延长保质期的益生菌食品的制作方法

专利名称：延长保质期的益生菌食品的制作方法
延长保质期的益生菌食品本发明涉及含有益生菌的食品，尤其是保质期长的食品。更具体地，本发明涉及液 体乳制品(像含乳饮料、乳源食品和乳制品配料)或果汁。益生菌定义为活体微生物，当宿主被给予充足量的益生菌时，有益于宿主的健康 (FA0/WH0)。根据定义，所有益生菌具有已证明的非致病性特征。通常，这些保健作用与改 善人或动物胃肠道中微生物群落的平衡有关。长久以来人们就已经知道胃肠道中的微生物群落对人的健康十分重要。例如， 1970年，美国临床营养学杂志(The American Journal of Clinical Nutrition)出版的题 为“人的正常粪便菌丛”的综述文章(卷23:1457-1465页)开篇明义中开头便道肠道中 的正常群落的平衡对宿主的健康和康乐的影响已是连篇累牍。据报道，肠细菌与以下成份 的代谢有关碳水化合物(例如益生元、糖类)、蛋白质、脂肪、胆固醇、核苷酸、激素、维生素 和矿物质。人微生物群落生态会影响自然抵抗力、免疫力、骨质疏松、癌症和骨疽的发病率 等。大量出版物给出了机理解释，而临床研究证明了效力_出现在胃肠道中的微生物群落 对于感染抵抗力具有重要的影响。同时，肠微生物群落(和临时移居的益生菌种类)会影 响肠健康(例如上皮功能、粘液生长、上皮屏障功能、粘膜免疫、排便模式、肠通过)、特应 性疾病、阴道感染、皮肤疾病、人健康和人情绪等。实际上，可以说，微生物群落在人体内或 人体上任何地方都在发挥着作用。本发明涉及食品，具体地，具有乳制品和/或果实(汁)来源的食品。这些产品尤 其指通常属于日常消费的类型，并且意在对人或动物健康具有积极作用和/或对人或动物 的不便有改善作用。据信，预期的作用涉及恢复、再生、平衡或加强天然存在于人体或动物 体内或体表的微生物生态学。众所周知，可以提供包含通常选自乳杆菌属和双岐杆菌属的益生菌微生物的乳制 品，例如类干酷乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、干酷乳杆菌(Lactobacillus casei)、 瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、 和约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、 唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、其它乳杆菌(Lactobacillus)等，例如动物双 歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、两歧双 歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium Breve)、长双歧杆 菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、婴儿双歧杆菌 (Bifidobacterium infantis)等。其它菌株也用作益生菌。Alfred Nissle在1917年分离出了一种来自一位士兵 的粪便的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，这位士兵参加了第一次世界大战，他在志贺 氏菌病严重暴发期间并未罹患小肠结肠炎。由于抗生素尚未发现，故该菌株被成功地用于 治疗传染性肠疾病的急性病例(沙门氏菌病和志贺氏菌病)。另一个著名的例子是德氏乳 杆Tifi呆力口禾1J亚亚禾中(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)，一禾中不 舌动且不 形成孢子的菌株，它是用于生产酸乳的几种细菌之一。一位俄罗斯生物学家Ilya Ilyich Mechnikov信服了他的假说，定期使用酸乳使保加利亚农民保持长寿、健康。有人提出，这是因为酸乳中存在的益生菌德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus bulgaricus)。 0. Adolfsson 等人在美国临床营养学杂志(the American Journal of Clinical Nutrition) (2004，卷80，245-256页)中描述，酸乳本身还具有特别是针对各种胃肠疾病的 医药用途，而Ripudaman S. Beniwal等人在消化系统疾病和科学(Digestive Diseases and Sciences)(卷48，2077-2082页)中报道了酸乳在预防抗生素相关腹泻中的有益作用。不 希望受理论的约束，发明人确信，所描述的有益作用与这些酸乳中存在的乳酸菌有关。 某些益生菌菌株能产生有生物活性的成分，这些有生物活性的成分积聚起益生菌 菌株所能产生直接的或在某些情况下所能传递的效应。益生菌菌株的这种附 加益处的一 个很好的例子是枯草芽孢杆菌纳豆变种(Bacillus subtilis var. natto)，它产生帮助预 防骨退化的维生素K2。另一个例子是Mortiella亚种(常用spp.代表亚种)，它产生大量 LCPUFA(长链多不饱和脂肪酸)，其中，花生四烯酸能调节上皮细胞的细胞骨架功能并以此 调节上皮屏障功能。另一个例子是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，它能产生能调节胃 肠微生物群落的抗生素。在储藏期有限的乳制品中应用益生菌是众所周知的。在果汁或其它种类的汁中应 用益生菌很大程度上是基本未开发的领域。以上产品通常是储藏期有限的新鲜产品并且通常需要冷藏。许多乳制品和果汁被 制成可以无需冻藏的延长保质期的产品。问题是，无法在引入益生菌后不对这些产品的储 藏期产生不利影响或者妨碍。由于储藏期的缩短将丧失诸如长保质期乳制品和果汁存在的 理由，所以益生菌微生物不能被有效地用在这些产品中。因此，希望提供一种方式，藉由这 种方式，长保质期食品也能具有与益生菌微生物有关的效果。术语“长保质期食品，，一般是指或者因其成分本身或者因特殊处理亦或两者兼而 有之而变得可以保存的产品，这种产品可以长的时间储藏，优选在环境条件即非冷藏的条 件下储藏(例如两周或更长、优选数月、更优选数年，如以下进一步规定的)。为了更好地实现以上愿望，在一个实施方式中，本发明提供包含休眠状态的益生 菌微生物的长保质期食品。这是指真菌、酵母菌或细菌孢子或休眠细胞。在另一个实施方式 中，本发明提供选自含乳饮料、果汁、和它们的浓缩物的巴氏杀菌的液体食品，所述产品包 含益生菌真菌、酵母菌和/或细菌孢子或休眠细胞。在另一个实施方式中，本发明涉及益生 菌真菌、酵母菌和/或细菌孢子或休眠细胞作为长保质期食品尤其是选自含乳饮料、果汁、 和它们的浓缩物的巴氏杀菌的液体食品中的益生菌成分的应用。在再一个实施方式中，本 发明提供食品配料形式的食品，这种食品配料衍生自含有益生菌孢子或休眠益生菌细胞的 乳(例如由菲仕兰食品公司(Friesland Foods D0M0)生产的Deminal 90和/或GOS和/ 或乳糖，和/或可用于食品目的的任意其它乳源成分)、发酵乳。在又一个实施方式中，本发 明涉及针对保留延长保质期的益生菌食品的保存期目的的所述应用。即，这可以以长保质 期食品为基础获得益生菌食品，而且还能以与未添加益生菌时同样的方式储存该食品。保 留保存期不一定意味着保存期完全相同，因为可能受到引入益生菌孢子或休眠营养细胞的 影响(无论通过何种方式)。这至少表示该产品仍可以被认做是长保质期食品，不如在上文 中被提到的以及将在下文中进一步定义的。除了在储藏过程中减少或没有微生物生长的优点之外，对于较酸性的食品尤其是 饮料诸如果汁和酸乳或酸乳饮料的情况，还可获得另一个优点，其中，休眠益生菌微生物比活益生菌能存活更长的时间。我们注意到，W02004/080200涉及向食品，特别是动物饲料中添加益生菌孢子。该 文献解决了益生菌细菌的稳定性。该文献不涉及益生菌细菌、酵母和/或真菌孢子或休眠 细菌、真菌或酵母细胞、或它们的组合用于延长保质期的益生菌食品的用途。关于细菌孢子 的其它文献包括W02007/066108 ；WO 03/039260 ；Wolken等人在《生物技术方向》(Trends in Biotechnology)上的论文，第21卷，第8期，2003年8月1日，338-345页；Hong等人 在《欧洲微生物学会微生物学综述》(FEMS Microbiology Reviews)上的论文，第29卷，第 4期，2005年9月1日，813-835页；Casula等人在《应用和环境微生物学》(Applied and Environmental Microbiology)上的论文，第 68 卷，第 5 期，2002 年 5 月，2344-2352 页。无 一涉及长保质期食品。本发明独一无二地提供这种可能性，即许多寄居于我们的胃肠道中和/或长久以 来用于供人食用或用于人类食物生产的细菌和/或真菌中的一种或多种被用于延长保质 期的益生菌食品中。可以在该背景下使用的菌类优选地选自存在于(人)胃肠道中的那 些，更优地来自以下各属乳杆菌属(Lactobacillus)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、 韦荣氏球菌属(Veillonella)、德库菌属(Desemzia)、粪球菌属(Coprococcus)、柯 林斯菌属(Collinsella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、Turicibacter、萨特氏菌属 (Sutterella)、Subdoligranulum、链球菌属(Streptococcus)lifM (Sporobacter)、 Sporacetigenium、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、罗其JH白禾丨J 氏菌属(Roseburia)、变形 胃属(Proteus) > 胃胃 ^夭氏胃属(Prevotella) > Parabacteroides> Papillibacter> 颤螺菌属(Oscillospira)、蜜蜂球菌属(Melisococcus)、Dorea、戴阿利斯特杆菌属 (Dialister) > It^M (Clostridium) > MJ&M^M (Cedecea) > Catenibacterium> TSI^iH lifM (Butyrivibrio)、布丘氏菌属(Buttiauxella) > Bulleidia> BfII lifM (Bilophila) > 拟杆菌属(Bacteroides)、Anaerovorax> Anaerostopes、厌氧细杆菌属(Anaerofilum)、肠 木干胃禾斗(Enterobacteriaceae) > MH^ffl (Fermicutes) > Hfti^ K^M (Atopobium)、 Alistipes> Akkermans ia> M (Acinetobacter)、Slackie、志贺杆菌(Shigella)、 希瓦氏菌属(Shewanella)、沙雷氏菌属(Serratia)、Mahella、毛螺菌属(Lachnospira)、克 雷伯氏菌属(Klebsiella)、Idiomarina、梭杆菌属(Fusobacterium)、Faecal ibacterium、 真杆菌属(Eubacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃格特 菌属(Eggerthella)。所述菌种还可以源自真菌类，像酵母菌、子囊菌类、接合菌亚纲和半 知菌纲，最优地来自以下属的真菌类曲霉属(Aspergillus)、球拟酵母属(Torulopsis)、 接合酵母属(Zygosaccharomyces)、汉森氏酵母属(Hansenula)、念珠菌属(Candida)、 酵母属(Saccharomyces) > til M (Clavispora)、酒香酵母属(Bretanomyces)、毕赤酵 母属(Pichia)、淀粉菌(Amylomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、内真菌属 (Endomycess)、生丝毕赤酵母属(Hyphopichia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces) > 鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毛霉属(Mucor)、酒曲菌属(Rhizopus)、亚罗酵母属 (Yarrowia)、内孢霉属(Endomyces)禾口 / 或青霉菌属(Penicillium)。根据本发明，来自如上所述的种属或类的物种可以以休眠的形式(即作为孢子或 /和作为非活性的形式，它们在细胞的环境中不存在适合营养生长的条件时出现，因此，细 胞将处于休息或休眠状态)用于延长保质期的益生菌食品中。本领域技术人员将清楚，包含休眠形式的益生菌的食品不排除还包含不再有生存力的益生菌(它们对本发明既无帮 助也无妨碍)。在一个替代性实施方式中，根据食品、其期望储藏期和其保存环境，根据本发 明使用的休眠益生菌可以与常规的、未经改变的益生菌组合。优选地，产品中至少一半的益 生菌处于休眠状态，更优地，该比例约为50 50(即60 40至40 60)。然而，考虑到食 品中的益生菌的用量范围很大，可以按90 10至10 90或甚至99 1至1 99的数 量比率混合未经改变的益生菌和休眠益生菌(诸如孢子)。 来自上述种属或类的真菌、酵母或细菌种类可以作为本文所述的孢子或非孢子产 品用作延长保质期的产品中的益生菌，根据定义，它们是非致病性的。因此可以相信，能保 持休眠或孢子形式状态的真菌、酵母和细菌源的基本上所有非致病性微生物种类都能用于 延长保质期的益生菌产品。细菌孢子(也称为内生孢子)是一些类型细菌显示的休止阶段。内生孢子形成于 营养细胞(孢子囊)内，是对环境中的不利变化的响应。原始细菌细胞复制其遗传物质， 遗传物质的一份复制物被坚硬的包衣包围。然后，外部细胞瓦解，因此释放孢子，所述包衣 很好地保护着孢子，为其抵御各种影响，诸如热、冷、辐射或必需物诸如营养、水或空气的缺 乏。孢子本质上能发芽并因此提供迄今为止孢子化的细菌的生长。真菌孢子是酵母和真菌细胞在某些环境条件下说显示出的休止期，许多真菌和酵 母细胞都显示出休止期。在其天然环境中，通过营养孢子或通过菌丝体分裂进行的无性繁 殖相比于有性繁殖，可使真菌更快速地传播。例如，烤箱的酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的孢子生成是对营养缺乏的一种响应。孢子的构建可以分为两个阶段。第一 个阶段是在细胞质中产生新的膜室，它形成孢子的原生质膜。在第二个阶段，通过被多层的 孢子壁包围，孢子成熟，孢子壁提供对环境压力的抵抗性。无性的孢子根据环境条件例如水 活度、光、营养和/或防腐剂(天然的或合成的成分，被加入食物中以便通过限制营养生长 来防止由微生物生长引起的腐败)，在发芽后在新的环境中建群。因此，本发明的长保质期食品中存在的益生菌酵母、真菌和/或细菌孢子实际上 是出于“休眠”状态的益生菌酵母、真菌、或细菌、或它们的组合。本发明的一种优选的形式 是孢子形式的酵母、真菌和/或细菌，但还存在着保持细胞处于这种休眠阶段的环境条件。 而且，并非处于孢子形式的真菌、酵母或细菌源益生菌细胞是本发明的延长保质期的益生 菌食品的一部分。在食品被食用后，孢子在肠子中发芽，或者，环境条件将改变真菌、细菌或 酵母细胞的“休眠”状态，因此在需要时释放其的保健作用，效果可与食用酵母、真菌或细菌 本身相媲美。孢子或休眠细胞在胃肠道中仍处于休眠或孢子阶段而未变成有滋养力时也可 能是有效的(例如，通过细胞壁蛋白质、糖蛋白或结构竞争性地排除病原体结合位点或刺 激免疫系统)。虽然益生菌细菌、真菌或酵母孢子能够进入各种长保质期食品中，但是，本发明 最优地涉及酸性食品。食品的酸性将使细菌孢子保持在休眠阶段。被食用后，该阶段将 通过胃(这里显然是酸性环境)保持。在肠道中PH升高后，孢子会发芽。这方面的参考 文献是Gabriella Casula和Simon M. Cutting的《应用和环境微生物学》(Applied and Environmental Microbiology)，2002年5月，2344-2352页。本发明还涉及具有其它特定 环境条件像低水活度(例如在炼乳中)的产品、不含有针对所用孢子形式或休眠状态的益 生菌种类的特定营养要求以及缺乏/存在光和/或氧的产品。细菌、酵母或真菌孢子和/或休眠细胞将根据菌株和所用的条件保持其休眠状态，但如果打开包装袋并食用，细胞会 开始发芽并且变得有滋养力。 本发明的产品按一定的方式进行储藏，在这种方式下，孢子和/或休眠细胞不会 发芽，或者，在这种方式下，细胞保持休眠，例如，低水活度的环境；优选地，防止孢子发芽或 使细胞保持休眠的产品，诸如酸性产品；限制营养条件，加防腐剂的产品；和/或黑暗环境； 或上述条件中的两种或多种的组合(例如限制营养结合PH和防腐剂)。优选的产品选自 含乳饮料、衍生自乳制品的产品例如酸乳、和粉末形式的乳制品配料(例如含乳糖、乳浆和 /或酪蛋白的产品)、果汁、和它们的浓缩物。这些产品的PH范围通常在2-7 (果汁的pH处 于下限，酸乳是4，全脂乳是6-7)。本发明还可应用于希望制成延长保质期(并最终被巴氏 杀菌)形式的其它酸性食品，诸如奶油干酪(PH 4. 88)或村舍式干酪(pH 5)、不同成熟期的 硬乳酪、已发酵的或在接触细菌或真菌(在乳酪的内部或外部)后获得其典型味道的乳酪、 或水果制品。还可以将本发明应用于有糖或无糖的低水活度炼乳。另一种应用可以涉及使 产品处于黑暗中的包装材料。如上所述，本发明涉及长保质期食品。这些是可以无需冷藏的产品，尤其是适合非 冷藏的果汁、水果饮料和乳制品。“(储)藏”是指对产品，尤其是含乳饮料或果汁或含果汁 饮料进行防干扰包装到为食用产品而打开防干扰包装之间的时间。该保存期限通常可通过 参考包装上的“最佳食用日期”(或以不同语言表述的类似措词)来辨认。关于乳制品例如含乳饮料诸如牛奶、巧克力牛奶、酸乳饮料，延长保质期的产品的 保存期(非冷藏)可以超过12天。具体地，这是指保存期(非冷藏保存期限)超过45天、 尤其是45天至6个月、优选地6-12个月、更优地12-24个月。甜炼乳的保存期可以是5_10 年。对于果汁，延长保质期的产品一般保存期(非冷藏保存期限)是13-26周。含果汁饮 料的保存期(非冷藏保存期限)是3-6个月或更长。非冷藏是指在环境条件下保藏，在每 种气候区中，保存期限也许各异。当然，有的时候，环境温度恰巧与冰箱温度相同，譬如至多 7°C或更低，例如0°C，也可能在冰箱外储藏。虽然因此不能排除长保质期食品被保藏在此类 低温下的情况，但是，本领域技术人员将完全理解，术语“延长保质期的”表示在高于冰箱温 度的温度下储藏，这种温度通常高于8°C，尤其是至少10°C，一般最高达50°C，尤其是最高 达40°C。请注意，此类储藏将是在商店的货架上，例如在15-25°C。存在各种赋予食品“长保质期”的方法。范围从温度处理诸如巴氏杀菌和消毒直 到添加防腐剂。在本发明的范围内，而且与术语的正常意义等同，消毒处理是指杀死包括孢 子在内的所有生命形式的高温处理。显然，本发明不适用于在进行此类过程诸如消毒以期 杀死所有微生物生命之前添加休眠细胞或孢子。本领域技术人员将很容易理解，如果是经 受此类过程的延长保质期的产品，休眠的益生菌可以在这些产品已经经过了高温处理加工 后再应用到长保质期食品中，这种高温处理加工的范围可以是从巴氏杀菌直到消毒。延长保质期的乳制品和水果制品通常通过巴氏杀菌来获得。巴氏杀菌指各种形式 的加温处理，温度和处理时间决定结果。因此，经过常规巴氏杀菌的“鲜”乳(如果冷藏，可 储藏数周)是通过所谓的HTST法(“高温/短时”)来处理的。这种常规巴氏杀菌法通常 指在约72°C加热15-20秒。本发明不是应用于此类“鲜”乳，而是特别地应用于经巴氏杀菌 以适于非冷藏(在本发明的范围内，其被称为“延长保质期的巴氏杀菌法”)的产品。食品 适合长期保藏的其它理由是食品中的低PH和/或低水活度和/或营养限制和/或防腐剂的存在和/或光的缺乏。巴氏杀菌通常以多个继发的热处理或以单次热处理、一般于60至110°C的温度下 进行。巴氏杀菌热处理过程不仅取决于被处理的物质，还取决于其它保藏参数像PH、仓库存 储藏温度以及水活度。热处理的一个具体例子是UHT处理(超高温)。这一般可以称为超 巴氏杀菌(ultra-pasteurization)。优选的处理是利乐乳品加工手册(Tetra Pak Dairy Processing Handbook)(用于乳制品)和Steven Nagy的《果汁加工技术》(Fruit Juice Processing Technology)中提到的方法。特别适合的UHT处理是在135_150°C加热15_4 秒(乳品)，而对于果汁，在95-90°C加热15-60秒。另一种优选的处理(特别对于乳制品) 是在138°C或143°C的温度下加热几分之一秒。另一种“延长保质期的巴氏杀菌”处理，即产生延长保质期的产品的巴氏杀菌处 理，是HHST (更高温加热/更短时间)，该方法在时间和温度方面处于HTST和UHT之间。不 考虑为延长保质期所选的确切处理方法，本发明优选地涉及可以在冰箱外保藏的产品，尤 其是经过温度处理而达到这种状态的产品。这特别涉及细菌。然而，本发明不限于此。可以使用所有能形成孢子或在休眠期 休眠的真菌和酵母的孢子。益生菌细菌是本领域技术人员熟知的，不需要在此阐述。关于 能够形成孢子的(丝状)真菌和细菌的知识也是本领域技术人员熟知的。优选的示例包 括酵母以及真菌米曲霉(Apergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus soyae)、易变球拟 I^fiJ (Torulopsis versatilis) > Zygosaccharomyces soIaeKf^fiJliiM (Hansenula spp.)(例如异常汉森酵母)、球拟酵母菌属(Torulopsis spp)、Candida etchellsii、 皱状假丝酵母(Candida versatilus)、酵母属(Saccharomyces spp.)(酿酒酵母、布拉 酵母菌、葡萄汁酵母菌、S.elegans、贝酵母)、克鲁斯氏念珠菌(Candida krusei)、卢西 jfl^!^ (Clavispora lusitaniae) > M^f^^M (Bretanomyces spp. ) > Pichia saitoi> i^i)·^ ' (Amylomyces rouxii) >(Zygosaccharomyces major)、内貞胃 属(Endomycess spp·)、Hyphopichia burtonii、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、胃·会M (Kluyveromyces spp.) > (Mucor indicus)
(Rhizopus oligosporus)、中华根霉(Rhizopus chinensis)、米根霉(Rhizopus oryzae) > 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、扣囊内孢霉(Endomyces fibuliger)、娄地青 霉菌(PeniciIlium roqueforti)、沙门柏干酪青霉菌(Penicillium camemberti)、白 青 M (Penicillium candidum) > 干酷青霄(Penicillium caseicolum) > Penicillium album、纳地青霉(Penicillium nalgiovenese)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum), 以及细菌像枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、纳豆枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆 菌(Bacillus thuringiensis)、地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)、赌状芽孢杆菌 (B. cereus)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、 短小芽孢杆菌(B. pumilus)、B. polyfermenticus、克劳氏芽孢杆菌(B. cluasii)、侧孢 短芽 包杆菌(B· lactosporus)、{ J 包短芽 包杆菌(Brevibacillus lactosporus)、生 包 乳杆菌(Lactobacillus sporogenes)、凝结芽孢杆菌(B. coagulans)、多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa)、侧芽双歧杆菌(B. Iaterosporus)。最优选的是芽孢杆菌属的 细菌，其中最优选的包括枯草芽孢杆菌、纳豆枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌 和凝结芽孢杆菌。
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益生菌细菌孢子可以通过各种方法来获得。首先，可以购买，例如市场上有不同品 名，像 AlCaretm、Bactisubtil、Bidisubtilus、Bioplus 2B、Biosubtyl、Biosporin 和许多其 它的含有不同的上述形成孢子种类的。其次，一般可以通过使细菌在合适的培养基上生长、 然后使生长的培养物接触诱导孢子形成的环境来产生益生菌细菌孢子。后者可以包括向细 菌发出某种冲击的各种方法，例如通过升高温度、改变包含细菌的培养基中的盐浓度、改变 PH等。所述培养介质可以是固态或液态。在de Vries博士的题为“蜡状芽孢杆菌孢子形成、 结构和发芽”(瓦格宁根大学(Wageningen University)论文集，2006年)的论文中可找到 细菌模型微生物蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的孢子形成过程的例子。真菌孢子形成 过程的例子可以在Neiman博士的题为“酿酒酵母中子囊孢子形成”(微生物分子生物学评 论(Microbiol Mol Biol Rev.) 2005,69 :565_584)的论文中找到。真菌和/或酵母孢子和 /或处于休眠期的真菌、酵母或细菌细胞可以从产品的供应商处购买，或者从皇家荷兰生物 科技研究所培养物保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS))、发酵研究 所(大阪市)和美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection(ATCC))无 任意限制获得后进行生产。生产或购买后，可能希望纯化孢子培养物或细胞培养物，除去不需要的酶、细胞碎 片、细胞培养基和非孢子细胞。这一点可以利用与营养细胞和细胞碎片相比孢子的较高密 度来实现。在孢子培养物的情况下，优选使用基本上纯的(例如用相差显微术测定，大于 90%的相为明亮孢子)孢子制备物。在本发明的产品中，可以包括的孢子的量范围很大，通常足够每天食用 IO6-IO9CFU (菌落形成单位)。因此，本发明的食品的每日量通常包含IO6至IO9CFU的益生 菌孢子，优选地IO7至108CFU。优选地，该范围的量在一整天之内消费(例如四次IO7CFU的 剂量以达到一天4X IO7CFU的总剂量)，但是，也可以一次性地通过水果或乳基产品消费一 日剂量的孢子。单位量的产品中的菌落形成单位的数量将取决于每日份额的大小。在这一 点上，各种产品和各类消费者各不相同。通常，含乳饮料和食品饮料的正常摄入量是100至 800ml/天，以此为基础，本发明的产品优选地包含IO3至109CFU/ml、104至108CFU/ml、或IO5 至 107CFU/ml。孢子可以在巴氏杀菌之前引入食品中。也可以先对孢子进行独立的巴氏杀菌，然 后将其加入食品中。益生菌孢子用于预防、治疗人病毒、细菌、真菌或寄生源的感染或改善对这些感染 的抵抗力等等。胃肠道的感染包括胃肠炎(其特征是胃和肠粘膜的感染和/或发炎)和 急性和慢性腹泻。胃肠症状也被理解为表示特定的疾病，诸如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染。呼吸道疾病包括与小呼吸道的发炎(支气管炎)有关的感染，这种感染尤其 是由细菌或病毒(尤其是普通的感冒和流感病毒)感染或它们的组合造成。这也被理解成 意味着流感-传染性病毒传染病，它经常作为流行病出现。其它例子是由于各种微生物引 起的肺组织的严重发炎和肺炎，术语“肺炎”通常用于温和性肺炎的情况。而且还包括普通 感冒，它实际上是鼻腔的粘液和咽喉和/或头部鼻旁窦(上颌窦和窦腔)的发炎，具体地由 小RNA病毒造成；以及涉及CNSLD (慢性非特异性肺病)的疾病诸如哮喘、慢性支气管炎和 肺气肿。实际上，以上这些意味着所有体内或体表的位置时，自然存在的无害微生物群落
10可能发生失调。这种失调可能是由天然存在的微生物菌落的变化引起的，或者因感染来自 体外的传染病而引起。这通常涉及身体需要进行免疫抵制以恢复健康或不再发生感染或失 调的疾病。 用于本发明的延长保质期处理的产品中的益生菌孢子可以具有不同的来源。而 且，各种孢子可以在延长保质期的益生菌食品中组合。例如，一株孢子形式的芽孢杆菌属菌 株可以与另一株孢子形式的益生菌菌株在同一延长保质期的产品中相组合。也可以在延 长保质期的益生菌产品中组合两种以上孢子形式的益生菌菌株(例如一个产品中包括3、 4、5或大于5种不同的孢子形式的益生菌菌株)。在本发明的产品中，通过添加生物前物 质(prebiotic substances)可进一步扩大益生菌(以孢子的形式提供)的优点。生物前 物质是不可消化的食物成分，它们通过选择性地刺激肠道(特别地结肠)中的一种或有限 种类的细菌的生长和/或活性来有利地影响宿主并因此改善宿主健康。最著名的生物前物 质是不可消化的低聚糖。合适的生物前物质的例子是具有短链或长链的果糖和/或乳_低 聚糖、菊粉、含岩藻糖的低聚糖、β葡聚糖、酸豆粉、树胶、果胶、唾液酸寡糖、唾液乳糖、短链 或长链半乳聚糖和核苷酸。这些物质的正常量是本领域技术人员已知的，优选地是约最多 0. 1-10克/天、优选地1-5克/天、或2-3克/天，取决于是哪种生物前物质。本发明的乳制品可以按关于这些产品已知的方式来生产(即从牛、山羊或其它奶 场动物获得奶、对这些奶实施常规处理以获得奶或其它含乳饮料诸如酸乳饮料、巧克力奶 等)。通常，这些产品可以包含或不包含诸如蛋白质来源、脂质来源、碳水化合物来源的成 分。所述产品可以是无糖产品或不是，卡路里含量优选地是每IOOml产品0至500卡。这 一点(加以必要的变更)适用于本发明的水果制品。乳制品和水果制品，优选地饮料或浓 缩物的一般组成是本领域中完全已知的。奶可以来自例如牛、水牛、山羊、绵羊或骆驼。这些产品或饮料还可以以乳品替代 物诸如大豆为基础。
实施例实施例1对500L脱脂乳进行标准化以得到蛋白质含量为例如35. 8%蛋白质/非脂乳固体 的具有乳糖或乳清渗透物的液体乳。分别地，一边混合一边将6. 5kg来自ADM的Cardio Aid 植物固醇(含有> 56%总植物固醇；40-58% β-谷甾醇；0-5% β-二氢谷甾醇；20-30% 菜油甾醇；< 5%菜油甾烷醇；14-22%豆甾醇；< 3%菜籽甾醇；< 3%其它甾醇或stands) 加入包含棕榈油的脂肪部分。如以下所述，通过脂肪注射将该脂肪/固醇混合物加入奶中。通过已知的技术将液体奶加热至120°C，随后持续加热3分钟。然后将热的奶转 移至降膜蒸发器的一效中并蒸发至固体含量约为24%。在二效的下流管下方，以恒定流量 加入固醇与脂肪的混合物，在80%所需的蒸发时间内使其均勻分布。以同样的方式引入包 含奶鞘脂的极性脂质部分。在两步勻浆器中搅勻奶与脂肪、固醇和鞘脂，使脂肪颗粒粒径为 0. 36微米至0. 47微米(用犁刀头LS13320测量)以得到具有降低胆固醇作用的浓缩奶。 根据蒸发物的稳定性，加入磷酸盐和/或柠檬酸盐和/或碳酸盐。将添加休眠培养物(例 如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))后的奶运输300km的距离并且标准化为干物质含 量为12. 5%的奶饮料。
实施例2在标准条件下通过发酵过程制备酸乳，其中涉及乳酸杆菌培养物的选择。以2X106CFU/ml的浓度向该酸乳中加入Pichia pastoris的培养物。在15°C下保藏4周的 时期内，酵母平板计数(CFU/ml)保持稳定。实施例3菌种短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)和短芽孢杆菌(Bacillus brevis) 在无维生素的特定氨基酸混合物的存在下将发芽。制备以橙子为基础的果汁，其含有天 然存在的维生素并含有低浓度的氨基酸。在果汁中浓度低的氨基酸的例子是酪氨酸。 该果汁的PH为2. 5至4. 5。以5 X 106CFU/ml的浓度向该果汁中加入纯短短芽孢杆菌 (Brevibacillus brevis)和短芽孢杆菌(Bacillus brevis)孢子，然后使用温和巴氏杀菌 过程。超过50%的全部孢子在巴氏杀菌过程后存活。该饮料在5-50°C的不同温度下保藏 1年后，通过味道和保存期限试验显示，该产品明显未受影响。在一些保藏条件下，CFU/ml 约为5X105，该值通过计数平板计数乳琼脂上的菌落形成单位来确定。实施例4由浓缩的橙汁粉制备以橙子为基础的果汁，这是果汁生产商经常从事的行为。对 果汁进行温和巴氏杀菌并向该水果饮料中加入米曲霉(Aspergillus oryzae)孢子。以 106CFU/ml的浓度向果汁中加入纯真菌孢子。该饮料在5、10和20°C等不同温度和黑暗(意 味着包装材料未让任何光线透过)中保藏3个月后，味觉和保存期限试验显示该产品未受 影响。类似地，预期1和2年的黑暗保存期限试验后，味觉和保存期限试验将证明该产品不 受影响。实施例5用不同的灭菌法例如在75_85°C下间歇式巴氏灭菌10分钟对无味的、pH约为 4的天然饮用酸乳进行巴氏杀菌。根据特征性的加热和冷却方案实施所述间歇式巴氏灭 菌。另一种灭菌方法是连续的，其中使用几种方法，它们的时间范围是2至30秒、温度 范围是110°C至65°C。之后，向该饮用酸乳中加入不同的孢子枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和伸展芽孢杆菌(Bacillus flexus)，浓度 为10E7CFU/ml。所有这些孢子纯度大于99%，通过相差显微术测定。含不同孢子的饮料在 5-40°C的温度下黑暗保藏约2年和2. 5年。平板计数乳琼脂显示酸乳中存在的孢子数略微 下降，味觉试验未显示任何显著的差异。实施例6向商品名为 Coolbest Acai powerfruit、Appelsient je (sinaasappel met vruchtvlees mild)禾口 Appelsientje appel (troebel，mild)、pH 范围是 3. 0 至 4. 5 的 3 种 不同水果饮料中加入枯草芽孢杆菌孢子，直到浓度达到4X 106CFU/ml，并在95°C进行1秒 钟巴氏杀菌。将该饮料保藏在7°C和20°C，22个月后测定孢子存活率。菌落计数后显示， 4X106CFU/ml的超过1 %在这些保藏条件下存活。实施例7由固相法(通过用水洗涤表面收获孢子)和液体培养法(在液体培养基中生产孢 子)分离出无营养细胞、酶活性和来自生长培养基的残留物的纯细菌孢子。孢子的纯度对 于实施例(例如实施例5)中所述的一些应用是必需的。所生产的孢子制备物的纯度应该大于99%，在一些情况下，根据载体可以使用75-90%的纯度，甚至可以使用纯度为50-75% 的制备物，所述纯度用相差显微术测定。这些制备物用基于分离的方法进行制备，所述分离 以原始孢子培养基中存在的单一成分的密度(=质量和体积)为基础。一般情况下，孢子 应该用蒸馏水洗涤至少4-10次，随后，基于各类细胞的密度进行分离(例如用离心力技术 或过滤技术)，以达到所需的孢子悬浮液的纯度。实施例8通过已知的和标准化的生产程序pH约为6-7的低脂肪和高脂肪乳品制备浓缩 乳制品。通过步进式方法蒸发该乳(衍生)制品，在所述方法中，温度经过某些时间段从 130°C逐渐下降至75°C (或相反)，直到获得希望的乳浓缩物。向该蒸发后的无糖乳制品 中加入糖(可以为0%)直到达到饱和浓度以产生具有长保存期限的甜味浓缩乳。该产 品具有极低的水活度，这使得孢子或休眠细胞处于它们生命周期的休眠期。对不同的甜 n^^iflLSft SIMSI # (Saccharomyces cerevisiae) >(Aspergillus oryzae) > 黑曲霉(Aspergillus niger)、酱油曲霉(Aspergillus soyae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、 短芽孢杆菌(Bacillus brevis)和/或休眠细胞。在环境温度下保藏后，显示所有浓度的 CFU/ml至少16个月保持稳定。实施例9以107CFU/g粉末的浓度混合布拉酵母菌(Saccharomyces boulardi)、酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergilus niger)、酱油曲霉(Aspergillus soyae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽 孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)、赌状芽孢杆菌 (B. cereus)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、 短小芽孢杆菌(B. pumilus)、B. polyfermenticus、克劳氏芽孢杆菌(B. cluasii)、侧孢 短芽 包杆菌(B· lactosporus)、{ J 包短芽 包杆菌(Brevobacillus lactosporus)、生 包 乳杆菌(Lactobacillus sporogenes)、凝结芽孢杆菌(B. coagulans)、多粘芽孢杆菌 (B. polymyxa)、侧芽双歧杆菌(B. Iaterosporus)的孢子与具有乳双糖、Vivinal GOS和不 同的蛋白质制备物例如名为Demina190和Hiprotal 90的那些的不同品牌的产品。在1年 的时间内，每4个月测量计数(CFU/g)，这些保藏在20°C的产品的菌落形成单位保持恒定 (都大于 106CFU/g)。
权利要求
1.一种长保质期食品，其包含处于休眠状态的益生菌微生物。
2.如权利要求1所述的长保质期食品，其特征在于，所述益生菌微生物选自能形成孢 子的真菌、酵母和细菌。
3.如权利要求1所述的长保质期食品，其包含休眠的真菌、酵母或细菌细胞。
4.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，所述食品选自乳制品尤其是含乳饮 料、果汁、它们的液态或粉末形式的浓缩物、它们的液态或粉末形式的脱水物、它们的液态 或粉末形式的发酵产物、和上述产品的混合物。
5.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，其特征在于，所述休眠状态的 微生物选自梭菌属(Clostridia)和/或芽孢杆菌属(Bacillus)，优选枯草芽孢杆菌 (B. subtilis)、纳豆枯草芽孢杆菌(B. subtilis(natto))、短小芽孢杆菌(B. pumilus)、地 衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)禾口凝结芽孢杆菌(B. coagulans)。
6.如权利要求1-4中任意一项所述的长保质期食品，其特征在于，所述休眠状态的微 生物选自米曲霉(Apergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus soyae)、汉森氏酵母菌 属(Hansenula spp.)、球拟酵母属(Torulopsis spp)、念珠菌属(Candida spp.)、酵母属 (Saccharomyces spp. )、|昆孢属(Clavispora spp.)、酒香酵母属(Bretanomyces spp·)、毕M (Pichia spp.)、内貞胃M (Endomycess spp.)、胃 会佳—胃M (Kluyveromyces spp.)、酒曲菌属(Rhizopus spp.)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、扣囊内孢霉 (Endomyces fibuliger)、青霉属(Penicillium spp.)、它们的混合物、和它们与梭菌属和/ 或芽孢杆菌属的亚种的混合物。
7.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，其包含益生菌孢子或休眠期的益 生菌，所述益生菌或孢子的细胞在离开休眠期或孢子期后能产生至少一种促进健康的成分 (诸如维生素K2、抗生素或长链多不饱和脂肪酸)。
8.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，其包含益生菌孢子和细胞，所述细 胞选自活细胞、无活力细胞、和它们的混合物。
9.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，其特征在于，所述产品具体地通过 HHST或UHT接受延长保质期的巴氏杀菌处理。
10.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，所述食品的每日量包含 IO4-IOiciCFU (菌落形成单位)、优选地105-101QCFU、更优地106-109CFU、最优地IO8-IO9CFU的 益生菌孢子。
11.如权利要求10所述的长保质期食品，其特征在于，所述产品是包含105-108CFU/ml、 典型地 12，500-50, 000, 000CFU/ml、优选地 105_106CFU/ml 的液体。
12.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，包含至少一种益生物质，所述益 生物质优选地选自果糖_低聚糖、乳_低聚糖、果糖-乳-低聚糖、菊粉、含岩藻糖低聚糖、 β -葡聚糖、酸豆粉、树胶、果胶、唾液酸寡糖、唾液乳糖、半乳聚糖和核苷酸。
13.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，其特征在于，益生菌微生物的滋养 生长所必需的一种或多种维生素受到限制。
14.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，其特征在于，益生菌的滋养生长所 必需的一种或多种矿物质受到限制。
15.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，其特征在于，益生菌的滋养生长所必需的一种或多种氨基酸受到限制。
16.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，其特征在于，益生菌的滋养生长所 必需的一种或多种碳水化合物受到限制。
17.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，其特征在于，益生菌的滋养生长所 必需的光受到限制。
18.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，其特征在于，存在限制益生菌的滋 养生长的防腐剂。
19.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，其特征在于，所述pH限制益生菌 的滋养生长。
20.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，其特征在于，所述温度限制益生菌 的滋养生长。
21.如以上权利要求中任一项所述的长保质期食品，其特征在于，如权利要求13-20中 所述的任意条件的任意类型的组合限制益生菌的生长。
22.选自细菌孢子、酵母菌孢子、真菌孢子的益生菌孢子和/或休眠的细菌、真菌和/或 酵母细胞、和/或它们的混合物作为长保质期食品中的益生元的应用。
23.如权利要求22所述的应用，用于保持长保质期食品的保存期的同时使所述食品成 为益生菌食品。
全文摘要
本发明公开为消费者提供益生菌活性的延长保质期(即可以非冷藏保藏较长的时间)的食品诸如乳制品或水果制品。所述提供益生菌活性是通过包含益生菌细菌的孢子来实现的。所述产品具体地选自乳制品(像含乳饮料、乳源食品和乳制品配料)、水果饮料、或它们的浓缩物。
文档编号A23L1/30GK102006787SQ200980114491
公开日2011年4月6日 申请日期2009年3月18日 优先权日2008年3月18日
发明者别瑟伯克 R·特, 弗里斯 Y·P·德 申请人:菲仕兰品牌有限公司