降低植物体中的重金属含量的细菌的制作方法

专利名称：降低植物体中的重金属含量的细菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及降低植物体中的重金属含量的细菌，使用该细菌降低植物体中的重金 属含量的方法，和含有该细菌作为有效成分的组合物。
背景技术：
矿物、土壤等中天然存在的镉、铅等重金属因矿山开发等人类活动被排放到环境 中。例如，镉包含于矿山坑水、冶炼厂废水/废烟、或来自废石等的堆积场的废水等 中，这些铬是目前土壤污染的主要原因。此外，镉来源于进口和在日本国内产生，其作为镍 /镉电池、颜料、合金使用，以前还作为聚氯乙烯稳定剂等使用。过去，曾经有过以工厂或焚 烧场的废水和废烟的形式排放到河流或大气中的事例。而且，已知在农耕地中镉侵害土壤 起因于被镉污染的河流水的流入，或者镉从雨水等入侵到环境中。在摄取食品时，食品中的一部分镉会被吸收并蓄积到体内，因此厚生劳动省通过 如果长期摄取高镉浓度食品，则存在引起肾功能障碍的可能性。此外，在日本，还因镉的环 境污染而发生过痛痛病(itai-itai disease)事件。关于食品中镉含量的国际标准，食品准则委员会(Codex AlimentariusCommission)从1998年起就进行了研究。该委员会于2007年7月提出了每 千克精米0. 4mg镉、每千克小麦0. 2mg镉等的国际标准值。降低作物中的镉含量的方法包括例如施投客土(soil dressing)或土壤改良材 料，利用低吸收镉的品种，或利用植物治理法(phytoremediation)或土壤洗涤进行土壤净化等。现行的土壤改良中主要采用客土法，但该方法需要大量费用，且情况是采集客土 所必需数量的山土是困难的。而且，采用客土法必须进行大量的废土处理。此外，还有必要 将土壤改良，使得其适合作物栽培。在客土厚度不充分的情况下，还有可能再次发生污染， 因而需要开发一种在物理上、成本上行之有效的技术。此外，采用其它方法也需要大量的费 用和时间。作为低成本的方法，利用微生物从环境中除去镉值得期待。金属阳离子与硫化 物离子、氢氧化物离子等阴离子结合而形成难溶于水的化合物。重金属离子的硫化物、 氢氧化物、磷酸盐等不溶或难溶于水。利用这些特性，尝试了利用微生物从环境水中除 去镉。作为沉淀硫化物的微生物，已知有脱硫弧菌属(Desulfovibrio)等硫酸盐还原菌 (sulfate-reducing bacteria)。已知这些微生物分布于有机物多的湖沼、湿地、水田中，进 行了在水稻中降低重金属的研究。然而，这些微生物虽然对于在水田中栽培的稻是有效的， 但是，在酸性条件下的田地中，硫化物转变为硫酸，成为可被作物吸收的形态，从而在酸性 条件下无法再利用这些微生物。有报导称，对于豌豆(garden pea)，通过使用菌根真菌(mycorrhizal fungi)进行 处理，降低了根中的镉浓度。已知菌根真菌感染特定植物的根，具有促进植物的养分吸收、特别是磷酸吸收的功效。但是，在高浓度镉土壤中未见镉降低效果(非专利文献1)。此外，还有报导称，对于烟草，也尝试了使用菌根真菌(球囊霉属(Glomus))降镉 (非专利文献2)。在从枝菌根(Arbuscular Mycorrhiza) (AM) 3菌株中观察到了降低叶中 镉浓度的效果。但是，未观察到镉降低效果与菌根真菌的建群性(colonization)之间存在 关联性。此外，AM是一种霉菌，存在的问题是其人工培养存在困难，大量培养需要劳力和时 间。而且，菌根真菌仅在特定宿主的根部建群，难以用于其它的宿主。已知因土壤的不同， 菌根真菌的作用存在很大差异，并且在磷酸丰富的土壤或通气性差的土壤中其作用会受到 抑制。因此，存在镉降低效果因土壤而显著变化的可能性。此外，非专利文献2的实验仅在 温室中进行，且其所使用的是刚刚灭菌完毕的土壤。可以想像，在使用灭菌土壤的情况下， 通过接种添加的微生物成为土壤中的优势菌种。但在通常栽培植物的情况下，土壤中存在 各种各样的微生物，接种微生物的量会因营养成分的竞争等减少。因而，在实际栽培植物的 苗圃(field)等环境下进行的实验是重要的。细菌传统上被用作各种土壤带来的病害的防治剂或植物病害的防治剂。例如，人苍白杆菌(OchrcAactrum anthropi)TRB 19菌株用作茄科植物土壤病害 防治剂的有效成分，通过将其适用于茄科植物包括烟草和番茄的根部、栽培地和/或其土 壤，可以发挥防治细菌萎蔫病(bacterial wilt disease)的效果(专利文献1)。粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)(保藏号FERM P-15229)用作黄瓜植物病害的 防治剂，其使用方法包括将该微生物的培养物或者分离的菌体用水悬浮后喷涂于植物的 方法，或者以诸如白粉病(powdery mildew)这样的在茎叶部发生的病害为对象喷涂于茎叶 的方法(专利文献2)。贪噬菌属(Variovorax)细菌CGF45^株(保藏号FERM P-19563)用作十字花 科(Brassicaceae)植物根肿病(clubroot)的防治剂，其使用方法包括育苗时在培土中混 合或灌注该包含所述菌株的防治剂，或者在固定种植到苗圃之前对苗进行浸渍(专利文 献3)。此外，贪噬菌属细菌CGF45^菌株与非病原性胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种 (Erwinia carotovorasubsp. carotovora)细菌的组合也用作十字花科植物根肿病的防治 剂，其使用方法为在育苗时(即移植到主田地(main field)前)施用该防治剂(专利文献 4)。专利文献1 日本特开平9-194314号公报专利文献2 日本特开平9-104606号公报专利文献3 日本特开2005-137330号公报专利文献4 日本特开2007-197421号公报非专利文献 1 Journal of Experimental Botany, (2002) ,53, p. 1177—1185非专利文献2 :Applied Soil Ecology, (2007)，35，p. 502-510

发明内容
发明所要解决的问题本发明的课题是提供具有降低植物体中的重金属含量的功能的细菌，使用该细菌 进行的降低植物体中重金属含量的方法，和含有该细菌作为有效成分的组合物。解决问题的方法
技术领域：
本发明人等为解决上述问题进行了深入研究，结果成功地分离出了具有降低植物 体中的镉等重金属含量的功能的细菌，从而完成了本发明。本发明的要旨如下。〔1〕具有降低植物体中的重金属含量的功能的属于苍白杆菌属(Ochrobactrum)、 /feM^M (Alcaligenes) > W^K K^M (Ralstonia) > ^Bl^M (Variovorax) > ^flf ^M (Cupriavidus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)或寡养单胞菌属(Stenotrophomonas) 的细菌。〔2〕〔1〕所述的细菌，其中，重金属选自镉、铜、铅、铬、镍和砷。〔3〕〔1〕或〔2〕所述的细菌，其为人苍白杆菌(OchrcAactrum anthropi)、木糖氧 化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、角军甘露酉享雷 尔氏菌(Ralstonia mannitolilytica)、皮氏雷尔氏菌(Ralstoniapickettii)、争论贪噬 lif (Variovorax paradoxus) > ^flflii (Cupriavidusnecator)1 lif (Burkholderia cepacia) ^^m^i^WM^^-MM (Stenotrophomonas maltophilia)。〔4〕〔1〕 〔3〕中任一项所述的细菌，其为人苍白杆菌JHA60菌株(保藏号NITE BP-549)、木糖氧化产碱菌JHB14菌株(保藏号NITE BP-550)、粪产碱菌JHClO菌株(保藏 号NITE BP-551)、解甘露醇雷尔氏菌JHG2菌株(保藏号NITE BP-552)、解甘露醇雷尔氏菌 JHL8菌株(保藏号NITE BP-5M)、皮氏雷尔氏菌JHP30菌株(保藏号NITE BP-555)、皮氏雷 尔氏菌JHP55菌株(保藏号NITE BP-557)、争论贪噬菌JHP31菌株(保藏号NITE BP-556) 或钩虫贪铜菌JHJ6菌株(保藏号NITE BP-553)。〔5〕〔1〕 〔4〕中任一项所述的细菌，其固定化在载体上。〔6〕一种降低植物体中的重金属含量的方法，该方法包括将〔1〕 〔5〕中任一项所 述的至少1种细菌施用到植物体的根部或根部周围的土壤。〔7〕〔6〕所述的方法，其中，在从播种起至移植到苗圃后(post-transimplanting) 的时期里进行至少1次施用。〔8〕〔6〕或〔7〕所述的方法，其中，通过将细菌直接施加到根部来进行施用，或者通 过将细菌添加或混合到根部周围的土壤或水培液(hydroponic solution)中来进行施用。〔9〕〔6〕 〔8〕中任一项所述的方法，其中，植物选自茄科(Solanaceae)、禾本科 (Gramineae)、藝禾斗(Polygonaceae)、丑禾斗(Leguminosae)、十字花禾斗(Brassicaceae)、百合 禾斗(Liliaceae)、菊禾斗(Compositae)禾口藜禾斗(Chenopodiaceae)0〔10〕一种用于降低植物体中的重金属含量的组合物，其包含〔1〕 〔5〕中任一项 所述的细菌作为有效成分。在本说明书中，“植物体的根部”是指在栽培植物体时处于土壤中或水培液中来 吸收水分或养分的部分。在本说明书中，“保藏号”是指独立行政法人制品评价技术基础机构(NITE National Institute of Technology and Evaluation) ^MW^MM^(NPMD =NITE Patent Microorganisms D印ositary，邮政编码292-0818，日本国千叶县，木更津市Kazusa 镰足2-5-8)接受本发明细菌的保藏时所赋予的编号(保藏日2008年4月10日)。发明效果本发明的具有降低植物体中重金属含量功能的细菌能够降低植物体中的镉等重金属的含量，对重金属能够具有抗性。此外，本发明可以用于烟草等茄科植物，还可以用于 包含禾本科、蓼科、豆科、十字花科、藜科、百合科、菊科在内的各种植物。而且，通过增加在 植物体的根部、或根部周围的土壤或水培液中施用本发明的细菌或组合物的次数，能够提 高降低植物体中的重金属含量的效果。与菌根真菌相比，本发明的具有降低植物体中重金属含量功能的细菌能够容易地 通过液体培养或其它方式进行大量培养。此外，在建群性方面，菌根真菌会因土壤的成分、 状态或其它条件而受到较大影响，但就细菌而言，与土壤的成分、状态或其它条件相比，可 以认为其所受影响更来自植物的根对养分的供给，本发明细菌具有宽的宿主范围。因此，可 以认为，本发明的细菌在建群到植物上这方面具有高的多样性(versatility)，能够适用于 各种植物。不仅是在温室中，本发明降低植物体中的重金属含量的效果在苗圃中也得到了 确认。本说明书包含作为本申请优先权基础的日本国专利申请2008-141201号的说明 书和/或附图
所记载的内容。发明的
具体实施例方式(1)本发明的细菌本发明的细菌具有降低植物体中的重金属含量的功能，且其属于苍白杆菌 属(Ochrobactrum)、产碱菌属(Alcaligenes)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、贪噬菌属 (Variovorax)、贪铜菌属(Cupriavidus)、伯克霍尔德氏菌属(BurWiolderia)、寡养单胞 菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌 属(FlavcAacterium)或鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)。作为本发明的细菌，具体可 以列举出例如人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、木糖氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、角军甘露酉享雷尔氏菌(Ralstonia mannitolilytica)、皮氏雷尔氏菌(Ralstonia pickettii)、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)、^(虫Hf lif (Cupriavidus necator)、#葱{白 3 尔 惠氏胃(Burkholderia cepacia)和嗜麦芽糖寡养单胞菌(Menotrophomonas maltophilia)等。特别优选为人 苍白杆菌JHA60菌株(保藏号NITE BP-549)、木糖氧化产碱菌JHB14菌株(保藏号NITE BP-550)、粪产碱菌JHClO菌株(保藏号NITE BP-551)、解甘露醇雷尔氏菌JHG2菌株(保藏 号NITE BP-552)、解甘露醇雷尔氏菌JHL8菌株(保藏号NITE BP-5M)、皮氏雷尔氏菌JHP30 菌株(保藏号NITE BP-555)、皮氏雷尔氏菌JHP55菌株(保藏号NITE BP-557)、争论贪噬 菌JHP31菌株(保藏号NITE BP-556)、钩虫贪铜菌JHJ6菌株(保藏号NITE BP-553)。本发明的细菌可以是固定化在载体上的固定化细菌。载体包括可用于细菌的固定 化的公知载体，例如活性炭、硅藻土、沸石、泥煤苔(peat moss)、珍珠岩、膨润土、蒙脱石、蛭 石、氧化铝、硅酸盐、结晶纤维素、玉米淀粉、明胶、藻酸等。通过将细菌吸附在载体上，能够 获得固定化细菌。本说明书中使用的“重金属”是指比重4 5以上的金属元素。对于可利用本发明的细菌降低的重金属，没有特殊限制，可以列举出例如镉、铜、 铅、铬、镍、砷、汞、锰、钴、硒、铋和铁。重金属的优选例子是镉、铜、铅、铬、镍和砷。本发明的细菌可以从苗圃等一般土壤中分离。例如，将除去土壤后的植物 的根加入到缓冲液(例如中性附近的TRIS缓冲液等)中并进行振荡，得到根圈土壤6(rhizospheric soil)的细菌分离用悬浮液。将该悬浮液涂布于添加了镉等重金属的微 生物用培养基(例如Tryptic Soy琼脂培养基等)并培养细菌，对生长繁育出的菌落进行 分离。用添加重金属的培养基和没有添加重金属的培养基对菌落进行培养，比较生长繁育 情况，选择出在重金属添加培养基上生长繁育情况例如相同 稍差程度的重金属抗性细 菌。使对根部施用了选择出的细菌的植物与未施用该细菌的植物在添加重金属的土壤上 进行生长。回收植物，利用例如ICP-MS (高频等离子体质量分析装置)(岛津制作所制， ICPM-8500)等测定植物体中的重金属浓度。与未施用细菌的植物中的重金属浓度进行比 较，当施用了细菌的植物中的重金属浓度显著降低时，该细菌即为具有降低植物体的重金 属含量的功能的细菌。此外，该细菌对重金属有抗性。“对重金属有抗性”是指细菌可以在 重金属的存在下增殖。这样获得的细菌可以采用常规方法增殖。培养优选在好氧条件下进行，在包含无 机盐(磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、铵盐、其它痕量金属盐等)、氮源(氨气、硝酸盐、亚硝酸盐、 氨基酸等)、其它营养源(碱基类等)的无机营养培养基或有机营养培养基等中接种本发明 的细菌，采用振荡培养法、通气搅拌培养法等进行。培养的温度条件只要在所培养的细菌的 生长繁育温度的范围即可，优选可以设定在20 40°C、更优选25 30°C的范围。培养基 的PH只要在所培养的细菌的生长繁育pH区域即可，优选可以设定在pH6. O 8. O、更优选 PH6. 5 7. 5的范围。对于培养时间没有特殊限制，优选为M小时 3天。(2)细菌的鉴定和菌学性质通过下述方式对本发明的细菌进行了鉴定基于形态学性状、基本性状的菌学性 质，利用用于鉴定革兰氏阴性杆菌的试剂盒(BioMe，rieux制，商品名API20NE)进行的生 理/生化学的性状，16S rRNA的碱基序列同源性检索等。本发明的细菌的菌学性质如表1 表7所示。
权利要求
1.具有降低植物体中的重金属含量的功能的属于苍白杆菌属(Ochrobactrum)、产 M^M (Alcaligenes) > W/K K^M (Ralstonia) > ^Bl ^M (Variovorax) > ^fll^M (Cupriavidus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)或寡养单胞菌属(Stenotrophomonas) 的细菌。
2.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述重金属选自镉、铜、铅、铬、镍和砷。
3.根据权利要求1或2所述的细菌，其为人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)、木糖 氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)、粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)、角军甘露酉享雷 尔氏菌(Ralstonia mannitolilytica)、皮氏雷尔氏菌(Ralstonia pickettii)、争论贪噬 lif (Variovorax paradoxus) >^flflii (Cupriavidus necator)1 lif (Burkholderia cepacia) 5 ^^^H^fflif (Stenotrophomonas maltophilia)。
4.根据权利要求1 3中任一项所述的细菌，其为人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)JHA60 菌株(保藏号 NITE BP-549)、木糖氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans) JHB14 菌株(保藏号 NITE BP-550)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis) JHClO 菌株(保藏号 NITE BP-551)、解甘露醇雷尔氏菌(Ralstonia mannitolilytica) JHG2 菌株(保藏号 NITE BP-552)、解甘露醇雷尔氏菌(Ralstonia mannitolilytica) JHL8 菌株(保藏号NITE BP-5M)、皮氏雷尔氏菌(Ralstonia pickettii) JHP30菌株(保藏号 NITE BP-555)、皮氏雷尔氏菌(Ralstonia pickettii) JHP55 菌株(保藏号 NITE BP-557)、 争论贪噬菌(Variovorax paradoxus) JHP31菌株(保藏号NITE BP-556)或钩虫贪铜菌 (Cupriavidus necator) JHJ6 菌株(保藏号 NITE BP-553)。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的细菌，其被固定化于载体上。
6.一种降低植物体中的重金属含量的方法，该方法包括在植物体的根部或根部周围的 土壤施用至少1种权利要求1 5中任一项所述的细菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，在从播种起至将植物移植到苗圃后的时期里至 少进行1次所述施用。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，通过将细菌直接施用到根部、或将细菌添加 或混合在根部周围的土壤或水培液中来进行所述施用。
9.根据权利要求6 8中任一项所述的方法，其中，所述植物选自茄科、禾本科、蓼科、 豆科、十字花科、百合科、菊科和藜科。
10.一种用于降低植物体中的重金属含量的组合物，其包含权利要求1 5中任一项所 述的细菌作为有效成分。
全文摘要
本发明涉及具有降低植物体中的重金属含量的功能的细菌，使用该细菌降低植物体中的重金属含量的方法，和含有该细菌作为有效成分的组合物。
文档编号C12N1/20GK102046778SQ20098011984
公开日2011年5月4日 申请日期2009年5月15日 优先权日2008年5月29日
发明者古贺一治, 增田绅吾 申请人:日本烟草产业株式会社