360bp特异性目标条带，其余菌株无产物；对26个ELISA 检测阳性样品进行验证，符合率为98% ，且不符合样品均为ELISA未有效检测样品。该试剂 盒集病原浓縮、特异性抗体识别、PCR扩增为一体，是一种灵敏度极高、检测速度快、结果准 确、使用方便的试剂盒，尤其适用于植保部门和进出口检疫部门，对病原含量比较低的样品 进行快速西瓜细菌性果斑病菌的鉴定。 本实用新型的有益效果是本实用新型西瓜细菌性果斑病菌的检测试剂盒，涉及 一种检测危险性植物病原菌的分子技术，尤其是能快速、简便、准确的检测病原菌的试剂 盒，在10小时内就可以完成检测。 本实用新型提供了一种依赖PCR的分子检测试剂盒，克服现有的植物病原菌检测 方法灵敏性低、特异性差、费时不稳定的不足。该试剂盒能快速、灵敏、准确的检测到病原 菌，并直接可从植物种子、组织中检测病原菌。大大简化了检测程序，提高了我国口岸的检 疫水平，同时为病害防治策略的制定提供了依据。 通过对西瓜细菌性果斑病菌的特异性检测，引物Aacpl和Aacp2和优化的PCR条 件对目标菌株扩增得到了一段长360bp的PCR产物，可以特异的检测目标菌。但是对于8 种类非目标菌，均无扩增产物。 通过灵敏度的检测，对西瓜细菌性果斑病菌纯菌液模拟带菌种子提取液的直接 PCR和免疫PCR检测比较，发现直接进行PCR扩增的最低检出限为3600个细菌/ml ，而免疫 PCR的最低检出量是600个细菌/ml。 通过对西瓜种子检测，均可从带菌种子中准确稳定的检测到360bp的PCR产物，和 ELISA检测符合率为98%，且有2%的ELISA未检测到的带菌种子，该试剂盒也可以检测到 目标条带，说明该试剂盒比ELISA试剂盒更加灵敏。
图1是本实用新型的立体示意图。 图2A对出口 10个黑瓜籽检测； 图2B对出口 10个西瓜种子检测； 图2C对5个田间籽瓜样品检测。 其中M :Marker， P :Aac对照
具体实施方式以下结合实施例对本实用新型的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本实 用新型，并非用于限定本实用新型的范围。[0020] 实施例1 一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，包括有盒体l，衬垫2， 在衬垫2上设有数个容器孔，在容器孔中分别放置10XPCR缓冲液3 ;氯化镁25mmol/L4 ; dNTP 10,1/L5 ;Taq酶5IU/ ii L6 ;引物5' -GACCAGCCACACTGGGAC-3， 10pmo1/ ii L7 ;引物 5， -CTGCCGTACTCCAGCGAT-3' 10pmol/ii L8 ;双蒸水99% 100% 9 ;包被了 Aac单克隆抗体 的检测PCR管3个10 ;包被了 Aac单克隆抗体的阳性对照PCR管3个11 ;包被了 Aac单克 隆抗体的阴性对照PCR管3个12 ;阳性对照1管13 ;阴性对照1管14。 实施例2 —种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，包括有盒体l，衬垫2， 在衬垫2上设有数个容器孔，其特征是在容器孔中分别放置8XPCR缓冲液3 ;氯化镁 20,1/L4 ;dNTP 8,1/L5 ;Taq酶lIU/ii L6 ;引物5， -GACCAGCCACACTGGGAC-3， 8pmo1/ y L7 ;引物5，-CTGCCGTACTCCAGCGAT-3，8pmol/ii L8 ;双蒸水99% 100% 9 ;包被了 Aac单 克隆抗体的检测PCR管3个10 ;包被了 Aac单克隆抗体的阳性对照PCR管3个11 ;包被了 Aac单克隆抗体的阴性对照PCR管3个12 ;阳性对照1管13 ;阴性对照1管14。 使用该试剂盒对参试细菌进行免疫PCR扩增，西瓜细菌性果斑病菌产生分子量为 360bp的特异性扩增产物。 其扩增条件是PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放DNA作为扩增 模板；PCR扩增条件94t:变性20秒，35。C退火20秒，72。C延伸35秒，35次循环完成后72°C
延伸7分钟，最后4t:保持。 西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法，其步骤为 (1)加样品50 L室温或37t:孵育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的 Aac ;样品制备方法为按照每两克种子加入2ml提取缓冲液的比例，研磨种子至种皮破裂， 静置1小时后，用纱布过滤取上清，5000rpm(转/每分钟)离心5分钟，用100 y L重悬沉淀 直接作模板进行PCR扩增。抽提缓冲液配方为Na2S03 0. 13g/ml，聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 2g/ ml，叠氮化纳O. 02g/ml，鸡蛋清蛋白与吐温-20(tween-20)各0. 5ml/L，ra 7. 4，抽提缓冲液 使用量根据需要配置，一般种子和缓冲液的重量比约为1 : 2-10。 (2) PCR扩增，PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放DNA作为扩增模 板；PCR扩增条件94t:变性20秒，35t:退火20秒，72。C延伸35秒，35次循环完成后72°C
延伸7分钟，最后4t:保持。 (3) 1-1. 5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析； (4)对条带进行分析得出结论，若有扩增条带，则判断为西瓜细菌性果斑病菌。 实施例3 :见图2A，对出口的10批黑瓜籽进行验证检测 随机抽取经过ELISA检测的出口黑瓜子10批各30克进行检测，PCR反应条件为 94t:预变性20分钟，94。C变性20秒，35。C退火20秒，72。C延伸35秒，35次循环完成后72 °C 延伸7分钟，最后fC保持，扩增产物用1-1. 5%琼脂糖凝胶电泳及UVP凝胶成像系统分析， 结果表明，所检测的3批黑瓜籽携带Aac，但ELISA检测结果只有两批。 实施例4 :见图2B，对出口的10批西瓜种子进行验证检测 随机抽取经过ELISA检测的进口西瓜籽10批各30克进行检测，PCR反应条件为 94t:预变性20分钟，94。C变性20秒，35。C退火20秒，72。C延伸35秒，35次循环完成后72 °C 延伸7分钟，最后fC保持，扩增产物用1-1. 5%琼脂糖凝胶电泳及UVP凝胶成像系统分析， 结果表明，所检测的西瓜种子有5批携带Aac，但是ELISA检测结果只有4批携带。[0033] 实施例5 :见图2C，对田间采集的籽瓜、黄瓜、西瓜样品进行检测 对田间采集的籽瓜、黄瓜、西瓜样品5份进行Aac检测，PCR反应条件为94。C预变 性20分钟，94。C变性20秒，35。C退火20秒，72。C延伸35秒，35次循环完成后72。C延伸7 分钟，最后4t:保持，扩增产物用1-1. 5X琼脂糖凝胶电泳及UVP凝胶成像系统分析，结果表 明，所检测的样品西瓜籽均携带Aac，和ELISA检测结果完全符合。 以上所述仅为本实用新型的较佳实施例，并不用以限制本实用新型，凡在本实用 新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保 护范围之内。
权利要求一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，包括有盒体(1)，衬垫(2)，在衬垫(2)上设有数个容器孔，其特征是在容器孔中分别放置8-10×PCR缓冲液(3)；氯化镁20-25mmol/L(4)；dNTP 8-10mmol/L(5)；Taq酶1-5IU/μL(6)；引物5’-GACCAGCCACACTGGGAC-3’8-10pmol/μL(7)；引物5’-CTGCCGTACTCCAGCGAT-3’8-10pmol/μL(8)；双蒸水99％～100％(9)；包被了Aac单克隆抗体的检测PCR管3个(10)；包被了Aac单克隆抗体的阳性对照PCR管3个(11)；包被了Aac单克隆抗体的阴性对照PCR管3个(12)；阳性对照1管(13)；阴性对照1管(14)。
专利摘要本实用新型是一种西瓜细菌性果斑病菌的基因检测试剂盒，属于植物病原菌的检测领域，专一针对西瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxavena esubsp.citrulli，Aac)的检测。一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，包括有盒体(1)，衬垫(2)，在衬垫(2)上设有数个容器孔，其特征是在容器孔中分别放置8-10×PCR缓冲液(3)；氯化镁20-25mmol/L(4)；dNTP 8-10mmol/L(5)；Taq酶1-5IU/μL(6)；引物5’-GACCAGCCACACTGGGAC-3’8-10pmol/μL(7)；引物5’-CTGCCGTACTCCAGCGAT-3’8-10pmol/μL(8)；双蒸水99％～100％(9)；包被了Aac单克隆抗体的检测PCR管3个(10)；包被了Aac单克隆抗体的阳性对照PCR管3个(11)；包被了Aac单克隆抗体的阴性对照PCR管3个(12)；阳性对照1管(13)；阴性对照1管(14)。
文档编号C12Q1/68GK201473548SQ200920157020
公开日2010年5月19日 申请日期2009年5月22日 优先权日2009年5月22日
发明者刘箐 申请人:兰州慧盟生物科技有限公司