固定的产物耐受的微生物的制作方法

专利名称：固定的产物耐受的微生物的制作方法
固定的产物耐受的微生物交叉引用本申请要求享有2008年4月9日提交的美国临时专利申请第61/043，710号的权 益，通过引用将其整体并入本文。
背景技术：
在石油化学工业兴起之前，工业规模的发酵在历史上是为溶剂和酸的生产而进行 的。对污染、气候变化和产生的环境退化的关注已更新了兴趣，特别是在低成本或低污染的 生物物质(biomatter)可作为原料利用的领域。在经济上制约更为普及的采用的一个问题 是从通常见于发酵培养液的低浓度回收发酵产物所需的高能耗。由于这些化合物对培养的 微生物的毒性，提高发酵培养液中产物浓度的努力取得了有限的成功。制约基于生物产物 的发酵的经济可行性的另一个问题是发酵过程的生产率。生产率的提高导致设备资本的改 良利用。本发明详述了出人意料的发现，即产生产物的微生物的菌株、环境分离株、或突变 体可以就其同时存在的在固体支持体上生长和耐受高浓度产物的能力而适应或选择，并且 如果产生产物的微生物的这些菌株、环境分离株或突变体被固定在固体支持体上而不是作 为悬浮培养物培养，那么它们在培养物中保留较高的产物耐受性。改进整体培养物生产率 并降低能量利用的较高产物浓度现在是可能的。增加的产物耐受可能依赖于已知抑制剂的 抑制作用降低，所述抑制剂例如HMF、糠醛(fufural)、乙酰丙酸(levulenic acid)、葡糖醛 酸或乙酸，它们可能是由生物体产生的或者存在于最初的进料中。发明概述本发明的一个方面包括一种方法，该方法包括在生产溶剂的发酵工艺中培养固定 在固体支持体上的微生物的步骤，其中所述微生物是突变体并且表现出相比于相应的非突 变微生物的溶剂耐受性至少125%的对溶剂的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微生物表现出至少150%的对溶剂的耐受性。在 该方法的一些实施方案中，突变微生物表现出至少200%的对溶剂的耐受性。在该方法的一 些实施方案中，突变微生物表现出至少250%的对溶剂的耐受性。在该方法的一些实施方案 中，突变微生物表现出至少500%的对溶剂的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微 生物表现出至少1，000%的对溶剂的耐受性。在该方法的一些实施方案中，培养微生物的步骤是在包含容器、固体支持体和生 长培养基的生物反应器中进行的。在该方法的一些实施方案中，微生物包括细菌或真菌。在 该方法的一些实施方案中，微生物包括单个物种。在该方法的一些实施方案中，微生物包括 来自同一物种的菌株的混合培养物。在该方法的一些实施方案中，微生物包括不同物种的 混合培养物。在该方法的一些实施方案中，微生物包括环境分离株。在该方法的一些实施方案中，微生物包括以下属梭菌属(Clostridium)、肠球菌 属(Enterococcus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella) > ILff lifM (Lactobacillus)、或芽孢杆 菌属(Bacilus)。在该方法的一些实施方案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)、紫色梭菌(Clostridiumpuniceum)、！!丁 酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)、尿肠球菌(Enterococcus faecium)、享鸟鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、金黄丁 酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、^？破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)或热角军 H 梭菌 (Clostridium thermosaccharoIyticum)0在该方法的一些实施方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭 菌，并且表现出对至少2%丁醇的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微生物是丙酮 丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表现出对至少2. 5%丁醇的耐受性。在该方法的一 些实施方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在该方法的一些实施 方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表现出对至少5%丁醇 的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭 菌。在该方法的一些实施方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并 且表现出对至少10%丁醇的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微生物是丙酮丁醇 梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表现出对至少12% 丁醇的耐受性。在该方法的一些实施 方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表现出对至少15%丁醇 的耐受性。在一些实施方案中，本方法包括通过使包含突变细胞的发酵培养基循环经过生物 反应器来将突变微生物固定在固体支持体上的步骤。在该方法的一些实施方案中，微生物 处于对数生长状态。在该方法的一些实施方案中，根据在第一固体支持体上的溶剂耐受性对微生物进 行选择，然后将微生物培养在固定的第二固体支持体上。在该方法的一些实施方案中，第一 固体支持体包括琼脂。在该方法的一些实施方案中，在第一固体支持体上选择之前将微生物培养在包含 诱变剂的液体培养基中。在该方法的一些实施方案中，固体支持体包括多孔材料。在该方 法的一些实施方案中，固体支持体包括选自由以下组成的组的材料骨炭、合成聚合物、天 然聚合物、无机材料或有机材料。在该方法的一些实施方案中，固体支持体包括所述组中的 两种或多种材料的复合材料。在该方法的一些实施方案中，固体支持体包含有机材料，包括 原料。在该方法的一些实施方案中，原料包括玉米淀粉或纤维素生物质。在该方法的一些 实施方案中，固体支持体包括细胞生物质或细胞生物质的团聚物。在该方法的一些实施方 案中，固体支持体包括在梅拉德反应过程中形成的有机分子。在一些实施方案中，固体支持 体包括在培养基中形成的有机沉淀。在该方法的一些实施方案中，发酵工艺包括使用串联或平行排列的至少两个生物 反应器。在一些实施方案中，本方法包括在至少两个生物反应器的至少一个中使用悬浮培 养。在该方法的一些实施方案中，至少两个生物反应器的至少一个的发酵工艺是连续培养。 在该方法的一些实施方案中，至少一种连续培养物接收来自另一种培养物的发酵流出液。 在该方法的一些实施方案中，至少一种连续培养物具有比产生发酵流出液的培养物高的溶 剂耐受性。在该方法的一些实施方案中，发酵工艺包括分批培养、补料-分批培养或连续培 养。在该方法的一些实施方案中，发酵工艺包括提取发酵，其中溶剂产物被连续提取。在该 方法的一些实施方案中，发酵工艺是需氧的、厌氧的或微需氧的。在该方法的一些实施方案中，连续培养包括连续加入新鲜培养基，并从培养物中8连续移除发酵流出液。在该方法的一些实施方案中，连续培养包括使突变微生物保持在对 数生长状态中。在该方法的一些实施方案中，固定的突变微生物包括对至少2%丁醇耐受的 梭菌。在该方法的一些实施方案中，溶剂选自由醛、酮或醇组成的组。在该方法的一些实 施方案中，溶剂包括选自以下醛乙醛、丁醛或丙醛。在该方法的一些实施方案中，溶剂包括 选自以下酮丙酮或丁酮。在该方法的一些实施方案中，溶剂包括选自以下醇甲醇、乙醇、 丙醇、异丙醇、丁醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、2，3-丁二醇、2-甲 基-1- 丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-苯基乙醇和丙三醇。本发明的一个方面包括包含生物反应器的系统，所述生物反应器包含与固体支持 体接触的生长培养基和固定在该固体支持体上的微生物，其中所述微生物是突变微生物， 它们表现出与相应的非突变微生物的溶剂耐受性相比至少125%的对溶剂的耐受性。在该系统的一些实施方案中，突变微生物表现出至少150%的对溶剂的耐受性。在 该系统的一些实施方案中，突变微生物表现出至少200%的对溶剂的耐受性。在该系统的一 些实施方案中，突变微生物表现出至少250%的对溶剂的耐受性。在该方法的一些实施方案 中，突变的微生物表现出至少500%的对溶剂的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变 的微生物表现出至少1，000%的对溶剂的耐受性。在该系统的一些实施方案中，生物反应器还包括厌氧的或微需氧的环境。在一些 实施方案中，该系统包括至少一个其他的生物反应器，其中这些生物反应器被串联或平行 排列。在一些实施方案中，该系统包括至少两个生物反应器，所述生物反应器包含来自不同 物种的微生物或来自同一物种的不同菌株。在一些实施方案中，该系统包括包含悬浮的微 生物的至少一个生物反应器和包含固定的微生物的至少一个生物反应器。在一些实施方案 中，该系统包含串联排列的两个生物反应器，其中来自串联的第一生物反应器的流出液构 成第二生物反应器的原料流。在一些实施方案中，该系统适合于分批培养、补料-分批培养或连续培养。在一些 实施方案中，该系统适合于提取发酵，其中溶剂产物被连续提取。在一些实施方案中，该系 统包括用于将微生物保持在连续培养物中的装置。在该系统的一些实施方案中，发酵工艺 是连续培养，还包括在溶剂纯化过程中回收的发酵培养液的养分和矿物质的再循环和再利用。在该系统的一些实施方案中，根据在第一固体支持体上的溶剂耐受性对微生物进 行选择，然后将微生物培养在固定的第二固体支持体上。在该系统的一些实施方案中，第一 固体支持体包括琼脂。在该系统的一些实施方案中，在第一固体支持体上选择之前将微生 物培养在包含诱变剂的液体培养基中。在该系统的一些实施方案中，固体支持体包括多孔材料。在该系统的一些实施方 案中，固体支持体包括选自由以下组成的组的材料骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材 料或有机材料。在该系统的一些实施方案中，固体支持体包含有机材料，包括原料。在该系 统的一些实施方案中，固体支持体包含原料，原料包括玉米淀粉或纤维素生物质。在该系统 的一些实施方案中，固体支持体包括所述组中的两种或多种材料的复合材料。在该系统的一些实施方案中，微生物包括细菌和/或真菌。在该系统的一些实施 方案中，微生物包括单个物种。在该系统的一些实施方案中，微生物包括来自同一物种的菌株的混合培养物。在该系统的一些实施方案中，微生物包括不同物种的混合培养物。在该 系统的一些实施方案中，由微生物的一个物种或混合培养物种产生的发酵培养物被转移至 包含不同物种或混合培养物种的另一发酵培养物中。在该系统的一些实施方案中，微生物包括以下属梭菌属、肠球菌属、克雷伯氏菌 属、乳杆菌属或芽孢杆菌属。在该系统的一些实施方案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏 梭菌、紫色梭菌、糖丁酸梭菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、金黄丁酸梭菌、假破伤风梭菌或热解 糖梭菌。在该系统的一些实施方案中，突变的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌。在该 系统的一些实施方案中，突变的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表现出对至少 2%丁醇的耐受性。在该系统的一些实施方案中，突变的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭 菌，并且表现出对至少2. 5%丁醇的耐受性。在该系统的一些实施方案中，突变的微生物是 丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表现出对至少5%丁醇的耐受性。在该系统的一些实施 方案中，突变的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表现出对至少10% 丁醇的耐受 性。在该系统的一些实施方案中，突变的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表现出 对至少12%丁醇的耐受性。在该系统的一些实施方案中，突变的微生物是丙酮丁醇梭菌或 糖丁酸梭菌，并且表现出对至少15% 丁醇的耐受性。在本发明的一个方面，提供了用于在生物反应器中制备产物的方法，该方法包括 i)培养微生物，所述微生物被适应或诱变使得表现出与相应非适应的或非诱变的微生物的 产物耐受性相比对产物至少150%的产物耐受性；和ii)收获所述产物。在一些实施方案 中，适应的微生物或突变的微生物表现出对产物至少200%的耐受性、对产物至少500%的 耐受性或对产物至少1000%的耐受性。在本发明的一些实施方案中，微生物包括细菌或真菌。在一些实施方案中，微生物 包括单个物种，而在其他实施方案中微生物包括来自同一物种或不同物种的菌株的混合培 养物。在一些实施方案中，微生物处于对数生长状态。在一些实施方案中，微生物包括以下属梭菌属、肠球菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌 属或芽孢杆菌属。在其他实施方案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌、糖丁 酸梭菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、金黄丁酸梭菌、假破伤风梭菌或热解糖梭菌。在一些实施方 案中，这些梭菌属物种产生丁醇。在其他实施方案中，丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭 菌表现出对至少2%丁醇、至少2. 5%丁醇、至少5%丁醇、至少10%丁醇、至少12%丁醇或 至少15% 丁醇的耐受性。在一些实施方案中，微生物被固定在固体支持体上。在其他实施方案中，通过使包 含适应的细胞或突变的细胞的发酵培养基循环经过生物反应器来完成固定。在一些实施方 案中，循环的发酵培养基包含固定在固体支持体上的适应的微生物或突变的微生物。在一些实施方案中，根据在第一固体支持体上的产物耐受性对微生物进行选择， 然后将微生物培养在固定的第二固体支持体上。在一些实施方案中，第一固体支持体包括 琼脂。在一些实施方案中，与在液体培养基中表现出的产物耐受性相比，微生物在固体支持 体上表现出增强的产物耐受性。在其他实施方案中，固体支持体是半固体或固体。在其他实 施方案中，固体支持体包括多孔材料。仍在其他实施方案中，固体支持体包括选自由以下组 成的组的材料骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。在一些实施方案中，固体支持体包括所述组中的两种或多种材料的复合材料。在其他实施方案中，固体支持体 包含有机材料，包括原料。在其他实施方案中，原料包括玉米淀粉或纤维素生物质。在其他 实施方案中，有机物包括细胞生物质或细胞生物质的团聚物。在另一实施方案中，有机物包 括在原料准备过程中和/或在发酵过程中形成的沉淀。仍在其他实施方案中，固体支持体 包括在梅拉德反应过程中形成的有机分子。在一些实施方案中，培养步骤包括使用串联或平行排列的至少两个生物反应器。 在一些实施方案中，在所述至少两个生物反应器中包括至少一个悬浮培养。在其他实施方 案中，在至少两个生物反应器的至少两个中使用固定的培养物。在其他实施方案中，至少两 个生物反应器中的至少一个是连续培养。在其他实施方案中，至少一种连续培养物接收来 自另一种培养物的发酵流出液。仍在其他实施方案中，至少一种连续培养物具有比产生发 酵流出液的培养物更高的产物耐受性。在一些实施方案中，培养步骤包括以分批培养、补料-分批培养或连续培养而培 养微生物。在其他实施方案中，培养步骤是在填充床生物反应器或流化床生物反应器中进 行的。仍在其他实施方案中，流化床生物反应器是一种膨胀床生物反应器。在一些实施方 案中，培养步骤是在适合于以填充床或流化床模式操纵的生物反应器中进行的。在一些实施方案中，生物反应器包括a)填充床区，所述填充床区适合于容纳固 体支持体；b)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操纵所述 生物反应器时，所述床膨胀区适合于容纳所述固体支持体；和c)颗粒脱离区(particle disengagement zone)，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止 所述固体支持体从所述生物反应器中出去。在一些实施方案中，生物反应器还包括与填充床区接合的入口分配区。在其他实 施方案中，柱还包括柱膨胀区。在其他实施方案中，生物反应器在入口分配区具有的压力降 不超过跨生物反应器整个长度总压力降的30%。在其他实施方案中，颗粒脱离区的直径比 填充床区或膨胀床区的直径大。在一些实施方案中，连续培养包括连续加入新鲜培养基并 从培养物中连续移除发酵流出液。在其他实施方案中，连续培养包括将适应的微生物或突 变的微生物保持在对数生长状态。在一些实施方案中，微生物包括对至少2%丁醇耐受的梭菌属物种。在其他实施 方案中，培养步骤是在厌氧、微需氧或需氧条件下进行的。在一些实施方案中，产物选自由 有机酸、醛、酮或醇组成的组。在其他实施方案中，有机酸选自甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸、 琥珀酸、己二酸或氨基酸。仍在其他实施方案中，醛选自乙醛、丁醛或丙醛。在其他实施方 案中，酮选自丙酮或丁酮。仍在其他实施方案中，醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、 1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、1，3-丙二醇、2，3_丙二醇、2，3_ 丁二醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲 基-1-丁醇、2-苯基乙醇和丙三醇。在其他实施方案中，产物是选自由以下组成的组的抑制 性产物5-羟甲基糠醛、糠醛、乙酸、葡糖醛酸(glucouronic acid)以及乙酰丙酸。在一些实施方案中，收获步骤包括连续从培养物中提取产物。在其他实施方案中， 连续提取是使用汽提气、溶剂、吸收材料、全蒸发膜或蒸馏进行的。在一些实施方案中，培养步骤包括在提供至少6g/L/小时、至少8g/L/小时或至少 10g/L/小时的丁醇生产率的条件下培养丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些实 施方案中，培养步骤包括在提供至少10g/L/小时或至少13g/L的总溶剂生产率的条件下培养丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些实施方案中，每天生产至少1000升的丁 醇或者每天产生至少1500升的总溶剂。在一些实施方案中，培养步骤包括培养至少7天或至少30天。在一些实施方案中，微生物包含异源基因。在其他实施方案中，异源基因编码在产 物生物合成途径中的酶。仍在其他实施方案中，酶选自由以下组成的组磷酸转乙酰酶、乙 酸激酶、NAD依赖性β羟丁酰辅酶A脱氢酶、丁酰辅酶A脱氢酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、 乙酰辅酶A乙酰转移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、NADH依赖性丁醇脱氢酶B、NADH依赖 性丁醇脱氢酶Α、醛-醇脱氢酶、乙酰辅酶A乙酰转移酶、醛脱氢酶、丁酸乙酰乙酸辅酶A转 移酶A亚基、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶B亚基和乙酰乙酸脱羧酶。一方面，提供了用于制备产物的系统，所述系统包括生物反应器，所述生物反应器 包含a)与固体支持体接触的生长培养基；b)固定在所述固体支持体上的微生物，其中微 生物被适应或诱变以表现出与相应的非适应的或非诱变微生物的产物耐受性相比对产物 至少150 %的产物耐受性。在一些实施方案中，适应的微生物或突变的微生物表现出对产物 至少200%的耐受性、至少500%的耐受性或至少1000%的耐受性。在一些实施方案中，微 生物包括以下属梭菌属、肠球菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属或芽孢杆菌属。在其他实施方 案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌、糖丁酸梭菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、 金黄丁酸梭菌、假破伤风梭菌或热解糖梭菌。仍在其他实施方案中，适应的微生物或突变的 微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些实施方案中，产物是丁醇。在其他 实施方案中，微生物是对至少2%丁醇、对至少2. 5%丁醇、对至少5% 丁醇或对至少10%丁 醇表现出耐受性的丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些实施方案中，微生物包含异源基因。在其他实施方案中，异源基因编码在产 物生物合成途径中的酶。仍在其他实施方案中，酶选自由以下组成的组磷酸转乙酰酶、乙 酸激酶、NAD依赖性β羟丁酰辅酶A脱氢酶、丁酰辅酶A脱氢酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、 乙酰辅酶A乙酰转移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、NADH依赖性丁醇脱氢酶B、NADH依赖 性丁醇脱氢酶Α、醛-醇脱氢酶、乙酰辅酶Α、乙酰转移酶、醛脱氢酶、丁酸乙酰乙酸辅酶A转 移酶A亚基、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶B亚基和乙酰乙酸脱羧酶。在一些实施方案中，该系统包括用于将微生物保持在连续培养物中的装置。在一 些实施方案中，发酵工艺是连续培养，还包括在产物纯化过程中回收的发酵培养液的养分 和矿物质的再循环和再利用。在其他实施方案中，与在液体支持体中表现出的产物耐受性 相比，微生物在固体支持体上表现出增强的产物耐受性。在一些实施方案中，固体支持体包 括多孔材料。在其他实施方案中，固体支持体包括选自由以下组成的组的材料骨炭、合成 聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。在其他实施方案中，固体支持体包含有机材料， 包括原料。在一些实施方案中，产物选自由有机酸、醛、酮或醇组成的组。在其他实施方案中， 有机酸选自甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、己二酸或氨基酸。在其他实施方案中，醛 选自乙醛、丁醛或丙醛。仍在其他实施方案中，酮选自丙酮或丁酮。在一些实施方案中，醇 选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、2， 3- 丁二醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-苯基乙醇和丙三醇。在该系统的一些实施方案中，在提供至少6g/L/小时、至少8g/L/小时或至少IOg/L/小时的丁醇生产率的条件下培养丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些实施方 案中，在提供至少10g/L或至少13g/L的总溶剂滴度的条件下培养丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭 菌或拜氏梭菌。在一些实施方案中，该系统每天生产至少1000升的丁醇或者每天产生至少 1500升的总溶剂。—方面，提供了生物反应器，所述生物反应器包括a)填充床区，所述填充床区适 合于容纳固体支持体；b)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式 操纵所述生物反应器时，所述床膨胀区适合于容纳所述固体支持体；和c)颗粒脱离区，所 述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止所述固体支持体从所述生 物反应器中出去。在一些实施方案中，所述填充床区和所述床膨胀区的结合高度(combined height) (H)与填充床区的高度(Hp)之比大于1. 01、1. 05、1. 10、1. 15或1. 20。在一些实施方案中，生物反应器还包括适合于安放在床膨胀区和颗粒脱离区之间 的柱膨胀区，其中柱膨胀区的上游端与床膨胀区接合，并且柱膨胀区的下游端与颗粒脱离 区接合。在一些实施方案中，柱膨胀区包括距水平线向上倾斜至少10°或至少30°的倾斜 角度。在一些实施方案中，生物反应器还包括与颗粒脱离区接合的气体-液体分离区。在 一些实施方案中，生物反应器被设置成以填充床模式或以膨胀床模式操纵。在其他实施方 案中，生物反应器还被设置成在填充床模式和膨胀床模式的操作之间交替。在一些实施方 案中，生物反应器能够连续发酵至少100小时、至少500小时或至少1000小时。在一些实施方案中，固体支持体是半固体或固体。在其他实施方案中，固体支持体 包括多孔材料。在其他实施方案中，固体支持体包括至少50m2/g的表面积。仍在其他实施 方案中，固体支持体包括至少0. 3g/cm3的堆密度。在其他实施方案中，固体支持体包括至 少60的球盘硬度数。在其他实施方案中，固体支持体包括至少20MaP的屈服强度。在一些实施方案中，固体支持体包括选自由以下组成的组的材料骨炭、合成聚合 物、天然聚合物、无机材料或有机材料。在其他实施方案中，固体支持体包括所述组中的两 种或多种材料的复合材料。在其他实施方案中，固体支持体包含有机材料，包括原料。仍在 其他实施方案中，原料包括玉米淀粉、纤维素生物质、细胞生物质、细胞生物质的团聚物、在 原料准备过程中和/或在发酵过程中形成的沉淀、或者在梅拉德反应过程中形成的有机分 子。一方面，提供了用于在固体支持体上发酵生物学产物的生物反应器，所述生物反 应器包括a)填充床区，包括其中的固体支持体，所述固体支持体包括其上用于发酵所述 生物学产物的微生物；b)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式 操纵所述生物反应器时，所述床膨胀区适合于容纳所述固体支持体；和c)颗粒脱离区，所 述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止所述固体支持体从所述生 物反应器中出去。在一些实施方案中，所述填充床区和所述床膨胀区的结合高度(H)与填 充床区的高度(Hp)之比大于1. 01,1. 05,1. 10,1. 15或1. 20。在一些实施方案中，生物反应器还包括适合于安放在床膨胀区和颗粒脱离区之间 的柱膨胀区，其中柱膨胀区的上游端与床膨胀区接合，并且柱膨胀区的下游端与颗粒脱离 区接合。在一些实施方案中，柱膨胀区包括距水平线向上倾斜至少10°或至少30°的倾 斜角度。在一些实施方案中，生物反应器还包括与颗粒脱离区接合的气体-液体分离区。在13一些实施方案中，生物反应器被设置成以填充床模式或以膨胀床模式操纵。在一些实施方 案中，生物反应器还被设置成在填充床模式和膨胀床模式的操作之间交替。在一些实施方 案中，生物反应器能够连续发酵至少100小时、至少500小时或至少1000小时。在一些实施方案中，微生物包括以下属梭菌属、肠球菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌 属或芽孢杆菌属。在其他实施方案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌、糖丁 酸梭菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、金黄丁酸梭菌、假破伤风梭菌或热解糖梭菌。在一些实施方案中，微生物生产丁醇。在其他实施方案中，丙酮丁醇梭菌、糖丁酸 梭菌或拜氏梭菌表现出对至少2%丁醇、至少2. 5%丁醇、至少5%丁醇或至少10%丁醇的 耐受性。在一些实施方案中，通过使包含微生物的发酵培养基循环经过生物反应器来将微 生物固定在固体支持体上。在其他实施方案中，循环的发酵培养基包含固定在颗粒上的微 生物。在一些实施方案中，微生物处于对数生长状态。在一些实施方案中，固体支持体是半固体或固体。在另外的实施方案中，固体支持 体包括多孔材料。仍在另外的实施方案中，固体支持体包括选自由以下组成的组的材料骨 炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。在一些实施方案中，固体支持体包括所 述组中的两种或多种材料的复合材料。在其他实施方案中，固体支持体包含有机材料(包 括原料)、细胞生物质、细胞生物质的团聚物，有机物，包括在原料准备过程中和/或在发酵 过程中形成的沉淀，或在梅拉德反应过程中形成的有机分子。在另外的实施方案中，原料包 括玉米淀粉或纤维素生物质。在本发明的一个方面，提供了用于制备生物学产物的方法，所述方法包括a)将 微生物培养在生物反应器中，所述生物反应器包括i)填充床区，包括其中的固体支持体， 所述固体支持体包括其上用于发酵所述生物学产物的微生物；ii)床膨胀区，所述床膨胀 区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操纵所述生物反应器时，所述床膨胀区适合于容 纳所述固体支持体；和iii)颗粒脱离区，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒 脱离区适合于防止所述固体支持体从所述生物反应器中出去；以及b)收获产物。附图简述

图1是显示双盘诱变测定(double disc mutagenesis assay)的配置的图片。图2A显示在各个时间点和丁醇浓度的0D_测量结果。图2B显示按1 20接种的起始培养物的0D_测量结果。图3是显示在每种丁醇浓度(0% -1. 6%丁醇)的液体培养基中Co-5673随时间 生长的图。图4是显示在每种丁醇浓度(0% -1. 6%丁醇)的液体培养基中Co-0124随时间 生长的图。图5是显示在每种丁醇浓度(0% -1. 6%丁醇)的液体培养基中Co-7449随时间 生长的图。图6A是显示分析三种菌株Co-5673、Co-7449和Co-OlM在固体培养基(P2+4% 木糖)上在M小时的丁醇耐受的表。观察到的生长表明了丁醇耐受性。图6B是在M小时的时间点，在液体培养基中和在固体培养基上生长的三种菌株 的丁醇耐受性的比较。
图7A是显示分析三种菌株Co-5673、Co-7449和Co-OlM在固体培养基(P2+4% 木糖)上在96小时的丁醇耐受性的表。观察到的生长表明了丁醇耐受。图7B是在96小时的时间点，在液体培养基中和在固体培养基上生长的三种菌株 的丁醇耐受性的比较。图8用图说明包括串联排列的具有悬浮的细胞的生物反应器和具有固定的细胞 生物反应器的系统。将培养基引入到悬浮的细胞的生物反应器中，将发酵流出液移出并连 同另外的培养基一起引入到固定细胞生物反应器中。固定细胞生物反应器包含具有丁醇耐 受性、表现出提高的产物耐受性的分离的、适应的菌株或突变体，它们能够利用培养基中的 残余基质，产生高浓度的产物。然后将发酵流出液移出并送往分离和回收。图9A是包括具有不同大小的目、沉降速度(cm/s)以及等效直径(μ m)的骨炭颗 粒的三个实例的表。图9B是使用终端沉降速度，5X8型骨炭在4%葡萄糖溶液中的等效直径的图示。图IOA是显示以5X8型骨炭在4%葡萄糖溶液中的不同等效直径，经一定范围的 空隙率计算出的最小流化速度(Umf)的表。图IOB是显示对5X8型骨炭的不同等效直径，经一定范围的空隙率计算出的最小 流化速度(Umf)的图示。图IlA是显示以IOX^型骨炭在4%葡萄糖溶液中的不同等效直径，经一定范围 的空隙率计算出的最小流化速度(Umf)的表。图IlB是显示对10父观型骨炭的不同等效直径，经一定范围的空隙率计算出的最 小流化速度(Umf)的图示。图12A是显示以20X60型骨炭在4%葡萄糖溶液中的不同等效直径，经一定范围 的空隙率计算出的最小流化速度(Umf)的表。图12B是显示对20X60型骨炭的不同等效直径，经一定范围的空隙率计算出的最 小流化速度(Umf)的图示。图13A显示了用于计算5X8型骨炭的床膨胀水平的参数。结果是膨胀床高度比 填充床高度的比率形式(H/Ht_)。图1 是5X8型骨炭的床膨胀的图示。图14A显示了用于计算IOX^型骨炭的床膨胀水平的参数。结果是膨胀床高度 比填充床高度的比率形式(H/Ht_)。图14B是IOX^型骨炭的床膨胀的图示。图15A用图说明了用于计算20X60型骨炭的床膨胀水平的参数。结果是膨胀床 高度比填充床高度的比率形式(H/Ht_)。图15B是20X60型骨炭的床膨胀的图示。图16用图说明了确定填充区的高度、床膨胀区的高度和实现5X8型骨炭流化的 液体流动速率的设计计算。图17用图说明了确定填充区的高度、床膨胀区的高度和实现IOX^型骨炭流化 的液体流动速率的设计计算。图18用图说明了确定填充区的高度、床膨胀区的高度和实现20X60型骨炭流化 的液体流动速率的设计计算。
图19用图说明了样品反应器概念。图20是显示被收集以支持生物反应器的设计和建模的实验数据的表。图21是固定细胞生物反应器的配置和控制的方案。图22显示Co-7449在IOOmL固定细胞生物反应器中连续发酵的过程中所获得的 数据的实验踪迹。图23显示Co-7449在IOOOmL固定细胞生物反应器中连续发酵的过程中所获得的 数据的实验踪迹。图M显示Co-5673在IOOOmL固定细胞生物反应器中连续发酵的过程中所获得的 数据的实验踪迹。图25显示Co-7449在IOOOmL固定细胞生物反应器中连续发酵的过程中所获得的 数据的实验踪迹。图沈显示Co-5673在IOOOmL固定细胞生物反应器中连续发酵的过程中所获得的 数据的实验踪迹。图27是概括在固定细胞生物反应器中连续产生丁醇的过程中获得的实验数据的 图表。图观是小试规模固定细胞的填充床生物反应器工艺设计/控制的方案(具有生 物反应器温度指示器控制)。图四是小型规模(mini-pilot)工艺流-上游加工的方案(没有收获罐的固定细 胞的填充床生物反应器)。MF代表微量过滤，例如切向流过滤。发明详述本发明提供了用于提高从微生物的培养物中生产产物的总产率的方法和材料。所 述方法是通过在半固体或固体支持体上适应或选择微生物实现的，所述微生物显示出对产 物的高耐受性，所述产物包括有机酸，像乙酸和丁酸，以及溶剂，例如醇、醛和酮。然后在产 生产物的条件下将微生物培养在生物反应器中的半固体或固体支持体上，在其中所选择的 微生物出人意料地保持其对产物的耐受性，并且表现出与起始的一种或多种微生物母体原 料相比至少大125%的对具体产物的耐受性。本发明的微生物包括细菌和真菌。本发明的 微生物可以来源于最近从环境分离的微生物、来源于已知培养物、突变体或来源于被遗传 修饰的培养物。在一些实施方案中，使用来自同一物种的不同菌株的混合培养物或不同物 种的混合培养物。本发明考虑使用这些方法来生产沿着生物化学途径、代谢途径、合成途径或发酵 途径所产生的产物。本发明适用于任何生产产物的途径，不论是天然存在的、部分遗传工程 的或完全遗传工程的途径。本发明还包括微生物，其中在将中间产物从生产产物的途径中 占用的竞争途径中一种或多种基因的表达被敲除或工程化以具有减少的表达。天然存在的 生产有机酸的发酵途径的一个实例是乳杆菌属物种的同型乳酸发酵途径。天然存在生产溶 剂的发酵途径的实例是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的乙醇途径。溶剂途径的 另一实例是丙酮丁醇梭菌的丁醇途径。部分遗传工程发酵途径的实例是工程化到大肠杆菌 中的乙醇途径。部分遗传工程合成途径的实例是工程化到大肠杆菌中的四碳醇途径。M本发明的方法可用于生产有机酸。这些有机酸包括，例如甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸、琥珀酸和其他二羧酸、己二酸以及氨基酸。通过微生物生产可用作食品或药品添加 剂、或工业化学品的有机酸是特别令人感兴趣的。mM本发明的方法可用于生产工业溶剂。这些工业溶剂包括，例如醇(乙醇、丁醇、丙 醇、异丙醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、1，2-丁二醇、2，3-丁二醇、1，2，4-丁三 醇、1，2-戊二醇、1，2-己二醇、丙三醇、正戊醇及其异构体、正己醇及其异构体、正庚醇及其 异构体、正辛醇及其异构体)，醛(乙醛、丁醛)以及酮(丙酮、丁酮)。通过微生物生产可 用作燃料和工业化学品的溶剂是特别令人感兴趣的。在一些实施方案中，本发明的方法可 用于通过丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌或糖丁酸梭菌增加高价值的生物燃料丁醇的 生产。其他适应或诜择的耐警件本文的方法也可以用于分离适应的微生物或选择的微生物，所述微生物具有对发 酵途径、代谢途径、呼吸途径或合成途径中生产的中间物质的提高的耐受性。另外，提高的 产物耐受性可以是间接的并且可以依赖抑制剂的降低的抑制作用，所述抑制剂包括但不限 于HMF、糠醛、乙酰丙酸、葡糖醛酸、自溶素或乙酸。抑制剂可以由生物体产生，或者可以存 在于最初的进料中。抑制剂或抑制性物质可以沿着发酵途径、代谢途径、呼吸途径或合成途 径形成。对抑制剂提高的耐受性可以提高期望产物例如乙醇、丁醇等等的生产率。在一个 实施方案中，与未适应的微生物或未诱变的微生物以及选择的微生物相比实现对抑制剂提 高的耐受性，所述抑制剂选自由HMF、糠醛、乙酰丙酸、葡糖醛酸和乙酸组成的组。发酵途径发酵途径是厌氧进行的代谢途径，其中有机分子而非氧作为末端电子接受体起作 用，如在需氧条件下氧化磷酸化所发生的那样。糖酵解是在细菌(丙酮丁醇梭菌和大肠杆 菌)和酵母中的广泛的发酵途径的实例。在糖酵解过程中，细胞将单糖例如葡萄糖转化成 丙酮酸，同时净产生ATP和NADH。在再生NAD+的短途径中消耗至少95%丙酮酸，NAD+是用 于持续的糖酵解和ATP生产的专性需求物。这些NAD+再生系统的废物或终产物被称为发 酵产物。取决于生物和培养条件，丙酮酸最终被转化成诸如有机酸(甲酸、乙酸、乳酸、丙酮 酸、丁酸、琥珀酸和其他二羧酸)和中性溶剂(乙醇、丁醇、丙酮、1，3_丙二醇、2，3_丙二醇、 乙醛、丁醛、2，3-丁二醇)等终产物。基于以下发酵终产物，TIGR的综合微生物资源(CMR)在其图册集列出九种类型发 酵途径同型乳酸(乳酸)；异型乳酸(乳酸)、乙醇(ethanolic)、丙酸、混合酸(甲酸和乙 酸)、丁二醇、丁酸、氨基酸和产甲烷作用。本发明的方法可以用在任何发酵途径中，其中在 所述途径的任何阶段产生酸或溶剂。本发明中描述的发酵途径可以是天然存在的、通过化 学诱变改变的、半遗传工程化或完全遗传工程化的发酵途径。生产溶剂的发酵途径天然的通过公知的糖酵解途径，酵母将一个己糖分子转化成两个乙醇分子和两个二氧化 碳分子。许多梭菌属物种通过发酵生产溶剂。在丙酮丁醇梭菌中，以按重量大致3 :6:1 的比率产生溶剂丙酮、丁醇和乙醇(ABE)。其他作为中间产物产生的溶剂包括乙醛和丁醛。
遗传工稈化大肠杆菌ZM细菌大肠杆菌当厌氧生长时由于其缺乏酶丙酮酸脱羧酶而产生最少水平的乙 醇。通过表达从运动发酵单胞菌(Z.mobilis)中克隆的醇脱氢酶II(adhB)和丙酮酸脱 羧酶(pdc)可以在大肠杆菌中产生半遗传工程发酵的乙醇途径(Conway等人.(1987a) J.Bacterid 169 :2591-2597 ;Neale 等人.(1987)Nucleic Acids Res.15 :1752-1761 ； Ingram 和 Conway [1988] Appl. Environ. Microbiol. 54 :397-404 ；Ingram 等人· (1987) App 1. Environ. Microbiol. 53 :2420-2425)。乙醇生产率直接与运动发酵单胞菌产乙醇基 因的表达水平相对应。该方法的通用性后来在两种其他肠道细菌菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)和植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)中证明。(Tolan 和 Finn. Appl. Environ. Microbiol. 53 :2033-2038, 2039-2044，1987 ；Beall 等人·，1993 ；Ingram 和 Conway,1988 ；Wood 禾口 Ingram，1992.)4碳醇和高级醇通过利用细菌的氨基酸生物合成途径，可以将包括异丁醇、1- 丁醇、2-甲基-1- 丁 醇、3-甲基-1- 丁醇和2-苯基乙醇在内的高级醇表达在大肠杆菌中。通过将见于艾利希途 径最后两步中的两种异源酶2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的表达遗传工程化，可以将该途径 中产生的2-酮酸中间产物转换成醇产品。(Shota A.，等人.Non-fermentative pathways for synthesis of branched—chain higher alcohols as biofuels(用于合成作为生物燃 料的支链高级醇的非发酵途径).Nature，第451/3卷2008年1月.)微生物本发明提供了与对应的非突变微生物的产物耐受性相比具有提高的产物耐受性 的菌株、环境分离株和突变微生物的适应或选择。所公开的方法学适用于广泛范围的微 生物，包括细菌和真菌。本文的方法也可以用于适应或选择微生物的粘附或生长于且附 于所选择的固体支持体的能力。微生物被接种或放置在具有基质的固体支持体上并且被 培养。使培养物经历一个或多个循环，在循环中漂洗固体支持体以除去未粘附或粘附弱 的微生物，接着加入更多培养基以允许剩余微生物增加其数目。那些表现出在固体支持 体上增强或快速生长的微生物被选择并储存供后面使用。可以通过对于提高产物耐受性 进行的适应或诱变和选择来进一步改良挑出的分离株。还可以转化挑出的分离株以表 达赋予提高的产物耐受性或提高产物生产的异源基因。在一些实施方案中，微生物是真 菌并且真菌是酵母。酵母的实例包括但不限于酿酒酵母、贝酵母(S.bayanus)、卡氏酵母 (S. carlsbergensis)、摩纳酵母(S. Monacensis)、巴氏酵母(S. Pastorianus)、葡萄汁酵母 (S. uvarum)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)物种。厌氧或耐氧真菌的其他实例包括但不 限于属Neocallimastix、Caecomyces、Piromyces禾口其他瘤胃来源的厌氧真菌。在一些实施方案中，微生物是细菌。本发明涵盖的细菌包括革兰氏阴性细菌 和革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性细菌的非限制性实例包括见于以下属的细菌葡萄球 菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、分枝杆 菌属(Mycobacterium)、肠球菌属(Enterococcus) > If lif M (Lactobacillus)、明串珠 菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)禾口丙酸杆菌属(Propionibacterium)0 具体的种的实例包括屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarium)。革兰氏阴性细菌的非限制实例包括见于以下属的细菌假单胞菌属 (Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、螺旋体属(Spirochaeta)、甲基弯曲 菌属(Methylosinus)、泛菌属(Pantoea)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属 (Gluconobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)禾口欧文菌属(Erwinia)0在一些实施方案中，细菌是严格的厌氧菌或专性的厌氧菌诸如丙酮丁醇梭菌。 考虑用于本发明的丙酮丁醇梭菌的菌株包括来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的野 生型菌株诸如ATCC 43084和ATCC 824，以及来自德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany)的 DSM 792 禾口 DSM 1731。考虑用于本发明的丁醇高产菌株丙酮丁醇梭菌包括来自ATCC的菌株诸如ATCC 55025和ATCC 39058。另一种考虑用于本发明的高产菌株是B643。(Contag，P. R.，等人， Cloning of a lactate dehydrogenase gene from Clostridium acetobutylicum B643 and expression in Escherichia coli (从丙酮丁醇梭菌B643克隆乳酸脱氢酶基因和在大 肠杆菌中表达)· Appl. Environ. Microbiol. 56 :3760-3765,1990.)尽管最初被鉴定为丙酮 丁醇梭菌，B643现在被分类为糖丁酸梭菌。考虑用于本发明的另一高产菌株是来源于B643 的B18(Rogers,P.禾口Palorsaari,N. Clostridium acetobutylicum mutants that produce butyraldehyde and altered quantities of solvents (产生丁酸禾口改变的量的溶齐[J的丙 酮丁醇梭菌突变体).Appl. Environ. Microbiol. 53 :2761-2766,1987)。考虑用于本发明的梭菌属的其他实例包括拜氏梭菌(例如ATCC25752、ATCC51743 ^P BAlOU ATCC PTA 1550 (U. S 6，358，717 和美国申请第 10/945，551 号))、紫色梭菌(例 如 ATCC 43978)或糖丁酸梭菌(例如 ATCC BAA-117 或 Co-7449)。考虑用于本发明的梭菌属物种的其他实例可以选自金黄丁酸梭菌 (C. aurantibutyricum) > T Sl It ^ (C. butyricum) ,M^f M^M (C. eel lulolyticum)、 土壤栖梭菌(C. phytofermentans)、解糖梭菌(C. saccharolyticum)、糖乙酸多丁 酉享 菌(C. saccharoperbutylacetonicum)、{[Μ 破伤风 菌(C. tetanomorphum)、丁酸梭菌(C. thermobutyricum)、热纤梭菌(C. thermocellum)、糖乙酸多丁醇梭菌 (C. saccharoperbuty lacetoni cum) 5 ! 11 (C. thermo saccharo Iyti cum)。考虑用于本发明的其他细菌包括棒状杆菌属(Corynekicteria)，诸如白喉 棒状杆菌(C. diphtheriae)；月市炎球菌(Pneumococci),诸如月市炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)；链球菌属(Mr印tococci)，诸如酿脓链球菌(S. pyogenes)和唾液链球菌 (S. salivarus)；葡萄球菌属Staphylococci)，诸如金黄色葡萄球菌(S. aureus)和白色 葡萄球菌(S. albus)；肌病毒科(Myoviridae)；长尾噬菌体科(Siphoviridae)；需氧的 芽孢形成杆菌，芽孢杆菌属(Bacilli)，诸如炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)、枯草芽孢杆菌 (B. subtilis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、蜡状芽孢杆菌(B. cereus)；溶纤维丁酸 弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)；厌氧的芽孢形成杆菌，分枝杆菌(Mycobacteria), 诸如人结核分枝杆菌(M. tuberculosis hominis)、牛分支杆菌(M. bovis)、鸟分枝 杆菌(M. avium)、畐Ij 结核分枝杆菌(M. paratuberculosis)；方文线菌(Actinomycetes) (真菌样细菌)，诸如衣氏放线菌(A. israelii)、牛型放线菌(A. bovis)、内氏放线 菌(A. naeslundii)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、巴西诺卡氏菌(Nocardia19brasiliensis)；螺旋体(Spirochetes)，苍白密螺旋体(Treponema pallidium)、极细密 螺旋体(Treponema pertenue)、斑点病密螺旋体(Treponema carateum)、回归热疏螺旋 体(Borrelia recurrentis)、出血黄||[钩端 累旋体(Leptospira icterohemorrhagiae) > 犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、小螺菌(Spirillum minus)、念珠状链杆菌 (Streptobaci 1 Ius moniliformis)；维虫属(Trypanosomas)；支原体属(Mycoplasmas)，月市 炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)；单核增生性李其jf特氏菌(Listeria monocytogenes)； 猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；念珠状链杆菌(Sti^ptobacillus monilformis) ；1 (Donvania granulomatis) ；If^Ei/Kffl 1 ^ (Bartonellabacilliformis)；立克次氏体属(Rickettsiae)，普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、禾裹氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsiae)和康氏立克次氏体(Rickettsia conori)。使用的其他细菌包括大肠杆菌、 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、菊欧文氏菌和植生克雷伯氏菌。在本发明的一些实施方案中，微生物是专性厌氧微生物。专性厌氧微生物 的非限制实例包括溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrosolvens)和梭菌属物种诸 如巴氏梭菌(C. pasterianum)。在本发明的其他实施方案中，微生物是微需氧耐受的 (microaerotolerant)，并且能够在小浓度氧的存在下存活。在一些实施方案中，微需氧条 件包括但不限于通过用以下量气体充入液体培养基所产生的发酵条件至少0. 01 %到至 少 5%或更多 02(例如 0. 01%,0. 05%,0. 10%,0. 50%,0. 60%,0. 70%,0. 80%U. 00%, 1. 20%Λ. 50%U. 75%、2. 0%、3%、4%、5%或更多02)。另一方面，微需氧条件包括但不 限于具有至少约0. 05ppm溶氧或更多溶氧(例如0. 05ppm、0. 075ppm、0. lppm、0. 15ppm、 0. 2ppm、0. 3ppm、0. 4ppm、0. 5ppm、0. 6ppm、0. 8ppm> 1. 0ppm、2. 0ppm、3. 0ppm、4. 0ppm、5. Oppm、 8. Oppm、10. Oppm或更多)的培养条件。用于开发更高产物耐受性突变体的细菌和真菌的亲本菌株来源包括已建立的培 养物保藏中心和大学中的研究者、政府机构或公司。可选地，亲本菌株可以从环境样品中分 离，诸如来自废水处理设施的废水污泥，所述废水处理设施包括市政设施和那些在化工厂 或石油化工厂的设施。当能够预期分离的微生物经许多代的过程在高产物浓度的存在下进 化并由此已达到可以被进一步改善的期望的产物耐受性水平时，后一种来源特别具有吸引 力。个别物种和多个物种的混合群可以从环境样品中分离。当期望具体种或属的混合群时，可以使用不期望物种或属的选择性生长抑制剂来 阻止或抑制这些不期望微生物的生长。在一些实施方案中，利用了共培养物。通常，一种微生物将酶分泌到培养基 中，所述酶将原料降解成可以被另一种微生物利用的组成化合物。使用微生物的共培 养物生产溶剂的实例包括用哈茨木霉(Trichoderma harzianum)与肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae) W^Jtlf^^r'T—Il (Yu等人.,Applied and Environmental Microbiology(应用及环境微生物学)(1985)50(4) :924-929)和从热纤维梭菌与热硫 化氢梭菌(C. thermohydrosulfuricum)的共培养物生产乙醇(Eng等人.，Applied and Environmental Microbiology (应用及环境微生物学)(1981) 41 (6) :1337-1343) 在其他实施方案中，使用环境分离株和/或微生物聚生体来产生具有提高的产物 耐受性的微生物聚生体。可以从众多的环境小生境中收集包括微生物聚生体在内的分离株，包括土壤、河流、湖泊、沉积物、河口、沼泽、工业设施等等。在一些实施方案中，微生物聚 生体是严格厌氧微生物。在其他实施方案中，微生物聚生体是专性厌氧微生物。在一些实 施方案中，微生物聚生体是兼性厌氧微生物。仍在其他实施方案中，微生物聚生体不包括肠 球菌属或乳杆菌属的物种。在一些实施方案中，微生物包含一个或多个异源基因，异源基因的表达提高微生 物的产物耐受性。在一些实施方案中，在固体支持体上适应或选择产物耐受性之前将所述 一个或多个异源基因引入微生物中，而在其他实施方案中，在适应或选择产物耐受性之后 将所述一个或多个异源基因弓I入微生物中。在一些实施方案中，微生物被工程化以过表达提高微生物产物耐受性的内源基 因。在一些实施方案中，微生物包含提高对产物的耐受性的另外拷贝数的内源基因。在某 些实施方案中，产物耐受的微生物不是大肠杆菌，并且异源基因或过表达基因不是yfdE、 yhhL、yhhM和csrC。在其他实施方案中，微生物不是具有热激蛋白的提高表达的重组微生 物。仍在其他实施方案中，微生物不是包含如下异源基因的重组微生物所述异源基因编码 将丁醇输出到微生物外的多肽。适应过稈可以适应或选择微生物以在存在微生物正常产生的产物的情况下生长并附于固 体支持体，或者适应和选择二者兼有。在一些实施方案中，通常，微生物群被接种或以其他 方式被分散在包含可用养分的固体支持体上。养分可以自由利用，诸如在固体支持体是包 含营养介质的琼脂的情况下。可选地，在其他实施方案中，固体支持体可以是微生物能够聚 居形成生物膜的表面，诸如骨炭，但是在骨炭中养分是由灌注固体支持体的液体培养基提 供。可以挑出并培养在期望的固体支持体上快速生长的微生物的菌落，或者将其储存供后 面应用。在另一实施方案中，固体支持体可以包含通过酶分解释放可利用的养分的原料， 如发生在包含淀粉或纤维素的原料被分解成能够被微生物同化的葡萄糖和其他更简单组 分时。可以从固体支持体中挑出并培养快速生长的微生物的菌落，或将其储存供后面应用。仍在另一实施方案中，可以将已知在选择的固体支持体上生长良好的微生物暴露 于不同浓度的其正常情况下产生的产物中，以便选择能够在更高浓度下生长的微生物。暴 露可以是连续的，诸如用产物的低浓度开始。然后挑出具有良好生长特性的菌落，并将其转 移或接种在相同固体表面，其中微生物被暴露于更高浓度的产物。挑出具有良好生长特性 的菌落并且该过程根据所需继续用较高浓度按顺序进行以产生用于预期用途的适应的微 生物。使微生物适应于产物浓度的替代方式是将连续的培养物保持在固体基质上的微 生物上。可以将产物的浓度保持在相同浓度或者它可以随时间改变，通常是以浓度递增的 方式。随着细胞生长，过量细胞一般被移除，并且经过多代，产生了适应于产物浓度的更多 产物耐受微生物。对于产生丁醇的梭菌，包括但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，用于适应的有 用的乙酸或丁酸浓度包括约0.2%到约10%。在一些实施方案中，可以使丙酮丁醇梭菌或 糖丁酸梭菌适应以表现出对至少 0. 2%,0. 40%,0. 60%,0. 80%U. 00%,1. 20%Λ. 40%, 1.60 %U. 80 %,2. 00 %,2. 20. 0 %,2. 40 %,2. 60 %,2. 80 %,3. 00 %,3. 5 %A. 005. 00%、6. 00%、7. 00%或8. 00%的乙酸或丁酸的耐受性。对于产生丁醇的梭菌，例如但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，用于适应的有 用的丁醇浓度包括约1. 0% w/v到约25% w/v、l. 5% w/v到约22. 5% w/v、2. 0% w/v到约 20. 0% w/v、2%到约 18% w/v、2. 0% w/v 到约 16. 0% w/v、2%到约 15% w/v、2. 0% w/v 到 约 12. 0% w/v、2%到约 10% w/v、2. 0% w/v 到约 9. 0% w/v、2%到约 8% w/v、2. 0% w/v 到 约 7. 0% w/v、2% 到约 6% w/v,2. 0% w/v 到约 5. 0 % w/v、2% 到约 4% w/v,2. 0% w/v 到 约3. 0 % w/v和2 %到约2. 5 % w/v ο其他有用的丁醇浓度包括至少1. 0 %、1. 5 %、1. 8 %、 2. 0%,2. 2%,2. 4%,2. 6%,2. 8%,3. 0%,3. 2%,3. 4%,3. 6%,4. 0%,5. 0%,7. 0%U0%, 12%或15%。丁醇适应浓度包括那些唯一由1-丁醇组成的浓度和那些由丁醇异构体的混 合物构成的浓度。还可以使丙酮丁醇梭菌适应于包含ABE溶剂混合物的溶液。有用的ABE总 溶剂浓度范围包括以下浓度约1. 0% w/v到约25% w/v、1. 5% w/v到约22. 5% w/v,2. 0% w/v 到约 20. 0% w/v、2%到约 18% w/v,2. 0% w/v 到约 16. 0% w/v、2%到约 15% w/v,2. 0% w/v 到约 12. 0% w/v、2%到约 10% w/v、2. 0% w/v 到约 9. 0% w/v、2%到约 8% w/v、2. 0% w/v 到约 7. 0 % w/v、2 % 到约 6 % w/v、2. 0 % w/v 到约 5. 0 % w/v、2 % 到约 4% w/v、2. 0 % w/v 到约3.0% w/v和2%到约2.5% w/v。其他有用的总ABE浓度包括至少1.0%、1.5%、1.8%、 2. 0%,2. 2%,2. 4%,2. 6%,2. 8%,3. 0%,3. 2%,3. 4%,3. 6%,4. 0%,5. 0%,7. 0%U0%, 12% 或 15%。在一些实施方案中，可以在固体支持体上使微生物适应，以耐受比对应的非适应 亲本微生物可耐受的水平大至少125%的有机酸水平。在其他实施方案中，适应的微生 物相比于对应的非适应亲本微生物的酸耐受性表现出至少150 %,200 250%,300%, 400 %,500 %,600 %,700 800%,900%, 1，000 %、2，000 %、3，000 %A, 000 000%, 6，000%,7, 000%,8, 000%,9, 000%,10, 000%、11，000%,12, 000%,13, 000%,14, 000% 或15，000%的酸耐受性。如果亲本微生物是不能利用的，那么可以使用标准种或标准菌株 进行比较。例如，对于丙酮丁醇梭菌，标准菌株是ATCC 824。在一些实施方案中，酸耐受性是通过测量适应的微生物在包含指定浓度酸的半固 体或固体支持体上的生长能力而确定的绝对值。例如，使用本发明的方法产生的糖丁酸梭 菌的适应菌株可能具有对至少5%的乙酸或丁酸的绝对耐受性。在一些实施方案中，梭菌属 的适应菌株表现出对至少 2. 0%、2. 5%,3. 0%,3. 5%,4. 0%,5. 0%,6. 0%,7. 0%,8. 0%, 9. 0%U0. 0%Λ2. 5%Λ5. 0%、20%或25%的乙酸或丁酸的耐受性。选择过程许多方法已知在本领域中用于诱发突变到微生物中并用于选择期望的表型。通 常，将微生物悬浮在包含特定浓度诱变剂的液体培养基中。在孵育给定量的时间后，将悬浮 液离心并且将得到的液体滗出，留下微生物沉淀。将沉淀重悬在培养基中。如果必要的话 可以重复该洗涤步骤。除去诱变剂后，通常将微生物培养在液体培养基中以便在稀释之前 从诱变步骤中恢复，然后将其展开在固体营养培养基(像琼脂)上，所述固体培养基包含对 接种的微生物施加选择压的剂。如果具有提高的产物耐受性的突变体是期望的，那么使用标出产物浓度范围的平 板的集合。在适当的培养期后，可以从固体营养培养基中选择产物耐受微生物的菌落。通 过改变诱变时间和诱变剂浓度，可以修改微生物的突变率和死亡率以找到有利条件。22
在美国专利第4，757，010号中描述了用于正丁醇耐受的丙酮丁醇梭菌的替代的 诱变和选择过程。在该过程中，在固体培养基上一步进行诱变。获得了处于生长状态的丙酮 丁醇梭菌的液体培养物。将该液体培养物以不同稀释度接种在固体营养培养基的平板上， 每个平板包含特定浓度的正丁醇，平板的集合标出正丁醇浓度的范围。另外，每个平板具有 诱变剂的浓度梯度。通常，诱变剂被安放在一点，例如，在每个皿的中心，从中心诱变剂扩散 产生浓度梯度。在培养适量时间后分离耐正丁醇的菌落。另一诱变和选择的方法是使用双纸片扩散法(double disc method)，其中在培养 物被接种到包含半固体或固体支持体的一个或多个容器上后，两个纸片或纸条被放在每个 容器中支持体的顶部。用诱变剂的溶液浸渍一个纸片或纸条。另一个纸片或纸条包含施加 选择性压力的剂。通常，纸条被彼此垂直地使用和放置以产生诱变剂和选择性剂的重叠梯 度。参见图1。在两个纸条附近存在一个没有细胞能够生长的空白区域。通常，远离纸条 处，在较低重叠浓度，可以发现和分离突变体的菌落。在本发明中有用的诱变剂包括烷化剂，诸如甲基磺酸乙酯(EMQ、N_甲基N'-硝 基N-亚硝基胍(MNNG或NG)、ICR 191、亚硝酸、硝基喹啉-N-氧化物、N-乙基-N-亚硝基脲 (ENU)和三乙烯三聚氰胺。其他有用的化学诱变剂包括羟胺、核苷碱类似物(例如BrdU)、 DNA嵌入剂(例如溴化乙锭)和DNA交联剂(顺钼)。有用的物理诱变剂包括电离辐射(例 如，χ射线、α粒子和β粒子)和非电离辐射(例如，紫外线辐射)。对于产生丁醇的梭菌，例如但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，用于选择的有 用的丁醇浓度包括约1. 0% w/v到约25% w/v、l. 5% w/v到约22. 5% w/v、2. 0% w/v到约 20. 0% w/v、2%到约 18% w/v、2. 0% w/v 到约 16. 0% w/v、2%到约 15% w/v、2. 0% w/v 到 约 12. 0% w/v、2%到约 10% w/v,2. 0% w/v 到约 9. 0% w/v、2%到约 8% w/v,2. 0% w/v 到 约 7. 0% w/v、2% 到约 6% w/v,2. 0% w/v 到约 5. 0% w/v、2% 到约 4% w/v,2. 0% w/v 到 约3. 0 % w/v和2 %到约2. 5 % w/v ο其他有用的丁醇浓度包括至少1. 0 %、1. 5 %、1. 8 %、 2. 0%,2. 2%,2. 4%,2. 6%,2. 8%,3. 0%,3. 2%,3. 4%,3. 6%,4. 0%,5. 0%,7. 0%U0%, 12%或15%。丁醇选择浓度包括那些唯一由1-丁醇组成的浓度和那些由丁醇异构体的混 合物构成的浓度。产溶剂的梭菌诸如但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌也可以用包含 ABE溶剂混合物的溶液来选择。有用的ABE总溶剂浓度范围包括以下浓度约1. 0% w/v 到约 25% w/vU. 5% w/v 到约 22. 5% w/v、2. 0% w/v 到约 20. 0% w/v、2%到约 18% w/v、 2. 0% w/v 到约 16. 0% w/v、2%到约 15% w/v、2. 0% w/v 到约 12. 0% w/v、2%到约 10% w/ ν,2. 0% w/v 到约 9. 0% w/v、2%到约 8% w/v、2. 0% w/v 到约 7. 0% w/v、2%到约 6% w/v、 2. 0% w/v 到约 5. 0% w/v、2%到约 4% w/v、2. 0% w/v 到约 3. 0% w/v 和 2%到约 2. 5% w/ ν。其他有用的ABE总溶剂浓度包括至少1.0%U.5%U.8%,2.0%,2. 2% ,2. 4% ,2. 6%, 2. 8%,3. 0%,3. 2%,3. 4%,3. 6%,4. 0%,5. 0%,7. 0%、10%、12%或 15%。在一些实施方案中，可以对最初选择的微生物使用多轮的选择或诱变和选择。每 轮可以是逐步增高的产物浓度。可选地，诱变剂和/或产物可以在多轮选择之间改变。酸耐受性在一些实施方案中，对酸耐受的微生物在固体支持体上的提高的酸耐受性进行诱 变和选择。在一些实施方案中，酸耐受的突变体可以用于溶剂或有机酸的生产。例如，可以 将产溶剂的梭菌(诸如但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌)的酸耐受突变体培养在有助于乙酸和丁酸产生的条件下，或者可选地，培养在有助于丁醇产生的条件下。在本发明的一 些实施方案中，酸耐受性是通过比较突变的微生物在半固体或固体支持体上的生长能力与 非突变的亲本微生物在相同半固体或固体支持体上的生长能力而测量的相对值。通常，半 固体或固体支持体包含生长培养基和通常基于体积比体积(w/v)测量的指定浓度的酸。一 般而言，多个容器(通常是培养皿)被填充标出酸浓度范围的半固体或固体支持体。例如， 用于测试丙酮丁醇梭菌的丁醇耐受性的有用支持体是包含强化梭菌培养基(RCM)的琼脂， 并且有用的乙酸或丁酸浓度范围是从0.2%到5.0%。仍有菌落形成的最高浓度代表微生 物的酸耐受性。替代的酸耐受性测试方法是用包含指定浓度的酸的溶液覆盖非酸支持体。通过将突变微生物能够生长的最高酸浓度除以所记录的非突变微生物生长的最 高酸浓度，可以计算出突变微生物的相对的酸耐受性。例如，如果使用本发明的方法分离展现至少4%的乙酸耐受性的丙酮丁醇梭菌菌 株的突变体，而亲本菌株具有2%的乙酸耐受性，则突变体的相对的酸耐受性将是非突变亲 本菌株的200%。在一些实施方案中，本发明的突变微生物的相对的酸耐受性包括与对应的非突变 微生物的酸耐受性相比具有至少125%耐受性的微生物。在其他实施方案中，所选择的突 变微生物相比于对应的非突变微生物的酸耐受性表现出至少150 %,200 250%,300%, 400 %,500 %,600 %,700 800%,900%, 1，000 %、2，000 %、3，000 %A, 000 000%, 6，000 000 000 000%, 10，000 %Λ1, 000%, 12，000 %、13，000 %、14，000 % 或15，000%的酸耐受性。如果亲本微生物是不能利用的，那么可以使用标准种或标准菌株 进行比较。例如，对于丙酮丁醇梭菌，标准菌株是ATCC 824。在一些实施方案中，酸耐受性是通过测量突变的微生物在包含指定浓度酸的半 固体或固体支持体上的生长能力而确定的绝对值。例如，使用本发明的方法产生的糖丁 酸梭菌的突变体可能具有对至少0.8%的乙酸或丁酸的绝对耐受性，而亲本微生物不能 在0.40%以上的乙酸或丁酸浓度生长。在一些实施方案中，丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌 的突变体表现出对至少 0. 2%、0. 40%,0. 60%,0. 80%U. 00%U. 20%U. 40%U. 60%, 1.80 %,2. 00 %,2. 20. 0 %,2. 40 %,2. 60 %,2. 80 %,3. 00 %,3. 5 %A. 00 %,5. 006. 00%、7. 00%或8. 00%的乙酸或丁酸的耐受性。溶剂耐受性在一些实施方案中，对溶剂耐受的微生物在固体支持体上的提高的溶剂耐受性进 行诱变和选择。在一些实施方案中，溶剂耐受的突变体可以用于溶剂或有机酸的生产。例 如，可以将丙酮丁醇梭菌的溶剂耐受突变体培养在有利于乙酸和丁酸产生的条件下，或可 选地，培养在有利于丁醇产生的条件下。在本发明的一些实施方案中，溶剂耐受性是通过比 较突变的微生物在半固体或固体支持体上的生长能力与非突变的亲本微生物在相同半固 体或固体支持体上的生长能力而测量的相对值。通常，半固体或固体支持体包含生长培养 基和通常基于体积比体积(ν/ν)测量的指定浓度的溶剂。一般而言，多个容器(通常是培 养皿)被填充标出溶剂浓度范围的半固体或固体支持体。例如，用于测试丙酮丁醇梭菌的 丁醇耐受性的有用支持体是包含强化梭菌培养基(RCM)的琼脂，并且有用的丁醇浓度范围 是从0.8%到5.0%。仍有菌落形成的最高浓度代表微生物的溶剂耐受性。替代的溶剂耐 受性测试方法是用包含指定浓度的溶剂的溶液覆盖非溶剂支持体。另一替代的溶剂耐受性测试方法是确定在暴露于丁醇后的存活率。通过将突变微生物能够生长的最高溶剂浓度除以所记录的非突变微生物生长的 最高溶剂浓度，可以计算出突变微生物的相对的溶剂耐受性。作为相对的溶剂耐受性计算的实例，使用本发明的方法分离展现至少5%的丁醇 耐受性的糖丁酸梭菌菌株Co-7449的突变体。另一方面，菌株Co-7449具有近似2. 的丁 醇耐受性。因此，突变体的相对的溶剂耐受性是非突变亲本菌株的至少225%。在一些实施方案中，本发明的突变微生物的相对的溶剂耐受性包括与对应的非突 变微生物的溶剂耐受性相比具有至少125%耐受性的微生物。在其他实施方案中，所选择 的突变微生物相比于对应的非突变微生物的溶剂耐受性表现出至少150 200%,250%, 300 %A00 %>500 %,600 %,700 %,800 %,900 1，000 %、2，000 %、3，000 %A, 0005，000%,6, 000%,7, 000%,8, 000%,9, 000% ,10, 000%、11，000%,12, 000%,13, 000%, 14，000%或15，000%的溶剂耐受性。如果亲本微生物是不能利用的，那么可以使用标准种 或标准菌株进行比较。例如，对于丙酮丁醇梭菌，标准菌株是ATCC824。在一些实施方案中，溶剂耐受性是通过测量突变的微生物在包含指定浓度溶剂的 半固体或固体支持体上的生长能力而确定的绝对值。例如，使用本发明的方法产生的糖丁 酸梭菌菌株Co-7449的突变体具有对至少5%的丁醇的绝对耐受性，而亲本微生物不能在2.以上的丁醇浓度生长。在一些实施方案中，丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌的突变体表 现出至少 2. 0%、2. 5%、3. 0%、3. 5%、4. 0%、5. 0%、6. 0%、7. 0%、8. 0%、9. 0%、10. 0%、 12. 5 %、15. 0 %、20 %或25 %的丁醇耐受性。在其他实施方案中，丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭 菌的突变体表现出对至少 2. 0%,2. 2%,2. 4%,2. 5%,2. 6%,2. 8%,3. 0%,3. 2%,3. 4%,3.6%,4. 0%,5. 0%,7. 0%、10%、12%或 15%的总 ABE 溶剂浓度的耐受性。发酵培养基用于产生产物的发酵培养基必须包含适合的以碳为基础的底物。这些底物被酶促 转化成通过生物化学途径、代谢途径、合成途径和发酵途径产生产物所用的中间化合物。如 本文所用，术语“以碳为基础的底物”是指可以被酶促转化成中间产物(随后转化为期望的 碳靶标)的包含至少一个碳原子的材料。示例性的以碳为基础的底物包括但不限于生物 质、淀粉、糊精、糖或这些物质的水解产物。如本文所用，“生物量”是指包含纤维素和/或淀粉的原料，包括但不限于木片、谷 物秸杆、水稻、草、饲料、佩里草(perrie-grass)、马铃薯、块茎、根、全碾碎谷物、葡萄渣、穗 轴(cob)、谷粒、小麦、大麦、黑麦、高粱、麸、谷类、含糖原料(例如糖蜜、果料、甘蔗或甜菜)、 木材和植物残体。如本文所用，“淀粉”是指任何含淀粉的材料。具体而言，该术语是指各种基于植物 的材料，包括但不限于小麦、大麦、马铃薯、甜马铃薯、木薯、谷物、玉蜀黍、木薯、高粱、黑麦 和麸。总体上，该术语是指包括植物的复杂多糖碳水化合物、包括直链淀粉和支链淀粉的具 有式(C6HltlO5)x的任何材料，其中“X”可以是任何数字。如本文所用，“纤维素”是指任何含纤维素的材料。具体而言，该术语是指具有式 (C6HltlO5)xW葡萄糖聚合物(或“纤维二糖”)，其中“X”可以是任何数字。纤维素是植物细 胞壁的主要组分，并且是在自然界最丰富的有机物质。尽管在纤维素中存在葡糖苷键， 在淀粉中存在α-葡糖苷键。纤维素与木质素一起形成“木质纤维素”。25
如本文所用，“半纤维素”是指任何含半纤维素的材料。具体而言，该术语是指 具有木糖基残基、葡糖基残基、半乳糖基残基、阿拉伯糖基残基或甘露糖基残基的杂聚物 (hetropolymer)。适合的底物包括但不限于包含可以被转化成糖的组分的已加工的材料(例如，纤 维素生物质、糖原、淀粉及其各种形式，诸如玉米淀粉、小麦淀粉、玉米固形物和小麦固形 物)。其他适合的底物包括但不限于单糖和二糖、糖(粗制的或加工过的)、糖蜜、糖浆和来 自农业材料的汁液(诸如甜高粱汁)、汁液浓缩物、玉米糖浆以及类似底物。各种淀粉是可 商购获得的。可发酵的糖可以由各种各样来源获得，包括木质纤维素材料。木质纤维素材料可 以由木质纤维素的废产物(例如，植物残体和废纸)获得。适合的植物残体的实例包括但 不限于任何植物材料，诸如茎、叶、谷壳、苞叶、穗轴等，以及玉米秸秆、甘蔗渣、木材、木片、 木浆和锯屑。废纸的实例包括但不限于丢弃的任何类型的纸(例如，光感复印纸、计算机打 印纸、笔记本纸、便签纸、打字纸等等)，以及报纸、杂志、纸板和以纸为基础的包装材料。如本领域中已知的，除了适当的碳源，发酵培养基必须包括适合的一种或多种氮 源、矿物盐、辅因子、缓冲剂和适合于培养物的生长和促进产生期望的靶标(例如丁醇)所 必需的酶促途径的其他成分。在一些实施方案中，盐和/或维生素B12或其前体可用于本 发明。氮源可以是任何适合的氮源，包括但不限于铵盐或酵母提取物。磷可以以磷酸盐 形式存在于培养基中，诸如磷酸钠和磷酸钾。硫可以以硫酸盐形式存在于培养基中，诸如硫 酸钠和硫酸铵。其他的盐包括但不限于硫酸镁、硫酸锰、硫酸铁、氯化镁、氯化钙、氯化锰、氯 化铁、氯化亚铁、氯化锌、氯化铜、氯化钴和钼酸钠。生长培养基还可以包含维生素，诸如盐 酸硫胺素、生物素和对氨基苯甲酸(PABA)。培养条件多种工业上重要的微生物的最适培养条件是本领域已知的。视需要，培养条件可 以是厌氧的、微需氧耐受的或需氧条件。如容易被本领域技术人员理解的那样，厌氧条件 是基本上无氧的条件，需氧条件是包含溶解在培养基中的氧以使得需氧培养物将不能区分 在具有另外的溶解氧的氧传递中的差别的条件，并且微需氧耐受的条件是如下的条件其 中一些溶解氧以低于空气中发现的水平且往往低于标准溶解氧探头的检出限(例如，小于 lppm)的水平存在的条件。可以搅动培养物或使之维持原状。通常，培养基的PH随时间而 变化，因为微生物在数目上增长，消耗原料并分泌有机酸。通过向生物反应器内的起始发酵 培养基中加入缓冲化合物或者通过向生长中的培养物中有效加入酸或碱以保持PH在期望 的范围内，可以调节培养基的pH。通过测量光密度(通常在600nm波长)，可以监测培养物的生长。对于使用酿酒酵母将糖转化为乙醇，一般来说，温度在约25°C至约35°C之间。提 供转化培养基的有用PH范围在4. 0和6. 0之间、在4. 5和6. 0之间以及在5. 5和5. 8之间。 使培养物生长在没有搅拌的厌氧条件下。由丙酮丁醇梭菌进行的ABE发酵通常是在厌氧条件下于约25°C至40°C的范围内 的温度下进行。历史上，悬浮培养物不使用搅拌器，但是依赖于放出的气体或充入的气体来 混合生物反应器的内容物。然而，可以搅拌培养物以确保反应器内容物更均勻的混合。对于固定的培养物，生物反应器将没有搅拌地以固定床(活塞流)模式或流化(充分混合) 模式运转。嗜温细菌的发酵可以达到约50°C至80°C范围内的温度。在一些实施方案中，温 度范围是约55°C至70°C。在一些实施方案中，温度范围是约60°C至65°C。例如，梭菌属物 种诸如热纤梭菌或热硫化氢梭菌可以生长在约60°C至65°C。半固体和固体支持体对于发酵的、代谢的、呼吸的或合成的产物的产生，使本发明的微生物生长固定于 半固体或固体支持体。可以使用多种类型的半固体和/或固体支持体材料。有用的支持体 材料具有高的表面积与体积比，这样使得大量活性、生产性细胞能够在生物反应器中积累。非限制性实例包括固体琼脂、多孔材料(诸如骨炭)、合成聚合物、天然聚合物、无 机材料或有机材料。天然聚合物包括有机材料，诸如纤维素、木质纤维素、半纤维素和淀粉。 有机材料包括原料，诸如植物残体和纸。应理解也可以使用两种或更多种材料的复合材料， 诸如合成聚合物与天然植物聚合物的混合物。半固体培养基的实例包括藻酸盐、κ -角叉菜聚糖和壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯 酰胺-酰胼、琼脂糖、聚丙烯、聚乙二醇、丙烯酸二甲酯、聚苯乙烯二乙烯苯、聚乙烯苯、聚乙 烯醇、环氧支持体、纤维素、乙酸纤维素、可光致交联的树脂、预聚合物、氨基甲酸乙酯和明 胶。固体支持体的实例包括软木、粘土、树脂、砂、多孔氧化铝珠、多孔砖、多孔硅石、硅 藻土、木片或活性炭。适合的无机固体支持体材料是具有可用表面的羟基或氧化物基团的一般无机材 料。这些材料可以按化学组成被分类为硅质或非硅质金属氧化物。硅质支持体除了其他之 外还包括玻璃、胶态硅石、硅灰石、堇青石、干硅胶、膨润土以及类似物。代表性非硅质金属 氧化物包括矾土、羟基磷灰石和氧化镍。在固体支持体上固定的方法可以通过任何已知手段从孢子或营养细胞固定微生物。一般而言，可以通过三种 不同的机制将微生物固定到半固体或固体支持体上。第一种，通过聚合或凝固含有孢子或 营养细胞的溶液实现在支持体中的截留或包含。有用的可聚合或可凝固的溶液包括藻酸 盐、κ-角叉菜聚糖、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺-酰胼、琼脂糖、聚丙烯、聚乙二醇、丙 烯酸二甲酯、聚苯乙烯二乙烯苯、聚乙烯苯、聚乙烯醇、环氧支持体、纤维素、乙酸纤维素、可 光致交联的树脂、预聚合物、氨基甲酸乙酯和明胶。第二种固定方法是通过吸附到支持体上。有用的支持体包括例如骨炭、软木、粘 土、树脂、砂、多孔氧化铝珠、多孔砖、多孔硅石、硅藻土或木片。微生物聚居在底物上并形成 生物膜。第三种该方法是通过使用化学剂将微生物共价偶联至支持体，所述化学剂如戊二 醛、邻联茴香胺(美国专利第3，983，000号)、聚异氰酸酯(美国专利第4，071，409号)、硅 烷(美国专利第3，519，538和3，652，761号)、丙烯酸羟乙酯、过渡金属激活的支持体、氰尿 酰氯、高碘酸钠、甲苯以及类似物。还参见美国专利第3，930，951和3，933，589号。在一种实施方案中，固定的孢子诸如丙酮丁醇梭菌的孢子通过热激被激活，然后 在适当条件下被培养在生长培养基中，从而营养生长接着发生。这些细胞仍附入固体支持 体中或附于固体支持体上。在微生物达到适合的密度和生理状态后，可以改变培养条件以 用于酸和/或溶剂的产生。如果固定的细胞减少溶剂产生，通过首先使细胞在重复热激和培养顺序之前形成孢子，将它们再活化。营养细胞可以在其生长的不同阶段被固定。对于展现双相性培养物的微生物，诸 如具有产酸相和产溶剂相的丙酮丁醇梭菌，可以在细胞进入期望的培养相后固定它们以便 使期望的产物的产生最大化，其中在丙酮丁醇梭菌的情况下，在产酸相中有机酸是乙酸和 丁酸，在产溶剂相中溶剂是丙酮、丁醇和乙醇。可选地，可以将双相性细胞在产酸相中固定， 然后使其适应于溶剂生产。在一些实施方案中，通过细胞悬液的方式引入要固定在生物反应器中的微生物。 一般而言，这些微生物作为单细胞或细胞的小聚集体分散在培养基中。在其他实施方案中， 通过使用被微生物聚居的悬浮颗粒来将微生物引入生物反应器中。这些悬浮颗粒可以被吸 附到固体支持体上，并且常常具有足够小的尺寸以致它们能够进入构成填充床的固体支持 体的孔结构中并变得固定在其中。通常，不考虑悬浮颗粒的尺寸，可以通过与构成填充床的 固体支持体接触通过接触转移微生物。在引入的颗粒上的生物膜能够转移至这些新表面并 聚居在这些新表面上。在一些实施方案中，微生物的期望特性只能通过在固体支持体上培 养而保持，由此使得用于接种生物反应器的固体支持体的小的聚居颗粒悬浮液的使用成为 必需。牛物反应器在本发明中可以使用一个或多个生物反应器。当使用多个生物反应器时，它们可 以被串联和/或平行排列。多个生物反应器胜过一个大生物反应器的优点包括建造成本和 安装成本更低、容易放大生产规模以及生产灵活性更大。例如，单个生物反应器可以采用离 线式以供保养、洗涤、杀菌等等，而没有明显影响生产计划。应理解平行或串联排列的生物反应器可以包括一种或多种发酵工艺类型。例如， 在串联排列中，第一个生物反应器可以包括分批发酵，而第二个生物反应器可以包括连续 发酵。在另一实施方案中，在串联排列中每个生物反应器相比于串联的其他生物反应器 可以具有微生物的不同的种、菌株、或者微生物的种或菌株的混合。类似地，在本发明另一 实施方案中，如在图8中所图示的那样，在串联排列中第一个生物反应装置有悬浮培养物 而第二个生物反应装置有固定的细胞。在这种排列中，培养基被引入到悬浮培养生物反应 器中，并且发酵流出液被移出并连同另外的培养基一起被进料到第二个生物反应器内的固 定细胞。固定的细胞是表现出提高的产物耐受性的突变体，并且能够进一步利用培养基中 的底物，产生较高浓度的产物。然后将发酵流出液移出并送往分离和回收。在本发明的另一实施方案中，发酵罐可以被串联排列以使得来自发酵罐的流出液 被立即引入到多个平行发酵罐中。在一些实施方案中，流出液可以在收获酸和/或溶剂后 被再循环并用来制造用于将来发酵的初始发酵培养基或原料流，由此使未同化的和回收的 养分和矿物质得到最大利用。在一些实施方案中，从流出液中分离产物，然后将产物减少的 流出液用作下一个串联发酵罐的原料。可以使用各种类型的提取技术，包括气提、吸附、全 蒸发、渗透萃取(perstraction)和蒸馏。可以调整串联生物反应器的次序以防止或移除由于过度生物质生长所致的阻塞。 例如，当第一个串联发酵罐达到高水平生物质时，可以代之将其放置在串联第二位，以现在 接收具有高产物浓度或减少的养分水平的流出液，所述高产物浓度或减少的养分水平可能抑制生物质的进一步生产。如果是填充床生物反应器或流化床生物反应器，发酵罐的次序 的适时移位可能防止生物质过度生长和发酵罐的阻塞。在连续过程中，因为细胞浓度和流出液的流速可以不受彼此约束而改变，所以有 可能获得比分批工艺或补料-分批工艺中更高的生产率。在连续发酵中，体积产率是通过 产物浓度(本文可互换称为“滴度”)乘以养分稀释率(即生物反应器的体积转换率或生物 反应器停留时间的倒数)而计算出的。最大可达到的稀释率是通过能够在生物反应器中稳 定保持的生物质的浓度而确定的。以恒定稀释率(即养分消耗率)，随着提高可以保持的 发酵滴度，生产率按比例提高。固定细胞生物反应器允许较高浓度的生产生物量积累，并因 此，生物反应器能够以高稀释率运转，导致体积产率相对于悬浮细胞的培养物显著改善。用 于丙酮丁醇梭菌的连续发酵的生物反应器也是本领域已知的(美国专利第4，424，275号和 美国专利第4，568，643号)。因为高密度、稳态的培养物能够通过连续的培养而保持，随之 而来移出包含产物的发酵培养液，因此可以使用更小容量的生物反应器。用于培养产生靶产物的微生物的常规生物反应器和方法是已知的并且考虑用 于本发明的方法和组合物。例如，在丙酮丁醇梭菌的分批发酵中使用的发酵罐是本领域 公知的(Beesch, S. C. Acetone—butanol fermentation of sugars (糖的丙丽 _ 丁醇发 酵).Eng.Proc. Dev. 44 1677-1682,1952 ；Beesch, S.C. Acetone-butanol fermentation of starches (淀粉的丙酮-丁 醇发酵)· Appl. Microbiol. 1 :85-96,1953 ；Killeffer, D. H. Butanol and acetone from corn. A description of the fermentation process (来 自玉米的丁醇和丙酮。对发酵工艺的描述).hd. Eng. Chem. 19 =46-50,1927 ；MuCutchan W. N.,禾口 Hickey, R. J. The butanol—acetone fermentations (丁 醇一丙丽发酵)· Ind. Ferment. 1 =347-388,1954.) 历史上，用于丁醇生产的发酵罐具有50，000加仑到200，000 加仑的容量，并且常常没有机械搅拌系统。考虑用于本发明的发酵罐容量包括具有至少 100L、1000L、10，000L、50，000L、100，000L、250，000L 或 500，000L 容量的发酵罐。发酵罐内容物的混合可以通过充入无菌气体例如二氧化碳或N2实现，所述无菌 气体也可以通过在发酵罐内保持正压用来防止培养物的污染。也可以在气举型反应器中利 用从发酵中排出的气体(C02、ffi)来保持厌氧、加压、充分混合的条件。混合培养物内容物 的其他技术包括搅拌器的使用或发酵培养液尤其是在移出发酵产物后返回到发酵罐中的 培养液的再循环。在一些实施方案中，发酵罐中的内容物不混合，但是可能依赖于排出的气 体的产生和移动来混合内容物。固定细胞生物反应器在本发明的一些实施方案中，固定的微生物被培养在填充床生物反应器中，也称 为活塞流生物反应器。在其他实施方案中，微生物被培养在膨胀(流化)床生物反应器中。 仍在其他实施方案中，将微生物培养在被设计以双重模式操作的生物反应器中，即所述生 物反应器能够以填充床或膨胀(流化)床模式操作。参见图19A和19B。固定细胞生物反 应器使用相对小尺寸的固体支持体，该固体支持体提供相对于颗粒体积的大表面积，允许 固定在颗粒上的微生物处理大体积的流体。在填充床生物反应器中，细胞被固定在半固体 或固体颗粒之上或之中，因为粒度，机械约束和/或低流体流速不引起或允许支撑材料的 明显轴向移动。填充床反应器容易构建和操作，但是能够遭受阻塞、养分转移差、以及PH控 制差。
相比之下，膨胀(流化)床反应器使用基本上不受机械约束的半固体或固体支持 体，以使得对于足够的流体流，通常为向上流动的流，颗粒变得在该流中悬浮或“流化”，即 表现得好像它们是流体流的一部分。在颗粒上的流体阻力是主要的悬浮机制，但是浮力也 能有助于颗粒的悬浮。通常，生物反应器使用垂直流体运动来悬浮颗粒，但是其他流体运动 是可能的，包括在垂直于生物反应器纵轴的方向的流体流。流体速度应该足以悬浮颗粒，但 是不够大以至于不能将颗粒从容器中载出。床的膨胀允许固体颗粒围绕生物反应器移动， 使生物反应器内的流体彻底混合。混合幅度取决于在生物反应器中达到的颗粒流化程度。 由于流体的体积必须被循环以保持颗粒悬浮，所以膨胀床生物反应器与填充床相比需要相 对大量的能量来操作。本发明的双重模式、填充床-膨胀床生物反应器允许整个发酵运转的过程以任一 种模式进行发酵的选择。可选地，发酵可以在单次发酵过程中在两个模式之间交替。双重 模式生物反应器与常规的膨胀(流化)床生物反应器相比具有减少的能量使用，因为具有 必需的增加能量需求的流化作用只需要在以下情况下进行例如，在相对高的细胞密度，高 产物浓度，或当可通过提高生物反应器的内容物混合而校正的PH或养分不均形成时。以下阐述了用垂直流体流操作的双重模式生物反应器的一个实施方案。生物反应 器的固体支持体在填充床模式下用微生物接种，然后将在没有流体流动的分批模式下将其 保持一段时间。随着微生物开始聚居到半固体或固体支持体上并在密度上有所提高，启动 低流体流速以提供其他营养和/或控制PH。然后视需要提高流速以适应增加的细胞密度。 在某一点，提高的流体流将使填充柱开始膨胀或“流化”到名为“膨胀床区”的生物反应器区 域中。参见图19B。床膨胀所需的最小流体速度Umf取决于许多考虑因素，包括生物反应器 的构造及其伴随的流体动力学、半固体或固体支持体的具体粒度分布、以及填充床的空隙 容积，如在使用具体实施方案阐述一般的工程学概念的实施例部分中进一步解释的那样。 随着流体速度的进一步提高，填充床将继续膨胀。正如可以理解的那样，能量的使用最初非 常低并且将随着流体流动开始而斜升，并且随后提高以适应培养物的生物需要。流化以及 此后的最大能量消耗只需要在双重模式的生物反应器中发生在如下时间点在该时间点细 胞密度需要这种混合进一步提高生产率、降低PH或底物不均性、或者以另外方式纠正或处 理由增加的细胞密度带来的其他培养条件。对操作垂直流体流双重模式生物反应器的实施方案的另外的说明如下。在填充床 模式过程中通过用被微生物聚居的较小的半固体或固体颗粒连续灌注填充床，而用微生物 接种生物反应器的固体支持体。较小的颗粒能够进入支持体材料的孔结构并寄居在那儿， 或通过较小颗粒与固体支持体之间的碰撞，微生物可以转移至支持体材料。在M小时后， 停止用具有附着的微生物的较小颗粒灌注支持体，并开始用养分溶液灌注。使用低流速，低 流速视需要随时间而提高以提供足够的养分，但在运转到达到Umf的点的发酵过程中永远 不提高低流速。许多发酵罐接种方法是可能的，包括从发酵罐的顶部反向冲洗以便从顶部装载 床。其他方式包括通过位于沿着反应器壁的口添加液体培养物或浸渍的固体支持体。还可 以使用反应器流出液来接种其他反应器，并且在这种情况下，任何残余的可发酵材料可以 在第二个反应器中被转化，提高产率/回收率。以相似方式，可以通过底部装载、顶部装载或侧面装载将支持体材料添加到柱/反应器以补充从生物反应器中降解或损失的支持体材料。为了保持生物反应器中包含的流化的支持体材料，将颗粒脱离区安放在床膨胀区 上方。脱离区具有将流化的颗粒从流体中分离的装置，并由此将颗粒保留在生物反应器内。 在一些实施方案中，用于将颗粒从流体中分离的装置包括用于减慢流体速度的装置。通常， 这是通过增加生物反应器的横截面积而实现的。随着流体速度减慢，颗粒开始从流体中沉 降出来。颗粒脱离区的顶部截面不含颗粒。出口可以位于这个顶部以移出流出液。保留颗 粒的其他装置包括位于生物反应器之内的过滤器或筛。通过使用沉清槽、离心机、水力旋流 器、所有类型的过滤机(例如转鼓)、助滤器、干燥器或蒸馏设备，支持体材料可以被移除并 且从流出液流中回收。如之前的实例所说明的，本发明的双重模式生物反应器包括与填充床区接合的入 口，所述填充床区与床膨胀区接合，所述床膨胀区与具有出口的颗粒脱离区接合。参见图 19B。在一些实施方案中，具有该设计的生物反应器能够连续发酵至少100、250、500、750、 1，000、1250、1，500,2, 000,2, 250,2, 500,3, 000 小时、4，000,5, 000 或6，000 小时。双重模式 填充床-膨胀床生物反应器还可以包括柱膨胀区。参见图19B。该区域与床膨胀区的下游 端接合，并且它与颗粒脱离区的上游端接合。柱膨胀区包括使脱离流体流的颗粒返回膨胀 床区的倾斜的表面。倾斜的角度当从水平测量时是至少15°、20°、30°、40°、45°、50°、 55°、60°、70°或80°。柱膨胀区还作为颗粒脱离区起作用，因为该区的顶部具有较宽的 横截面直径，并因而将具有较慢的垂直流速。柱膨胀区任选地作为可使用的颗粒脱离区，其 包括用于将支持体材料返回到膨胀床区的倾斜角。双重模式填充床-流化床生物反应器还可以包括气体-液体分离区。参见图19B。 该区域与颗粒脱离区的下游端接合。气体-液体区允许排出的气体或引入的气体从发酵培 养液中分离，并且可能为积极产生气体(诸如co2、H2或甲烷)的培养物所需，或者当培养物 被充气时可能需要气体-液体区。气体-液体区的替代物是在生物反应器出口的下游安放 容纳槽(holding tank)。流出液通常将进入该槽并从槽中的低点离开槽，而提供顶部空间 以捕集任何可能溶解于流出液中或作为气泡或泡沫从生物反应器中载出的气体。通常，经 常与冷凝器(condensor)、过滤器和/或涤气器接合以控制气味的通气口被安放在槽内的 高点以允许累积的气体离开系统。取决于多种因素，像流速、原料和不可溶的碎片的产生， 容纳槽可以包含沉降区，其中微粒物质能够沉降出来并且被定期移除。具有用本发明达到 的预期高产物滴度，某些产物像丁醇可以达到一个浓度点，其中产物将从发酵流出液中相 分离。容纳槽还可以设计成包括如下区域通过相分离促进产物从流出液中分离并且还通 过倾析法或抽出密度比流出液小的积累的产物来收获产物的区域。上面指出的容纳槽还可以用作原位产物提取场所，在其中任何方式的产物回收技 术-包括但不限于气提、全蒸发、真空回收或液-液萃取，可以用来辅助产物从该过程中回 收。双重模式生物反应器还可以包括入口分配区。参见图19B。入口分配区与填充床 区的上游端接合。入口分配区分配流体均勻穿过膨胀床以防止在原料分配中的不均勻性或 在床内产生PH梯度。一般而言，生物反应器跨入口分配区的压力降被限制在不超过跨生物 反应器长度的总压力降的30%。在一些实施方案中，压力降小于总系统压力的30%、25%、 20%、15%、10%或 5%o31
通常，柱膨胀区、颗粒脱离区或气体-液体分离区中至少一个具有比填充床区直 径大的直径。本发明的生物反应器还可以替代地以与通常流体流相反的方向从生物反应器的 顶部向下灌注通过填充床。交替的进料方向可以防止或减少流动限制的形成，由此延长填 充床的寿命，并因而允许延长连续的发酵运转。支持体材料一般在不同的粒度分类中是可用的。例如，处于5X8、10X^* 20X60目大小的骨炭是可用的。在每种颗粒分类中存在粒度范围。例如，对于5X8骨炭， 颗粒大小范围是3000-5000 μ m。对于任何具体的粒度范围，具有在该粒度范围内发现的最 大颗粒的流化所需的最小流体速度Umf。双重模式生物反应器通常被设计成具有足够的总体 高度以便能够在生物反应器内保留当以Umf操作时在分布范围内发现的最小尺寸的颗粒。 一般而言，最小的足够的生物反应器高度是通过确定膨胀床的总高度(H)与填充床的高度 (Hp)的比率来计算的，其中H等于Hp的高度加上床膨胀区。双重模式生物反应器应该具 有至少1. 0的H Hp比率，并且优选地具有至少1. 05、1. 10、1. 15、1. 20、1. 25、1. 30、1. 35、 1. 40,1. 45,1. 50,1. 55,1. 60,1. 70,1. 80,1. 90 或 2. 00 的比率。实验部分详述了用于获取具有给定粒度分布范围的特定半固体或固体支持体材 料的H Hp比率的适用于骨炭的一般方法。可以将膨胀床高度计算为发酵运转过程中在任意点的填充床的高度，所述任意点 包括至少四分之一、一半或四分之三通过运转的时间点或在运转结束。这种计算考虑可以 随外部生物膜的生长而发生的个体颗粒大小随时间增加。由于不可溶的碎片的积累，填充 床还能够增加大小。本发明的双重模式生物反应器还可以包括用于控制pH、控制氧化还原、引入消泡 剂的装置，以及用于使生物反应器的内容物可见和用于引入检测或测量包括一种或多种发 酵产物在内的发酵培养液的各种组分的探头的孔道。另外，可以通过孔道引入温度探头、压 力探头和溶氧探头或其他的溶解气体探头。可选地，可以通过将探头放在离开生物反应器 的流出液流的管线内而完成这些测量。还可以存在采样口以供自动或人工获得物理样品。 另外，排出或引入的气体可以从气体-液体分离区的口或废气处理系统的管线内采样。生 物反应器可以被包壳以用于温度控制和就地消毒。任选地，生物反应器可以具有允许大规 模进入生物反应器内部或允许填充床区、膨胀床区、柱膨胀区、颗粒脱离区或气体-液体分 离区中的一个或多个的高度改变的模块化设计。本发明的双重模式生物反应器可以主要以定期提高流体速度的填充床模式运转， 定期提高流体速度实现将柱膨胀到柱膨胀区或使填充床流动。这能够以计划的间隔预防性 地进行以防止压力增大和流体流的限制或堵塞。在一些实施方案中，生物反应器主要以填 充床模式运转，但以下述频率被切换到膨胀床模式每小时、2小时、4小时、6小时、8小时、 12小时、18小时、24小时、2天、4天、6天、8天、10天、20天或它们的组合。也可以在流体压 力超出预定的工作点时进行切换。在转到较低流体速度后，颗粒将以更松散的构型(a loser configuration)沉降， 该构型允许与流速提高之前相比相同或更大的流体流速，但具有减少的压力降。在膨胀床 模式下每次定期流速提高后，在填充床模式下的流速可以被设定成随时间渐进上升，例如， 具有lOOml/min的起始流速，在第一次提高后流速可以被设定为105ml/min，在提高后接下来流速为llOml/min等等。这种渐进增加可以防止生物反应器内部的堵塞或不可接受的压 力增加。通过增加的流体速度定期对床重新充填的能力以及随后固体支持体和不可溶颗粒 在流体速度降低后的沉降可能提供一种方法，该方法防止填充床的堵塞或积垢并引导连续 的发酵运转超过 100、250、500、750、1，000、1250、1，500,2, 000,2, 250,2, 500,3, 000,4, 000、 5，000、6，000、7，000或8，000小时。取决于驻留在填充床中的不可溶颗粒的大小和密度，转 换成膨胀床模式可能使得有冲洗来自系统的这些不可溶颗粒的机会。使用与生物反应器成 一排的容纳槽，不可溶颗粒可能从发酵罐流出液中沉降出来。可选地，不可溶颗粒可以被滤 出、通过离心或通过其他适合的手段移除。通过从填充床运转模式转换到膨胀床运转模式定期对床重新充填的能力还可以 防止或减轻在床基质中的沟流(channeling)。沟流能够导致进料分布和pH控制的不均性， 因为在沟(channel)附近的固体支持体上的细胞与位于远离沟的固体支持体上的细胞相 比被暴露于更大体积的原料流。在一些实施方案中，在移种生物反应器之前或移种生物反应器后随即将流速增加 以开始调整支持体材料的颗粒间间距，由此提高总体生产率或改变其他参数，诸如跨整个 床的压力降。在一些实施方案中，流速的定期提高或降低周期性地膨胀和再沉降支持体材 料和有机体材料。在这样做时，可以调整支持体材料之间的空隙间距。任选地，可以将无氧气体添加到液体培养基以增强混合、提供另外的养分或维持 生物反应器内部的正压。流化床的特点和表现依赖于固体和液体两者的特性。在产物对微 生物有毒性或抑制性效应时，可以使用气提来降低柱流体中的产物浓度，并由此降低或防 止产物的抑制或毒性。在本发明中使用所需的粒度将依赖于应用、生物反应器构型和操作参数而变 化。在一些实施方案中，通过筛分对固体支持体分大小。在一些实施方案中，通过颗粒能 够穿过的筛孔的筛号将颗粒分类。在一些实施方案中，用具有以下美国筛号(U. S. Sieve Number)的筛目筛分颗粒3 1/2、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、 50、60或70。在一些实施方案中，颗粒被筛分至少两次，第一次使用具有较大开口的筛 目，接着使用具有较小开口的筛目，以产生在限定的粒度分布范围内的颗粒。在一些实 施方案中，颗粒直径为至少 100μπι、200μπι、300μπι、400μπι、500μπι、600μπι、700μπι、 800 μm、900 μm、1000 μ m、1，100 μ m、1，200 μ m、1，300 μ m、1，400 μ m、1，500 μ m、1，600 μm、 1，700 μ m、1，800 μ m、1，900 μ m、2，000 μ m。在一些实施方案中，颗粒直径为小于100 μ m、 200 μm、300 μm、400 μm、500 μm、600 μm、700 μm、800 μm、900 μm、1000 μ m、1，100 μ m、 1，200 μ m、l，300 μ m、l，400 μ m、1，500 μ m、1，600 μ m、1，700 μ m、1，800 μ m、1，900 μ m、 2，000 μ m。在其他实施方案中，至少80%、85%、90%、95%或100%的颗粒具有在以下范围 内的直径100-400 μ m、100-600 μ m、100-800 μ m、200-500 μ m、200-800 μ m、200-1000 μ m、 400-800 μ m、400-1000 μ m、500_1000 μ m、600_l，200 μ m、800_l，400 μ m、1，000-1，500 μ m 或 1，000-2000 μ m。在一些实施方案中，颗粒直径是等效直径，即考虑到个体颗粒的不规则形 状的直径。理想地，半固体或固体支持体材料应该具有高表面积。这可以通过使用小尺寸颗 粒、具有高孔隙率的颗粒或其组合来实现。在一些实施方案中，颗粒的表面积为至少IOm2/ g、25m2/g、50m7g、75m2/g、100m2/g、125m2/g、150m2/g、175m2/g、200m2/g、22^n7g、250m7g、275m2/g、300m2/g、325m2/g、350m2/g、375m2/g、400m2/g、425m2/g、450m2/g、500m2/g、600m2/g、 700m2/g>800m2/g>900m2/g> 1000m2/g或2000m2/g。另外，堆密度应该足够高以使得最小的 颗粒从柱膨胀区和/或颗粒脱离区中的流体流中沉降出来，并由此保留在生物反应器中。 在一些实施方案中，支持体的堆密度为至少0. 3g/cm\0. 4g/cm3、0. 5g/cm3,0. 6g/cm3、0. 7g/ cm3、0. 8g/cm3、0. 9g/cm3、l. 0g/cm3、l. lg/cm3、l. 2g/cm3 或 1. 3g/cm3。支持体材料应该具有 足够的硬度以抵抗磨耗并由此在支持体材料彼此接触和碰撞时明显地避免粉尘形成。在一 些实施方案中，支持体具有至少20、40、60、80、100、120、140、160或200的球盘硬度数。支 持体材料还应该具有足够的拉伸强度以抵抗由于内部应力所致的碎裂，内部应力是由支持 体材料孔内部的生物膜的生长引起的。在一些实施方案中，支持体具有至少20MaP、40MaP、 60MaP、80MaP、lOOMaP、120MaP、140MaP、160MaP、180MaP、200MaP、300MaP 或 400MaP 的屈服强 度。用于收获产物的装置许多手段可用于从发酵培养液分离产物，包括蒸馏、用溶剂连续提取(美国专利 第4，424，275号和美国专利第4，568，643号)、碳氟化合物的使用(美国专利第4，777，135 号)、吸收材料的使用(美国专利第4，520，104号)、全蒸发膜的使用(美国专利第 5，755，967号)以及汽提气的使用(美国专利申请第10/945，551号)。本发明的一个实施方案使用蒸汽压缩蒸馏系统。(美国专利第4，671，856、 4，769，113,4, 869，067,4, 902，197,4, 919，592,4, 978，429,5, 597，453 和 5，968，321 号。) 另一实施方案利用机械的蒸汽再压缩系统来浓缩溶剂并利用塔顶流的焓来蒸发进料混合 物。在这个实施方案中，发酵培养液被直接送至MVR塔以用于溶剂浓缩。来自MVR系统的 塔顶流被压缩。热交换器用于从具有进料混合物的压缩的塔顶传递热。包含溶剂的混合物 被传到后面的蒸馏柱用于分离。MVR柱的底部包含生物质和其他较重的化合物。生物质通 过任何过滤方式被过滤并且可以被干燥以回收另外的水。过滤流包含大部分水和发酵培养 基组分。处理该流以移除不期望的组分并且可以将其作为工业用水回收。以交替构型，对 于丙酮丁醇梭菌的分批发酵，包含在消耗的发酵培养基中的产物的收获首先需要通过离心 澄清，交叉流过滤或替代的过滤方式。然后将澄清的发酵培养液送至蒸馏系统中，其中澄清 的培养液进入热交换器并且通过来自输出的蒸馏产物和废液的热传递而被预热。将预热的 培养液除气并加至板式蒸发器/冷凝器中，所述板式蒸发器/冷凝器有在叠加的金属板之 间交替形成的由垫圈分隔的对流蒸发室和冷凝室。培养基进入蒸发室，在其中培养基沸腾。 离开蒸发室的加热的蒸汽通过除雾的筛孔，然后被低压压气机加压。加压的蒸汽被递送至 冷凝室，在其中蒸汽部分地或全部地冷凝成蒸馏的产物，把热传给沸腾室中的培养液，并然 后被从系统中排出。包含溶解固体的未蒸发的培养液可以被再循环并且用来补充新发酵运 转的进料混合物，或者它可以被从系统中排出。在一些实施方案中，对于丙酮丁醇梭菌的连续培养物，使抽出的发酵培养液离开 发酵罐并离心以浓缩细胞和颗粒物质。可选地，可以通过例如切向流过滤来过滤发酵培养 液。可以将浓缩的细胞和颗粒物质回填至发酵罐(若期望的话)以增加细胞密度或用于进 一步发酵部分发酵的底物。可选地，如果澄清的或过滤的发酵培养液包含可溶的可发酵底 物，可以将澄清的或过滤的发酵培养液回填至发酵罐。当期望从培养基中收获产物时，许 多策略是可用的，包括储存澄清的或过滤的发酵培养液直至存在合理的数量来开始产物分离运转，诸如蒸馏，或者可选地，澄清的或过滤的发酵培养液的连续进料可以被送至分离系 统。在一些实施方案中，发酵培养液可以被直接加工而不经离心或过滤。由某些包含丁醇的溶剂混合物组成的发酵培养液可以经历基于比重的自发的相 分离。浮标液位指示器的使用可用于从剩余的含水部分中辅助分离包含丁醇的溶剂层。还可以通过气提或液体萃取回收发酵产物。在气提的情况下，期望的产物或抑制 性化合物期望从发酵培养液中移出。在气提方法中，通过闪蒸槽、真空提取或冷凝法回收移 出的产物。在抑制性化合物的情况下，对产物进一步纯化或处置。生物质以及所形成的其 他固体材料和沉淀必须在某点从系统中移出或清洗。这可以通过间断的或连续的清洗流实 现。生物质移出可以通过之前概括的几种手段实现。在液体萃取的情况下，生物质可以存 在于萃取流或清洗流二者中。液体萃取流被传至另外的回收和纯化操作。实施例^MM 1 句ι含2. 2-2. 6% (ν/ν/) 丁醇的Ρ2+4%木糖琼脂板的制各为了制备IL的Ρ2培养基，将以下成分称量到I-L瓶中=Bacto酵母提取物(1. Og)、 乙酸铵(2. 2g)、磷酸氢二钾(K2HPO4) (0. 5g)、磷酸二氢钾(KH2PO4) (0. 5g)。将蒸馏水(800mL) 加至混合物中，伴随搅拌棒搅拌。通过在搅拌盘(stir plate)上混合来溶解这些成分。用 5N NaOH将溶液的pH调整到7. 2。称量琼脂(16克)并加至瓶中。添加适当量的蒸馏水将 体积提增到915ml。将瓶盖上，高压灭菌30分钟，并然后放在搅拌盘上。当触摸培养基刚冷 却时，添加以下物质将培养基的终体积提增至IL P2微量元素Q00X)(5ml)和50% (w/ ν)木糖(对于4% (w/v)的终浓度80ml)。通过在I-L瓶中称量以下成分来制备I-L的200 XP2微量元素硫酸镁七水合物 (MgSO4. 7H20) (40. Og)、硫酸锰一水合物(MnSO4. H2O) (2g)、硫酸亚铁七水合物(FeSO4. 7H20) (2g)、对氨基苯甲酸(0. 2g)、盐酸硫胺素(0. 2g)、柠檬酸(20g)、NaCK2g)、D-生物素 (0. 002g)。用蒸馏水使终体积增加到1-L。使用0. 2微米过滤器将溶液过滤除菌，用铝箔包 裹，并储存在4°C。通过在搅拌盘上将200ml蒸馏水加热到50°C来制备50% (w/v)木糖。将255g 的D-木糖缓慢添加至热水中并搅拌直至所有木糖溶解。通过添加蒸馏水使体积增加至 500ml。通过0.2微米过滤器对溶液过滤除菌。用以0. 2ml递增的4. 4-5. 2ml 丁醇分别添加到五个无菌200ml量筒的一个中，制 备具有以0.1%递增的2. 2-2. 6% (ν/ν) 丁醇的平板。用按照描述制备的Ρ2+木糖琼脂培 养基将每个量筒中的体积增加到200ml，用石蜡膜密封，并且将量筒颠倒以均勻地混合丁醇 与P2+木糖琼脂培养基。将琼脂培养基放在热平板上以避免培养基在倾注过程中凝固。使用燃烧器/喷灯 来保持无菌环境，由每个量筒倾注平板(每个平板大约25-30ml)以得到在以0. 递增的 平板2. 2-2. 6% (ν/ν)中适当的丁醇浓度。在培养基凝固后平板被移至厌氧罩并且被单独 地用石蜡膜封口以防止丁醇损失。在厌氧罩中M小时后，平板是随时可用的。实施例2 用于分离具有增加的丁醇耐受性的突变体的双盘诱变测定在第一天，开始待诱变的菌株的种子训练(seed train)。第二天，剪下适当数目 的0.75X6cm滤纸。将半数滤纸放到包含6mg/ml MNNG的50ml管中。将另一半滤纸放到35包含丁醇的50ml管中。在平板上使用之前将管移至厌氧罩中至少4小时。测量种子训练管的0D_以确定哪个管最接近1的0D_，并且如果需要，等待直到 具体培养物达到1的0D_。如果三种培养物都已经长到高于0D_1，使用YEM做适当稀释以 获得0D6_. 5的培养物。OD6J). 5的培养物在0. 5小时至1小时内达到OD6tltlI15将200 μ 1上述0D_1的培养物铺板在每个RCM平板上。将MNNG浸泡的滤纸放在 平板一边的水平处(参见图1)。孵育平板1小时。将丁醇浸泡的滤纸放在与MNNG滤纸垂 直(正交)处(参见图8)。制备三个对照平板没有丁醇和MNNG的平板，没有丁醇的平板， 以及没有MNNG的平板。将平板孵育1至3天。评估了在丁醇滤纸附近(即图1中的画圆圈区域)的分离 的菌落的生长。评定这些菌落以确定它们与亲本菌株相比耐受丁醇的能力。将图1的画圆圈区域中分离的细菌再暴露于MNNG和丁醇的这种双梯度以获得多 种突变。这可能提高细菌耐受丁醇的能力。在暴露于双梯度两次后，从画圆圈区域中分离 菌落。棚列3翩··卜.躺‘·細T酉享而怜_辨体使糖丁酸梭菌Co-7449菌株生长在酵母提取物培养基(YEM)中至大约3的0D_， 并用终浓度为50 μ g/ml的N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍(MNNG)处理15分钟。将细胞 用无葡萄糖的YEM洗涤两次并以10_3和10_4稀释度铺板在强化梭菌培养基(RCM)上以回收 3000-4000个菌落。将菌落在包含5% 丁醇的RCM平板上重复铺板。总计20个菌落在丁醇 平板中被分离并在包含5%丁醇的RCM平板上被重新划线。突变体当生长在固体支持体上 时与亲本Co-7449菌株相比展示出至少高两倍的对丁醇的耐受性，所述Co-7449亲本菌株 在固体支持体上具有大约2. 的丁醇耐受性。通过从第二组5%丁醇RCM平板中取出菌落并使用突变体来接种包含有或没有 1. 2%丁醇的YEM培养基的烧瓶，测试所选择突变体在悬浮培养中的丁醇耐受性。菌落在没 有丁醇的YEM中生长，但是在具有添加到培养液中的1. 2%丁醇的YEM中不生长，说明突变 的微生物在固体支持体上比它们被悬浮在液体培养基中更加耐受溶剂。将从没有1. 2%丁醇的YEM培养基中取出的样品铺板在5%丁醇平板上，但是没有 生长。高丁醇耐受菌株的保持可能需要在具有溶剂的连续选择压力的固体支持体上传代以 保留高耐受性。^MM 4 丁醇耐警t牛测丨定方案-固彳本培目X办夜体培养基研究了对于丁醇耐受性未被适应或选择的梭菌属的菌株，看它们当培养在固体支 持体上时与悬浮培养相比是否具有更大的溶剂耐受性。在第一天，在厌氧罩内的P2+4%木 糖的5ml培养物中开始对待研究的菌株的种子训练。制备I-L体积的包含4%木糖和琼脂 的无菌P2培养基，并将其放在热平板上。在无菌环境中，将4. 4,4. 6,4. 8,5. 0和5. 2ml 丁 醇放在250ml无菌量筒中并用P2+4%木糖琼脂培养基补足到200ml，使丁醇终浓度分别为 2.2、2.3、2.4、2.5和2.6% (ν/ν) 0将溶液充分混合，并在无菌环境中倾注平板。在平板凝 固后，将其转移至厌氧罩并且在过夜储存前即刻用石蜡膜封口。第二天，测量种子训练管的0D·。挑出0D_在0. 6-1. 0之间的管，并将其用于以 1 20 的稀释度接种到 IOml 包含 0、0. 5、1.0、1. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5 和 1. 6% (ν/ν) 丁醇的 Ρ2+4%木糖管中。还制备了没有接种物的对照管。将管在厌氧罩中孵育。另外，将200μ136的培养物铺板在0,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5和2. 6% (ν/ν) 丁醇平板上。在1天和3-4天后，测量液体培养物的0D_。检验平板生长。对于每种菌株和在每 个时间点的液体培养物，将每个丁醇浓度的OD6tltl相对于0% (ν/ν) 丁醇的0D_作图为((在 χ%的OD600) / (在0%的OD600)) XlOO0图2A显示在不同时间点(0小时、24小时、96小时) 对于使用的三种梭菌属菌株的包含不同丁醇浓度的不同液体培养物取得的OD6tltl测量结果。 起点(0小时)的0D_是基于起始培养物的1 20接种。图2B显示按1 20接种取得的 起始液体培养物的0D_测量结果。图3是来自图2A的数据的图示并显示Co-5673随时间 在每种丁醇浓度(0% -1. 6% ν/ν)的液体培养基中的生长。对于&)-5673，00_在M小时 和96小时的时间点增加最多到1.4% (ν/ν) 丁醇。图4是显示在每种丁醇浓度(0^-1.6% 丁醇)的液体培养基中Co-0124随时间生长的图。对于Co-0124, OD600在24小时和96小 时的时间点增加最多到1.6% (ν/ν) 丁醇。图5是显示在每种丁醇浓度(0^-1.6% 丁醇) 的液体培养基中Co-7449随时间生长的图。对于Co-7449，OD600在M小时和96小时的时 间点增加最多到1.4% (ν/ν) 丁醇。图6Α是显示分析三种菌株Co-5673、Co-7449和Co-OlM在固体培养基平板 (P2+4%木糖)上在M小时时间点的丁醇耐受性的表。在液体培养基中的丁醇耐受性是 基于相比于起始OD6tltl在OD6tltl上的增加。观察到的在固体培养基平板上的生长表明丁醇耐 受性。Co-5673显示在包含0%和2. 2%的丁醇的平板上生长。Co-OlM显示在包含0%和 2. 2%的丁醇的平板上生长。Co-7449显示只在包含0%丁醇的平板上生长。图6B是在M 小时的时间点三种菌株在液体培养基中和在固体培养基上的丁醇耐受性的比较。在固体培 养基上Co-7449在M小时的丁醇耐受性结果O. )是在与另外两种菌株分开的实验中 确定的。所有三种菌株当生长在固体培养基上时在M小时表现出更高丁醇耐受性。图7A是显示分析三种菌株Co-5673、Co-7449和Co-OlM在固体培养基平板 (P2+4%木糖)上在96小时时间点的丁醇耐受性的表。在液体培养基中的丁醇耐受性是基 于相比于起始OD6tltl在OD6tltl上的增加。观察到的在固体培养基平板上的生长表明丁醇耐受 性。Co-5673显示在包含0%和2. 2%的丁醇的平板上生长。Co-OlM显示在包含0%、2. 2% 和2. 3%的丁醇的平板上生长。Co-7449显示只在包含0%和2. 2%的丁醇的平板上生长。 图7B是三种菌株在液体培养基中和在固体培养基上在96小时的时间点的丁醇耐受性的比 较。所有三种菌株当生长在固体培养基上时在96小时表现出与液体培养基相比更高丁醇 耐受性。当丙酮丁醇梭菌的不同菌株被培养在固体支持体上时发现的这些微生物的较高丁 醇耐受性是出人意料的结果，如果该结果对包括丙酮丁醇梭菌的其他菌株和梭菌属的其他 种在内的其他微生物也适用，则它具有提高生物燃料体积生产率的潜力以及由于减少的能 量需求还具有减少分离成本的潜力。实施例5 使来自环境样品的丁醇耐受的微生物适应获得了环境样品(分离株)。将该分离株铺板在一组包含营养琼脂的相同平板 上。平板具有范围在1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%和2.0%的提高的丁醇浓度。具有 1.0%U. 2%和1. 4% 丁醇的平板过度生长，而具有1. 6% 丁醇的平板具有几个菌落。在具 有1. 8%或2. 0%丁醇的平板上没有观察到生长。从1. 6%平板中挑出菌落，并将其在包含 每种提高浓度的丁醇的固体支持体上连续传代。在20次传代后，获得适应于在2. 5%丁醇 中生长的菌株。
实施例6 固定化连续培养的配置和操作使用具有0. 665空隙率的0. 15L柱并使具有3%葡萄糖的P2培养基以0. 36L/h 的速率流过该柱，建立了具有在IOX^目骨炭上的固定的CO-7449细胞的填充柱的连续发 酵工艺。首先将Co-7449的细胞固定到柱上，这是通过将柱安装于中级生长的Co-7449的 分批发酵并使来自该分批发酵的培养基循环经过该柱而实现的，然后回到发酵罐持续约M 小时的时间。在将细胞固定到填充柱上以后，然后将柱的出口流从分批发酵罐断开，并附加至 另一个收获池。从发酵罐到柱的流速被设定为0. 36L/h。培养基也从100L无菌培养基袋连 续添加至发酵罐以保持在发酵罐中的相同培养基体积。通过使来自发酵罐的出口流在流经 柱之前穿过加热培养基的热交换器，填充柱的温度被保持在允许细菌生长的温度。通过将 供应给柱的发酵培养基充入氮来保持系统无氧。使用这些条件，具有固定的Co-7449的填 充柱产生具有0. 24g 丁醇/g葡萄糖的产率和以3. 6h-l稀释率的4. 9g 丁醇/ (L*h)生产率 的1.36g/L 丁醇滴度。实施例7 固定化连续培养的配置和操作通过固定具有5. 0%丁醇耐受性的Co-7449的丁醇耐受突变体的细胞，建立了固 定的连续培养物。如以上实施例6中所述使用以IOX^目骨炭填充的柱。在细胞被固定到 填充柱上后，将来自种子分批发酵罐的入口流和返回到种子分批发酵罐的出口流断开。将 来自100L无菌培养基袋的进料线与柱相连并将来自该柱的出口线送回到培养基袋。培养 基至柱的流速被设定为0. 36L/h。通过使来自培养基袋的出口流在进入柱之前穿过热交换 器，填充柱的温度被保持在允许细菌生长的温度。使排出的发酵气体通过发酵锁逸出。使 用这些条件，具有固定的Co-7449突变体的填充柱产生了超过10g/L的丁醇滴度。实施例8 发酵使用发酵工艺诸如分批发酵、补料-分批发酵或连续发酵产生了主发酵培养液， 其中微生物在悬浮培养中生长或固定在固体支持体上。主发酵培养液包含一些酸和/或溶 剂滴度以及残余的未同化原料。用于提高的生产率和滴度的残余原料的进一步利用是通过 放置与第一个生物反应器串联的包含固定的产物耐受性突变微生物的第二个生物反应器 实现的，如图8所示。附加进料可以按需添加以进一步提高生产率和滴度并由此降低分离 和回收的能量需求。在发酵过程结束时，发酵培养液被传送以用于分离和回收发酵产物。如将被理解的那样，多个生物反应器的构型是可能的。两个或多个生物反应器可 以用作具有悬浮细胞或固定细胞的主生物反应器。可以将两个或多个生物反应器串联安 放，且每个相继的生物反应器包含具有对产物的更高耐受性的突变微生物。另外，对于串联 的生物反应器，对于每个生物反应器的具体工艺参数可以被优化，诸如稀释率和进料率、培 养基组分以及温度。在串联的各个生物反应器包含不同的微生物菌株或物种或微生物的聚 生体时这一特征可能是特别重要的。不考虑生物反应器的构型，通过再循环来自分离和回收阶段的加工过的发酵流出 液获得原料和水利用上的进一步节约，其中加工过的发酵流出液可以充当生物反应器中的 起始发酵培养基的基础或进料流。以这种方式，利用未同化的和/或回收的养分和矿物质 (例如铁)。X寸于诛雇的固体支措体材料,《充床区、膨胀床区禾Π H Hd的示钢卜件石角定
实施例9-13举例说明用来计算双重模式生物反应器的具体设计参数的方法。在 这些实施例中，选择骨炭作为固体支持体材料，使用该相同方法或相似方法也可以产生其 他固体支持体和半固体支持体的设计参数。实施例9 骨炭颗粒等效盲径的计算骨炭颗粒具有不规则形状，然而，可以由终端沉降速度计算等效直径，由此给出相 同密度的“等效”球体的颗粒-液体相互作用的估计。由于在骨炭形状和大小上的差别，获 得对于平均沉降速度和对于平均沉降速度的+/_—个标准差(+/-ο)的等效直径。骨炭颗粒信息骨炭颗粒密度大小形状沉降速度堆密度空隙率类型(g/mL)(微米)(cm/s士σ )(g/mL)5 >< 82.273000-5000变平面11.42 ±2.570.720.62510 ><282.36900-2500矩形和平面6.40 ± 1.560.690.6320 >< 602.38400-1300正方形到碎4.42 ±0.970.740.65_片形状_图9A显示包括具有不同大小的目、沉降速度(cm/s)以及等效直径(μ m)的骨炭 颗粒的三个非限制性实例的表。图9B是使用终端沉降速度，在4%葡萄糖溶液中5X8型骨 炭的等效直径的图示。实施例10 骨炭颗粒的最小流化谏度使用压力降的Ergon方程完成使骨炭颗粒流化所需的最小液体速度的估计。基于 颗粒密度和实施例9中公开的等量球面直径(equivalent spherical diameter)计算三种 类型骨炭颗粒的这种最小流化速度(Umf)。采取的液体性质是4%葡萄糖水溶液在35°C的 性质。对于每种颗粒类型，3种尺寸用于等效直径，对应于报道的平均沉降速度和各自平 均值的+/_ —个标准差(+/_ σ )(参见实施例9)。最小流化速度取决于流化之前的填充密度(空隙率，￡mf)。因为这是未知的仍是 未知的，因而对一定范围的空隙率计算结果。对于球形颗粒，ε mf的常见值是在0. 35-0. 45 范围内。对于具有奇怪形状和混合大小的颗粒，空隙率可能是显著不同的。三种类型骨炭的结果呈现在图10、11和12所示的表和图中。图10A、11A、12A是 显示以5 X 8、10 X观和20 X 60型骨炭在4 %葡萄糖溶液中的不同等效直径，经一定范围的 空隙率分别计算出的最小流化速度(Umf)的表。图10B、11B、12B是对不同等效直径，经一定 范围的空隙率计算出的最小流化速度(Umf)的图示。为了能够流化每种类型骨炭中的较大颗粒(+1 σ大小)，采取的最小流化速度不 低于对应于在0. 45的ε mf的每种类型中较大直径的那些最小流化速度，如以下列出的骨炭类型最小流化谏度(cm/s)5X81.39410X280.37120X600.144由于奇怪形状的颗粒、每种类型的大小是一定范围和未知的填充密度，这些最小流化速度是具有某种程度不确定性的估计值。采用以上所列出的值作为设备能力的最小 值。以填充床模式的操作将在较低速度发生，并且以流化膨胀床模式的操作将在略高的速 度发生。另外，所述计算结果是对于清洁颗粒的；当生物膜在颗粒上生长时，预期在有效直 径上和在速度需求上将存在改变。对于这些不确定性，建立了安全系数，即超过这些速度的 某种能力。实施例11 流化的骨炭颗粒的床膨胀当固体颗粒被向上流动的液体流化时，对于比最小流化速度大的液体速度，床膨 胀超过初始膨胀床的水平。使用Richardson&Zaki的模型(Richardson, J. F. ^P Zaki, W. N. 1954. Sedimentation and fluidization =Part I (沉积和流化第 I 部分)· Trans. Inst. Chem. Eng. 32 :35-53)禾口 Richardson&Khan 的相关性(Khan, A. R.禾口 Richardson, J. F. 1989.Fluid-particle interactions and flow characteristics of fluidized beds and settling suspensions of spherical particles (液体一颗粒相互作用禾口、流化床的、流 动特点以及球状颗粒的沉降悬浮).Chem. Eng. Comm. 78 :111-130)，编写程序来估计三种类 型骨炭颗粒(5X8、10X^* 20X60)的床膨胀水平。对于单尺寸颗粒形成了最初的相关 性，并因此包含某种程度的不确定性，因为每种类型骨炭具有一定范围的颗粒大小。对于这 种分析，应用该模型如同床包含直径等于等效“平均”直径的单尺寸颗粒。为了获得对可能 的变化的一些估计，按照沉降速度对单尺寸颗粒重复计算等于+1σ “较大值”和-Io “较 小值”的直径等效直径(ym)骨炭类型 较大倌 平均倌较小倌5X8988763550
10X28 451341239 20X60 277215156
床膨胀不仅取决于颗粒大小和液体速度，而且取决于床直径和最小流化的 空隙度(ε mf)。对于这个实施例，分析使用了 D床=IOcm的床直径和ε mf = 0. 5的空隙率。结果呈现在图13、图14和图15所示的表和图中，并且是以膨胀床的总高度与填充 床高度之比(Η/Η_)的形式。图13Α、14Α、15Α显示用于计算床膨胀水平的参数。图13Β、 14Β、15Β分别是骨炭类型5 X 8、10 X观和20 X 60的床膨胀的图示。在每种类型骨炭中的较 大和较小颗粒之间以这一比率扩展对于5X8型(图1 是最大的，而对于20X60型是最 小的(图15)。这暗示对于5X8骨炭在生物反应器的膨胀区中保留较小颗粒更为困难，对 于10 X观骨炭更容易，并且对于20 X 60骨炭最容易。对于能够在膨胀床和流化床两种模式下运转的生物反应器而言，期望在床膨胀区 中保留较小颗粒(图19和图20)，而仍然实现较大颗粒的流化。因此，对于每种类型的骨 炭，处在液体表观速度的较小颗粒的膨胀床总高度与填充床高度之比(H/Ht_)只略大于较 大颗粒的最小流化速度。从计算的表和图，这种状况对于每种类型骨炭见于如下表观速度 膨胀床的总高度与填充床(Umf cm/s) 高度之比Η/Η填充骨炭类型 对于较大颗 粒对于较小颗粒5X81.881.38
权利要求
1.一种用于在生物反应器中制备产物的方法，所述方法包括i)培养微生物，其中所述微生物被适应或诱变以表现出与对应的非适应或非诱变的微 生物的产物耐受性相比对所述产物至少150%的产物耐受性；和 )收获所述产物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述适应的微生物或突变的微生物表现出对所述产 物至少200%的耐受性。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物包括单个物种。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物包括丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)、紫色梭菌(Clostridium puniceum)、糖 丁 酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)、1 肠球菌(Enterococcus faecium)、享鸟鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、金黄丁 酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、{[Μ 破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)或热角军 H 梭菌 (Clostridium thermosaccharoIyticum)。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述适应的微生物或突变的微生物是丙酮丁醇梭 菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述产物是丁醇。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌表现出 对至少2%丁醇的耐受性。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物被固定在固体支持体上。
9.如权利要求8所述的方法，所述方法还包括以下步骤通过使包含适应的细胞或突 变的细胞的发酵培养基循环经过所述生物反应器来将所述适应的微生物或突变的微生物 固定在所述固体支持体上。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述微生物表现出与在液体培养基中表现出的产 物耐受性相比在固体支持体上增强的产物耐受性。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述固体支持体是半固体或固体。
12.如权利要求8所述的方法，其中所述固体支持体包括多孔材料。
13.如权利要求8所述的方法，其中所述固体支持体包括选自由以下组成的组的材料 骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤包括使用串联或平行排列的至少两 个生物反应器。
15.如权利要求14所述的方法，所述方法还包括在所述至少两个生物反应器的至少一 个中使用悬浮培养。
16.如权利要求14所述的方法，所述方法还包括在所述至少两个生物反应器的至少两 个中使用固定的培养物。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述至少两个生物反应器的至少一个是连续培养。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤包括以分批培养、补料-分批培养或 连续培养来培养所述微生物。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤是在填充床生物反应器或流化床生物反应器中进行。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述流化床生物反应器是膨胀床生物反应器。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述培养步骤是在适合于以填充床或流化床模式 操作的生物反应器中进行。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述生物反应器包括a)填充床区，所述填充床区适合于容纳固体支持体；b)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操作所述生物反应 器时，所述床膨胀区适合于容纳所述固体支持体；和c)颗粒脱离区，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止所 述固体支持体从所述生物反应器中出去。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述生物反应器还包括与所述填充床区接合的入 口分配区。
24.如权利要求22所述的方法，其中柱还包括柱膨胀区。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述生物反应器在入口分配区中具有的压力降不 超过跨生物反应器整个长度总压力降的30%。
26.如权利要求22所述方法，其中所述颗粒脱离区的直径比所述填充床区或所述膨胀 床区的直径大。
27.如权利要求1所述的方法，其中所述收获步骤包括从所述培养物中连续提取所述产物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述连续提取是使用汽提气、溶剂、吸收材料、全 蒸发膜或蒸馏进行的。
29.如权利要求7所述的方法，其中所述培养步骤包括在提供至少6g/L/小时的丁醇生产率的条件下培养所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。
30.如权利要求7所述的方法，其中每天生产至少1000升的丁醇。
31.如权利要求7所述的方法，其中每天生产至少1500升的总溶剂。
32.如权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤包括培养至少7天。
33.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物包含异源基因。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述异源基因编码产物生物合成途径中的酶。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述酶选自由以下组成的组磷酸转乙酰酶、乙酸 激酶、NAD依赖性β -羟丁酰辅酶A脱氢酶、丁酰辅酶A脱氢酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、乙 酰辅酶A乙酰转移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、NADH依赖性丁醇脱氢酶B、NADH依赖性 丁醇脱氢酶Α、醛-醇脱氢酶、乙酰辅酶A乙酰转移酶、醛脱氢酶、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移 酶A亚基、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶B亚基和乙酰乙酸脱羧酶。
36.一种用于制备产物的系统，所述系统包括生物反应器，所述生物反应器包括a)与固体支持体接触的生长培养基；b)固定在所述固体支持体上的微生物，其中所述微生物被适应或诱变以表现出与对应 的非适应或非诱变微生物的产物耐受性相比对所述产物至少150%的产物耐受性。
37.如权利要求36所述的系统，其中所述适应的微生物或突变的微生物表现出对所述 产物至少200%的耐受性。
38.如权利要求36所述的系统，其中所述微生物包括以下属梭菌属、肠球菌属、克雷 伯氏菌属、乳杆菌属或芽孢杆菌属。
39.如权利要求36所述的系统，其中所述适应的微生物或突变的微生物是丙酮丁醇梭 菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。
40.如权利要求36所述的系统，其中所述产物是丁醇。
41.如权利要求39所述的系统，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌表现 出对至少2%丁醇的耐受性。
42.如权利要求36所述的系统，其中所述微生物包含异源基因。
43.如权利要求42所述的系统，其中所述异源基因编码产物生物合成途径中的酶。
44.如权利要求43所述的系统，其中所述酶选自由以下组成的组磷酸转乙酰酶、乙酸 激酶、NAD依赖性β -羟丁酰辅酶A脱氢酶、丁酰辅酶A脱氢酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、乙 酰辅酶A乙酰转移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、NADH依赖性丁醇脱氢酶B、NADH依赖性 丁醇脱氢酶Α、醛-醇脱氢酶、乙酰辅酶A乙酰转移酶、醛脱氢酶、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移 酶A亚基、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶B亚基和乙酰乙酸脱羧酶。
45.如权利要求36所述的系统，所述系统包括用于将所述微生物保持在连续培养中的直ο
46.如权利要求45所述的系统，其中发酵工艺是连续培养，还包括在产物纯化过程中 回收的发酵培养液的养分和矿物质的再循环和再利用。
47.如权利要求36所述的系统，其中所述微生物表现出与在液体培养基中表现出的产 物耐受性相比在固体支持体上增强的产物耐受性。
48.如权利要求36所述的系统，其中所述固体支持体包括多孔材料。
49.如权利要求36所述的系统，其中所述固体支持体包括选自由以下组成的组的材 料骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。
50.如权利要求39所述的系统，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌被培 养在提供至少6g/L/小时的丁醇生产率的条件下。
51.如权利要求39所述的系统，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌被培 养在提供至少10g/L/小时的总溶剂生产率的条件下。
52.如权利要求40所述的系统，其中每天生产至少1000升的丁醇。
53.如权利要求40所述的系统，其中每天生产至少1500升的总溶剂。
54.一种生物反应器，所述生物反应器包括a)填充床区，所述填充床区适合于容纳固体支持体；b)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操作所述生物反应 器时，所述床膨胀区适合于容纳所述固体支持体；和c)颗粒脱离区，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止所 述固体支持体从所述生物反应器中出去。
55.如权利要求M所述的生物反应器，其中所述填充床区与所述床膨胀区的结合高度 (H)与所述填充床区的高度(Hp)之比大于1.01。
56.如权利要求M所述的生物反应器，所述生物反应器还包括适合于安放在所述床 膨胀区和所述颗粒脱离区之间的柱膨胀区，其中所述柱膨胀区的上游端与所述床膨胀区接合，并且所述柱膨胀区的下游端与所述颗粒脱离区接合。
57.如权利要求56所述的生物反应器，其中所述柱膨胀区包括距水平线向上倾斜至少 10°的倾斜角度。
58.如权利要求M所述的生物反应器，所述生物反应器还包括与所述颗粒脱离区接合 的气体-液体分离区。
59.如权利要求M所述的生物反应器，所述生物反应器被设置成以填充床模式或以膨 胀床模式操作。
60.如权利要求M所述的生物反应器，所述生物反应器还被设置成在填充床模式和膨 胀床模式的操作之间交替。
61.如权利要求M所述的生物反应器，所述生物反应器能够连续发酵至少100小时。
62.如权利要求M所述的生物反应器，其中所述固体支持体是半固体或固体。
63.如权利要求M所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括多孔材料。
64.如权利要求M所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括至少50m2/g的表面积。
65.如权利要求M所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括至少0.3g/cm3的堆密度。
66.如权利要求M所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括至少60的球盘硬度数。
67.如权利要求M所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括至少20MaP的屈服强度。
68.如权利要求M所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括选自由以下组成的组 的材料骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。
69.一种用于在固体支持体上发酵生物学产物的生物反应器，所述生物反应器包括a)填充床区，包括其中的固体支持体，所述固体支持体包含其上用于发酵所述生物学 产物的微生物；b)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操作所述生物反应 器时，所述床膨胀区适合于包含所述固体支持体；和c)颗粒脱离区，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止所 述固体支持体从所述生物反应器中出去。
70.如权利要求69所述的生物反应器，其中所述填充床区与所述床膨胀区的结合高度 (H)与所述填充床区的高度(Hp)之比大于1.01。
71.如权利要求69所述的生物反应器，所述生物反应器还包括适合于安放在所述床 膨胀区和所述颗粒脱离区之间的柱膨胀区，其中所述柱膨胀区的上游端与所述床膨胀区接 合，并且所述柱膨胀区的下游端与所述颗粒脱离区接合。
72.如权利要求71所述的生物反应器，其中所述柱膨胀区包括距水平线向上倾斜至少 10°的倾斜角度。
73.如权利要求69所述的生物反应器，所述生物反应器还包括与所述颗粒脱离区接合 的气体-液体分离区。
74.如权利要求69所述的生物反应器，所述生物反应器被设置成以填充床模式或以膨胀床模式操作。
75.如权利要求69所述的生物反应器，所述生物反应器还被设置成在填充床模式和膨 胀床模式的操作之间交替。
76.如权利要求69所述的生物反应器，所述生物反应器能够连续发酵至少100小时。
77.如权利要求69所述的生物反应器，其中所述微生物包括以下属梭菌属、肠球菌 属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属或芽孢杆菌属。
78.如权利要求69所述的生物反应器，其中所述微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌 或糖丁酸梭菌。
79.如权利要求78所述的生物反应器，其中所述产物是丁醇。
80.如权利要求78所述的生物反应器，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭 菌表现出对至少2%丁醇的耐受性。
81.如权利要求69所述的生物反应器，所述生物反应器还包括以下步骤通过使包含 所述微生物的发酵培养基循环经过所述生物反应器来将所述微生物固定在所述固体支持 体上。
82.如权利要求81所述的生物反应器，其中所述循环的发酵培养基包含固定在颗粒上 的微生物。
83.如权利要求69所述的生物反应器，其中所述固体支持体是半固体或固体。
84.如权利要求69所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括多孔材料。
85.如权利要求69所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括选自由以下组成的组 的材料骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。
86.一种用于制备生物学产物的方法，所述方法包括a)将微生物培养在生物反应器中，所述生物反应器包括i)填充床区，包括其中的固体支持体，所述固体支持体包括其上用于发酵所述生物学 产物的微生物； )床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操纵所述生物反应 器时，所述床膨胀区适合于包含所述固体支持体；知iii)颗粒脱离区，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止 所述固体支持体从所述生物反应器中出去；以及b)收获所述产物。
全文摘要
提供了用于适应或选择具有提高的产物耐受性的微生物的方法。另外，公开了能够以填充床或流化床操作的生物反应器，以及使用该生物反应器培养被适应或选择增加的产物耐受性的微生物的方法。
文档编号C12M3/04GK102057046SQ200980121678
公开日2011年5月11日 申请日期2009年4月9日 优先权日2008年4月9日
发明者P·R·康塔格, 亨德里克斯·J·米尔曼, 伊恩·马多克斯, 戴维·C·沃尔瑟, 斯泰西·M·伯恩斯-盖蒂施, 约翰·C·陈, 阿尔文·W·尼诺 申请人:钴技术有限公司