用于对细胞和生物分子进行计数的系统和方法

专利名称：用于对细胞和生物分子进行计数的系统和方法
技术领域：
本发明主要地涉及用于对细胞和生物分子进行计数的系统和方法。
背景技术：
通过测试生物样本来检测、鉴定、量化和表征感兴趣的生物分子或者细胞如干细 胞或者癌细胞是医学诊断和医学研究领域中的重要方面。例行地分析生物溶液如血液、脊 髓液、细胞培养液和尿液确定它们的微观粒子浓度。作为例子，为了确定生物溶液中的细胞浓度，一种常用方法是将包含细胞的溶液 扩展到薄层中而在竖直方向上无细胞重叠。通过将溶液的高度保持于已知恒定水平来确定 精确体积。在光学显微镜之下查看并且在限定区域中清点细胞。为了消除显微镜所引起的 变化，在计数室中优选限定区域的网格。常用细胞计数设备称为如在Risch (第1，693，961 号美国专利)和Hausser等人(第2，039，219号美国专利)中公开的血球计。近来已经使用流式血细胞计数(一种用于对流体流中悬浮的微观粒子进行计数、 检查和分类的技术)来实现细胞计数。将单个波长的光束如激光引到流体动力聚焦的流体 流上。将多个检测器瞄准流穿过光束时所在的点；一个检测器与光束成直线而若干检测器 与它垂直。穿过光束的各悬浮粒子以某一方式散射光，并且可以将粒子中发现的或者附着 到粒子的荧光化学剂激发成发射波长比光源更高的光。散射光和荧光的该组合由检测器获 得，并且通过分析在各检测器的亮度波动，然后有可能导出与各个别粒子的物理和化学结 构有关的各种类型的信息。市面上的一些流式血细胞计数器已经无需荧光并且仅将光散射 用于测量。其他流式血细胞计数器形成用于各细胞的荧光、散射光和透射光图像。除了用于流式血细胞计数系统的高得无人问津的成本($150，000至$500，000)之 外，还存在与流式血细胞计数关联的诸多技术问题。例如，许多技术问题归因于流式血细胞 计数器的喷嘴中的细胞聚集和堵塞或者粘着，从而使流体流偏转并且变为与光学器件未对 准。此外，除非进行严格预防，引起的样本成烟雾状散开妨碍对生物危害样本(例如可能受 HIV或者肝炎病毒感染的人类血细胞)进行分类。另外，流式血细胞计数仅能提供对细胞浓度和细胞尺寸的间接测量。流式血细胞 计数依赖于混合样本与已知浓度的颗粒、确定通过流式血细胞计数器中的检测器的颗粒数 目以及将颗粒计数与通过检测器的细胞数目相关以确定样本中的细胞浓度。尚未满足对用于对生物分子和细胞进行计数的高效和成本有效系统和方法的需要。

发明内容
本发明通过提供一种细胞计数系统来克服与流式血细胞计数关联的问题，该系统 拍摄已经加载到具有固定高度的室中的样本中的静态细胞群落的图像。由于系统利用具有 固定高度的有盖的室，所以可以根据细胞计数来确定细胞浓度。另外，本发明的系统可以提 供对细胞浓度和细胞尺寸的直接测量而无需如在流式血细胞计数中需要的颗粒。本发明提 供用于检测、鉴定、量化和表征感兴趣的细胞而无与流式血细胞计数关联的诸多技术问题 并且成本明显更少的能力。本发明的一种示例细胞计数系统包括有盖的室，具有已知高度并且配置成保持 样本中的生物分子或者细胞悬浮液；至少一个荧光光源，连接到至少一个荧光光束收窄设 备；亮场光源，连接到亮场光束收窄设备；显微镜物镜；检测设备；荧光滤光器组件，用于允 许激发光照射样本并且仅允许来自样本的发射光由检测设备成像；以及可移动光快门，用 于在荧光检测期间阻止亮场光。本发明的另一示例细胞计数系统包括闭合的室，配置成保持样本中的生物分子 或者细胞悬浮液并且允许计算询问样本的体积；至少一个荧光光源，连接到至少一个荧光 光束收窄设备；亮场光源，连接到亮场光束收窄设备；显微镜物镜；检测设备；荧光滤光器 组件，用于仅允许激发光照射样本并且仅允许来自样本的发射光由检测设备成像；以及可 移动光快门，用于在荧光检测期间阻止亮场光。该系统可以操作连接到其上安装有细胞计数分析软件的计算机。荧光光束和/或 亮场光束收窄设备可以是校准器。荧光光源和亮场光源可以是发光二极管。检测设备可以 是可以包括热电冷却能力的相机，例如电荷耦合器件或者CCD相机。有盖的室可以包括样 本引入端口和排气端口以及计数网格。在某些实施例中，计数网格为室的顶部的集成部分。 可选择地，计数网格为室的底部的集成部分。计数网格的线宽度范围可以从约0. 1微米到 约1mm。计数网格的线宽度范围可以从约1微米到约25微米。计数网格的线厚度范围可以 从约0. 1微米到约50微米。该系统可以被配置成用单个图像捕获样本的全部。可选择地，该系统可以被配置 成用单个图像捕获样本的部分。样本可以是人类或者动物组织或者体液或者源于植物或者活体的样本。例如，样 本可以是血清、细胞培养上清液或者细胞溶解液。生物分子可以是DNA、RNA或者蛋白质。 生物分子或者细胞可以表明疾病或者疾病状态。本发明的另一方面提供一种用于确定细胞浓度或者数目计数的方法，这些细胞表 达样本中的细胞群落中的生物标记，该方法包括使包括表达生物标记的细胞的样本与特 异性地结合生物标记的荧光标记试剂接触；将样本加载到具有已知高度的有盖的室中，其 中细胞群落悬浮于室内；采集室中的样本中的细胞群落的单个静态亮场图像；采集室中的 样本中的细胞群落的单个静态荧光图像；以及比较来自亮场图像的细胞计数与来自荧光图 像的细胞计数以确定表达细胞群落中的生物标记的细胞浓度或者数目计数。在加载步骤之 前，该方法还可以包括使细胞群落与使细胞群落可渗透的试剂接触。生物标记可以是细胞表面生物标记。可选择地，生物标记可以是细胞间生物标记。荧光标记试剂可以是具有用于生物标记的抗原决定基的荧光标记抗体。生物标记可以与特 定疾病或者疾病状态关联。本发明的另一方面提供一种用于确定样本中的细胞群落中的干细胞浓度或者数 目计数的方法，该方法包括使包括干细胞的样本与特异性地结合样本中的干细胞的荧光 标记试剂接触；将样本加载到具有已知高度的有盖的室，其中细胞群落悬浮于室内；采集 室中的样本中的细胞群落的单个静态亮场图像；采集室中的样本中的细胞群落的单个静态 荧光图像；以及比较来自亮场图像的细胞计数与来自荧光图像的细胞计数以确定细胞群落 中的干细胞浓度或者数目计数。荧光标记试剂可以是干细胞生物标记特有的荧光标记抗体或者涂有干细胞生物 标记特有的荧光标记抗体的粒子。示例干细胞生物标记包括TRA-1-81、TRA-1-60、Thy-U SSEA-3、SSEA4、0ct_4、CD9、CD30 和碱性磷酸酶。本发明的另一方面提供一种用于确定疟疾感染率的方法，该方法包括使来自患 有疟疾的受试者的红细胞样本与疟疾寄生虫特有的荧光标记试剂接触；将样本加载到具有 已知高度的有盖的室中，其中细胞悬浮于室内；采集室中的样本中的细胞的单个静态亮场 图像；采集室中的样本中的细胞的单个静态荧光图像；以及比较来自亮场图像的细胞计数 与来自荧光图像的细胞计数以确定受试者中的疟疾感染率。本发明的另一方面提供一种用于鉴定样本中的脂肪细胞的方法，该方法包括使 包括脂肪细胞的样本与特异性地结合脂肪细胞的荧光标记试剂接触；将样本加载到具有已 知高度的有盖的室中，其中细胞悬浮于室内；采集样本在室中的单个静态亮场图像；采集 样本在室中的单个静态荧光图像；以及比较亮场图像与荧光图像以鉴定脂肪细胞。本发明的另一方面提供一种用于检测样本中的生物分子的方法，该方法包括使 样本与涂有生物素化抗体的粒子和偶联到荧光指示剂的链霉亲和素接触；将样本加载到具 有已知高度的有盖的室中，其中生物分子悬浮于室内；采集室中的样本的单个静态亮场图 像；采集室中的样本的静态荧光图像；以及比较亮场图像与荧光图像以检测样本中的生物 分子。在采集亮场图像之前，该方法还可以包括清洗非结合粒子。生物分子可以与特定疾 病或者疾病状态关联。本发明的另一方面提供一种用于确定样本中的肝细胞群落中的活肝细胞浓度或 者数目计数的方法，该方法包括使包括肝细胞的样本与至少一个荧光标记试剂接触；将 样本加载到具有已知高度的有盖的室中，其中肝细胞群落悬浮于室内；采集肝细胞群落的 两个或者更多静态图像，其中第一和第二图像选自亮场图像、活肝细胞的荧光图像和死肝 细胞的荧光图像，其中第一图像不同于第二图像；比较来自第一图像的细胞计数与来自第 二图像的细胞计数以确定肝细胞群落中的活肝细胞浓度或者数目计数。肝细胞群落可以与两个不同荧光试剂接触。第一荧光试剂特异性地结合活肝细 胞，而第二荧光试剂特异性地结合死肝细胞。第一荧光试剂可以是吖啶橙而第二荧光试剂 可以是碘化丙啶。第一图像可以是活肝细胞的荧光图像，第二图像可以是死肝细胞的荧光图像，并 且可以通过比较来自活肝细胞的荧光图像的细胞计数与来自死肝细胞的荧光图像的细胞 计数来确定肝细胞群落中的活肝细胞浓度。可选择地，第一图像可以是亮场图像，第二图像 可以是死肝细胞的荧光图像，并且可以通过比较来自亮场图像的细胞计数与来自死肝细胞的荧光图像的细胞计数来确定肝细胞群落中的活肝细胞浓度。可选择地，第一图像可以是 亮场图像，第二图像可以是活肝细胞的荧光图像，并且可以通过比较来自亮场图像的细胞 计数与来自活肝细胞的荧光图像的细胞计数来确定肝细胞群落中的活肝细胞浓度。在这些方法中，单个静态亮场图像和单个静态荧光图像中的各图像可以是整个样 本的图像。可选择地，单个静态亮场图像和单个静态荧光图像中的各图像可以是样本的部 分图像。单个图像是指非扫描图像。单个图像包括将用于分析(例如用于获得平均值)的 相同帧的多个图像。


图1是本发明的细胞计数和分析系统的一个实施例的示意图。图2是示例系统的一个实施例的具有某些部件的设计细节的绘图。图3是示例系统的一个实施例的描绘了亮场和荧光光源、校准器和用于荧光检测 的滤光器组件的绘图。图4是描绘了示例系统的某些部件的绘图。图5是描绘了示例系统的某些部件的绘图。图6是示出了用台盼蓝(trypan blue)着色的肝细胞的画面。图7是示出了荧光着色的肝细胞的画面。图8是示出了荧光着色的肝细胞的另一画面。图9是示出了荧光着色的肝细胞的另一画面。图10是示出了在亮场之下成像的肝细胞的画面。图11是示出了荧光着色的肝细胞的另一画面。图12是示出了荧光着色的肝细胞的另一画面。图13是示出了已经在亮场之下放大和成像的肝细胞的画面。图14是示出了已经放大和荧光成像的肝细胞的画面。
具体实施例方式已经通过对组织样本或者体液的微观检查来阐明许多疾病的生物学机制。组织病 理学检查也已经允许开发针对多种疾患的有效医学治疗。在标准解剖病理学中，基于细胞 形态学和着色特性来进行诊断。例如，可以检查肿瘤样本以表征肿瘤类型并且提示患者是 否将对特定形式的化学疗法起反应。对通过标准方法(比如苏木精和曙红)着色的组织样 本的微观检查和归类已经明显改进了癌治疗。分子医学的近来发展已经提供了理解疾病的细胞机制并且选择成功可能性最大 的适当治疗的甚至更大的机会。例如，一些激素依赖的乳房肿瘤细胞具有增加的雌激素表 达，这表明从其取得肿瘤的患者将可能对某些抗雌激素药物治疗起反应。其他诊断的和预 示的细胞改变包括存在肿瘤特异性的细胞表面抗原(如在黑素瘤中那样)、产生胚蛋白(比 如由肠胃肿瘤产生的癌胚糖蛋白抗原)和基因异常(比如在肿瘤中的活化致癌基因)。多 种技术已经演变成检测这些细胞异常的存在，包括利用单克隆抗体的免疫分型、使用核酸 探针的原位杂交和使用聚合酶链反应(PCR)的DNA扩增。当前自动化分析系统不能以成本高效、对时间敏感和可再现的方式利用和鉴定变化的生物标记已经妨碍在辅助对有效疗法的诊断和鉴定时对这样的生物标记的有效使用。 因此，先前技术和系统已经常常证实不足以对如下组织样本的高效分析，这些组织样本需 要对多种独立微观、组织和/或分子特性的迅速平行分析。此外，人工方法可能极为耗时并且可能需要高度专业训练以鉴定和/或量化细 胞。这不仅对于肿瘤细胞鉴定和检测而言成立，而且对于范围为嗜中性的碱性磷酸酶化验、 网状细胞计数和成熟度评定等的其他应用而言成立。关联人力除了可能由于长时间乏味的 人工检查而产生的潜在错误之外还造成这些流程的成本高昂。本发明提供用于检测、鉴定、量化和表征感兴趣的细胞和生物分子的能力。本发明 一般涉及用于对样本中的细胞和生物分子进行计数的系统和方法。样本包括从活体获得或 者衍生的生物材料。通常，样本包括细胞、组织或者生物分子，比如蛋白质、多核苷酸(例如 DNA或者RNA)、有机材料和前述的任何组合。这样的样本包括但不限于毛发、皮肤、组织、培 养的细胞、培养的细胞培养基和体液。组织是连接的细胞和/或细胞外基质材料的团块(例如源自人类或者其他哺乳动 物的CNS组织、神经组织、眼组织、肝组织、胎盘组织、乳腺组织、肠胃组织、肌骨骼组织、泌 尿生殖组织等)，并且包括与细胞和/或组织关联的连接材料和液体材料。体液是例如源自 人类或者其他哺乳动物的液体材料。这样的体液包括但不限于血液、血浆、血清、血清衍生 物、胆汁、黏痰、唾液、汗液、羊水、乳汁和脑脊髓液(CSF)(如腰椎或者心室CSF)。样本也可 以是包含细胞或者生物材料的介质。本发明的系统也可以用于询问细胞系。细胞系是指在适当介质和条件给定时可以 无限生长的特定细胞。本发明的系统可以用来询问任何类型的细胞系。细胞系可以是哺乳 动物细胞系、昆虫细胞系或者植物细胞系。示例细胞系可以包括肿瘤细胞系或者干细胞系。参照图1，提供了本发明的细胞计数系统100的一个实施例的示意图。计数系统 100包括有盖计数室101，该计数室具有已知高度并且配置成保持样本中的生物分子或者 细胞悬浮液。由于计数室具有已知高度，所以存在已知的询问数量，并且可以通过用室的 已知高计算询问面积(一起限定询问样本的体积)来确定样本中的细胞浓度。在QiU(第 2004/0145805号美国专利申请)中示出了一种示例计数室和制作这样的室的方法。该室可 以包括样本引入端口和便于加载该室的排气端口。该室也可以包括用于聚焦和放松(ease) 细胞的计数网格。在Qiu(第7，329，537号美国专利和第2004/0145805号美国专利申请) 中示出了示例计数网格。细胞计数系统100还包括连接到至少一个荧光光束收窄设备103的至少一个荧光 (FL)光源102。系统100也包括连接到亮场光束收窄设备105的亮场(BF)光源104。荧 光光源和亮场光源可以是发光二极管。荧光光束收窄设备和亮场光束收窄设备可以是校准
ο细胞计数系统100还包括显微镜物镜106、检测设备107和可移动光快门108。检 测设备可以是用于采集图像的相机，比如CCD相机。相机可以配有冷却能力。在某些实施 例中，显微镜物镜移动在操作连接到系统100的计算机109的控制之下。在其他实施例中， 显微镜物镜是固定的。系统100还包括荧光滤光器组件110以允许来自荧光光源102的激 发光照射室101中的样本，并且仅允许来自样本的发射光由检测设备107成像。系统100 也包括可移动光快门108以在荧光检测期间阻止亮场光。
计数室101具有可以预先选择、调节或者固定的已知高度。计数室101有盖或者 以别的方式闭合，从而使得其中的样本悬浮液不会由于蒸发而损失体积。通过将样本吸入 到室101的样本引入端口中来向室101加载样本。随着样本载入到室中，空气通过室101 中的排气端口离开室101。示例样本尺寸为20μ1。一旦向室101加载样本，通过系统的壳 中的槽将室101加载到计数系统100中。一旦拍摄图像，可以根据计数室的高度和成像的样本的面积来获得询问样本体 积。因此，可以获得询问样本体积并且针对拍摄的各图像已知该体积。应当注意可以随着 应用而变化室高度，只要可以获得或者已知询问样本体积。系统100被配置用于室101中的样本的亮场成像和荧光图像。细胞计数系统100 的部件装入壳中。亮场光源104定位于壳的基部并且配置成将光发射到亮场光源104上方 成直线定位的室101中的样本上。亮场光束收窄设备105在室101与亮场光源104之间。 光束收窄设备聚焦从亮场光源104发射的光，并且将光引到室101中的样本上。可移动光 快门108也定位于室101与亮场光源104之间。可移动光快门108位于亮场光束收窄设备 105上方和室101下方。光快门108连接到用于移动快门的机构，比如电机或者螺线管。光 快门108与亮场光源104不成直线地机械移动以允许来自亮场光源104的光在亮场成像期 间与室101中的样本交互作用。光快门108与亮场光源104成直线地机械移动以阻止来自 亮场光源104的光在荧光成像期间与室101中的样本交互作用。在来自亮场光源104的光穿过室101中的样本之后，光随后穿过显微镜物镜106。 显微镜物镜106负责主要图像形成并且参与确定系统100能够产生的图像质量。显微镜物 镜106也参与确定特定样本的放大率和可以在系统100中观察细微样本细节的分辨率。在 商业上可从Olympus America Inc. (Center Valley, PA)获得显微镜物镜。在来自亮场光源104的光穿过显微镜物镜106之后，来自样本的发射光穿过荧光 滤光器组件110，并且来自室101中的样本的发射光由检测设备107采集。荧光滤光器组 件110与亮场光源104、亮场光束收窄设备105、室101、显微镜物镜106和检测设备107成 直线。荧光滤光器组件110保证仅来自室101中的样本的发射光成像于检测设备107上。 示例检测设备是在商业上可从Olympus America Inc. (Center Valley, PA)获得的CCD相 机。向具有分析软件111的计算机109发送来自检测设备107的图像。该系统还包括用于室101中的样本的荧光成像的至少一个荧光光源102。当用高 能光(激发光)照射某些化合物时，它们发射不同更低频率的光。荧光光源102与亮场光源 104、亮场光束收窄设备105、室101、显微镜物镜106和检测设备107不成直线。荧光光源 102通过荧光光束收窄设备103向荧光滤光器组件110发射激发光。荧光滤光器组件110 将来自荧光光源102的激发光重新引向室101中的样本。激发光照射室101中的样本，并 且来自样本的发射光穿过荧光滤光器110并且由检测设备107采集。荧光滤光器110保证 仅来自荧光光源102的激发光照射室101中的样本，并且仅来自室中的样本中的发射光由 检测设备107成像。即使图1示出了仅一组荧光光源、荧光光束收窄设备和荧光滤光器组件，但是两 组或者更多组荧光光源、荧光光束收窄设备和荧光滤光器组件可以用于荧光激发和发射检 测。当两组或者更多组荧光激发和发射在相同样本上可用时，多个荧光标记可以用于高级 化验。
在荧光检测期间，光快门108与亮场光源104成直线地机械移动以阻止来自亮场 光源104的白光在荧光成像期间与室101中的样本交互作用。图2-图5是示出本发明的细胞计数系统在壳移开时的不同视图和部件的绘图。图 2示出了细胞计数系统200。将包含样本的计数室201加载到系统200中。示出了亮场光 源204和表示为校准器的亮场光束收窄设备205定位成与样本室201成直线并且在样本室 201下方。示出了显微镜物镜206定位于室201上方并且与室201、亮场光源204和亮场光 束收窄设备205成直线。示出了荧光滤光器组件201定位于显微镜物镜206上方并且与显 微镜物镜206、室201、亮场光源204和亮场光束收窄设备205成直线。表示为CCD相机的检 测设备207定位于荧光滤光器组件210上方并且与荧光滤光器组件210、显微镜物镜206、 室201、亮场光源204和亮场光束收窄设备205成直线。图2也示出了荧光光源202和表示为校准器的荧光光束收窄设备203。此图示出 了荧光光源202和荧光光束收窄设备203与检测设备207、荧光滤光器组件210、显微镜物 镜206、室201、亮场光源204和亮场光束收窄设备205不成直线。荧光光源202被定位成 发射激发光通过荧光光束收窄设备203并到荧光滤光器组件210上。图2也示出了可移动 光快门208的位置和快门连接到的用于移动它的机构(如电机或者螺线管)。此图还示出用于将系统200连接到外部功率供应的引出插头211。也示出了用于 聚焦显微镜物镜206的聚焦调节设备212。聚焦设备表示为轮子并且可以加以人工调节直 至样本中的细胞或者生物分子的最佳聚焦。也示出了荧光通道切换器213，用于在两组或者 更多组荧光光源、荧光光束收窄设备和荧光滤光器组件用于荧光激发和发射检测的实施例 中切换荧光通道。当两组或者更多组荧光激发和发射在相同样本上可用时，多个荧光标记 可以用于高级化验。图3-图5从如图1-图2中所示不同定向描绘了图1-图2中所示系统。在这些 视图中，更容易看见荧光光源202和荧光光束收窄设备203。在这一附图中，示出了系统 200具有用于荧光激发和发射检测的两组荧光光源、荧光光束收窄设备和荧光滤光器组件 (202(a)和202(b))。这一视图还描绘了荧光光源202和荧光光束收窄设备203与荧光滤 光器组件210的对准。也示出了用于选择一组荧光光源202和荧光光束收窄设备203的荧 光通道切换器212和关联机构。也示出了检测设备207和可移动光快门208以及用于移动 光快门的机构。这里描述的细胞计数系统捕获室中的细胞或者生物分子的亮场和荧光图像，分析 细胞或者生物分子数、各细胞的尺寸和荧光强度，然后将该数据转换成浓度、尺寸和荧光直 方图和散射绘图。本发明的细胞计数系统可用于各种生物化验和其他应用。确定表达生物标记的细胞浓度或者数目计数生物标记参与细胞功能、细胞繁殖、分化、迁移、宿主防御等。生物标记可以是细胞 表面生物标记或者可以是细胞间生物标记。理解和鉴定生物标记并且量化细胞群落中的生 物标记浓度将提供让生物医学研究者开发更有效治疗药品以预防、治疗和治愈疾病的巨大 机会。生物标记可以是通过已知显微术、组织学或者分子生物学技术可鉴定的在样本中 存在的任何细胞组成。生物标记可以例如用于区分新生组织与非新生组织。这样的生物标 记也可以用来鉴定疾病或者病症(包括新生疾病或者病症)的分子基础。这样的生物标记可以例如是存在于细胞表面上的分子、过度表达的目标蛋白质、核酸突变或者存在于样本 中的细胞的形态特性。本发明的方法涉及到使包括细胞(表达生物标记)的样本与特异性地结合生物标 记的荧光标记试剂接触。如果生物标记为细胞表面生物标记，则在使样本与荧光标记试剂 接触之前无需更多步骤。如果生物标记为细胞间生物标记，则在使细胞与荧光标记试剂接 触之前可以先使样本的细胞可渗透。多种试剂可用于确定和分析细胞分子和机制。这样的试剂包括例如可用于如下原 位筛选化验的多核苷酸、多肽、小分子和/或抗体，这些原位筛选化验用于检测特异性地结 合到样本中存在的生物标记的分子。可以可检测地标记试剂，从而使得该试剂在结合或者 杂交到它的目标生物标记或者配体时可检测。可检测地标记任何前述试剂包括酶、荧光或 者放射性核素标记。其他报告方法和标记在本领域中众所周知。在本发明的方法中可用的试剂可以是抗体。在本发明的方法中可用的抗体包 括完整多克隆或者单克隆抗体及其片段，比如Fab和F(ab’)2。例如，单克隆抗体通过本 领域技术人员众所周知的方法(Kohler等人，Nature，256 :495，1975 ；以及Harlow等人， Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory，第 93-117 页，1988 年)由包含蛋白质片段 的抗原制成。荧光分子可以通过使用中间功能团来直接或者间接地结合到免疫球蛋白。在本发明的方法中可用的试剂也可以是核酸分子(例如寡核苷酸或者多核苷 酸)。例如，原位核酸杂交技术在本领域中众所周知并且可以用来鉴定存在于样本中的RNA 或者DNA生物标记。假如适当寡核苷酸或者多核苷酸试剂可用，则依赖于核酸杂交的筛选 流程使得有可能从任何样本中鉴定生物标记。例如，可以化学合成或者通过分子生物技术 来设计可以与编码目标多肽(例如，包括多肽的癌标记)的序列的部分对应的寡核苷酸试 剂。可以根据遗传密码来推断编码目标多肽的多核苷酸，但是必须考虑到密码的退化。对 于这样的筛选，通常在本领域技术人员已知的原位条件之下进行杂交。多个荧光标记在本领域中已知并且包括DAPI、Cy3、Cy3. 5、Cy5、CyS. 5、Cy7、伞形 酮、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光素(dichloro triazinylaminefluorescein)、丹磺酰氯或者藻红蛋白。荧光标记应当具有可区分的激发 和发射谱。当使用两个或者更多荧光标记时，它们应当具有分别相差某一最少值(通常约 为15-30nm)的不同激发和发射谱。差异程度通常将取决于在该过程中使用的滤光器类型。 下文在表1中提供了用于DAPI、FITC、Cy3、Cy3. 5、Cy5、CyS. 5和Cy7的典型激发和发射谱。表1荧光指示剂激发峰值发射峰值DAPI350450FITC490520Cy3550570Cy3.5580595Cy5650670Cy5.5680700Cy7755780一旦被标记，用吸液管吸入样本并且加载到系统的室中。通过将样本吸入到室的 样本引入端口中来向室加载样本。随着样本加载到室中，空气通过室中的排气端口离开室。 示例样本尺寸为20 μ 1。一旦向室加载样本，通过系统的壳中的槽将室加载到计数系统中。在细胞计数室内的悬浮液中的细胞样本由亮场(BF)光源和荧光(FL)光源照射。 光源可以是发光二极管。校准器可以用于光源。当在荧光检测模式中使用系统时，可移动 光快门用来封闭亮场光。荧光滤光器组件用来仅允许激发光照射样本并且仅允许来自样本 的发射光成像于相机传感器上。相机可以是具有热电冷却能力的CCD相机。使用本发明的计数系统来采集样本中的细胞群落的亮场图像。亮场图像针对样本 中的总细胞群落提供细胞计数。然后将系统切换到荧光模式并且采集细胞的荧光图像。仅 有已经由荧光标记试剂结合的细胞将在该模式中可见，因此在这一模式中将仅对荧光标记 细胞进行成像。荧光图像针对已经由荧光标记试剂结合的群落中的细胞数目提供细胞计 数。亮场图像和荧光图像中的各图像可以是整个样本的图像。可选择地，亮场图像和荧光 图像中的各图像可以是样本的部分图像。然后通过比较从亮场图像获得的总细胞计数与从荧光图像获得的荧光标记细胞 的细胞计数来确定生物标记和表达生物标记的细胞的浓度。由于系统利用具有固定高度的 有盖室，所以可以根据细胞计数来确定细胞浓度。确定细胞群落中的干细胞浓度或者数目计数干细胞具有发育成体内许多不同细胞类型的明显的潜能。适于作为用于身体的一 类修复系统，只要人或者动物仍然活着，它们可以在理论上无限分化以补充其他细胞。当干 细胞分化时，各新细胞有可能保留干细胞或者变为具有更专门化功能的另一类细胞，比如 肌肉细胞、红细胞或者脑细胞。干细胞已经提供让生物医学研究者开发更有效治疗药品以预防、治疗和治愈各种 疾病的大量机会，因为这些细胞具有长时间再生它们本身的独特性质并且也具有分化成不 同种类的功能细胞的明显的潜能。本发明的一个方面提供一种用于确定样本中的细胞群落 中的干细胞浓度的方法。该方法涉及到使包括干细胞的样本与特异性地结合样本中的干细胞的荧光标记 试剂接触。干细胞特有的生物标记包括TRA-l-81、TRA-l-60、Thy-l、SSEA-3、SSEA4、0ct-4、 CD9、CD30和碱性磷酸酶。试剂可以是已经荧光标记的抗体、涂有抗体的粒子、多肽、寡核苷酸或者多核苷酸。在样本已经与荧光标记试剂接触之后，用吸液管吸入样本并且将样本加载到系统 的室中。通过将样本吸入到室的样本引入端口中来向室加载样本。随着样本加载到室中， 空气通过室中的排气端口离开室。示例样本尺寸为20μ 1。一旦向室加载样本，通过系统的 壳中的槽将室加载到计数系统中。在细胞计数室内的悬浮液中的细胞样本由亮场(BF)光源和荧光(FL)光源照射。 光源可以是发光二极管。校准器可以用于光源。当在荧光检测模式中使用系统时，可移动 光快门用来封闭亮场光。荧光滤光器组件用来仅允许激发光照射样本并且仅允许来自样本 的发射光成像于相机传感器上。相机可以是具有热电冷却能力的CCD相机。使用本发明的计数系统来采集样本中的细胞群落的亮场图像。亮场图像针对样本 中的总细胞群落提供细胞计数。然后将系统切换到荧光模式并且采集细胞的荧光图像。仅 有已经由荧光标记试剂结合的干细胞将在该模式中可见，因此在该模式中将仅对干细胞进 行成像。荧光图像针对细胞群落中的干细胞数目提供细胞计数。亮场图像和荧光图像中的 各图像可以是整个样本的图像。可选择地，亮场图像和荧光图像中的各图像可以是样本的 部分图像。然后通过比较从亮场图像获得的总细胞计数与从荧光图像获得的干细胞的细胞 计数来确定细胞群落中的干细胞浓度。由于系统利用具有固定高度的有盖室，所以可以根 据细胞计数来确定干细胞浓度。确定感染疟疾率疟疾是原生动物寄生虫引起的虫酶(vector-borne)传染病。疟疾是最常见传 染病之一和重大公共健康问题。该疾病由疟原虫(Plasmodium)属的原生动物寄生虫 引起。仅四种类型的疟原虫寄生虫可以感染人类该疾病的最严重形式由恶性疟原虫 (Plasmodiumfalciparum)和间日疟原虫(Plasmodium vivax)引起，但是其他有关物种(蛋 形疟原虫(Plasmodium ovale)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae))也可以影响人类。这 一组人类病原疟原虫物种通常称为疟疾寄生虫。通常，人们由于被传染性的雌性疟蚊类(Anopheles)蚊子叮咬而染患疟疾。仅疟 蚊类蚊子可以传播疟疾，并且必须通过在感染者上摄取的前一次血液来传染它们。当蚊子 叮咬感染者时，取得包含用显微镜可见的疟疾寄生虫的少量血液。约一周之后，当蚊子摄取 它的下一次血液时，这些寄生虫与蚊子的唾液混合并且被注入到被叮咬者中。寄生虫在红 细胞内繁殖从而引起如下症状，这些症状包括轻度头痛、呼吸短促、心动过速、发热、寒战、 恶心、流感样疾患并且在严重情况下包括昏迷和死亡。本发明的系统可以用来提供一种用 于鉴定和表征红细胞中的疟疾寄生感染率的简单、快速和可靠方法。该方法涉及到使来自患有疟疾的受试者的红细胞样本与疟疾寄生虫特有的荧光 标记试剂接触。红细胞不含核酸(DNA或者RNA)，而疟疾寄生虫确实包含核酸。由于红 细胞不含核酸，所以荧光标记试剂应当是将标记疟疾寄生虫中的核酸而不标记未感染的 红细胞的细胞可渗透核酸选择性荧光染料，比如在商业上可从FlukaBioChemica，Buchs, Switzerland获得的吖啶橙。在样本已经与荧光标记试剂接触之后，用吸液管吸入样本并且将样本加载到系统 的室中。通过将样本吸入到室的样本引入端口中来向室加载样本。随着样本加载到室中，空气通过室中的排气端口离开室。示例样本尺寸为20μ 1。一旦向室加载样本，通过系统的 壳中的槽将室加载到计数系统中。在细胞计数室内的悬浮液中的细胞样本由亮场(BF)光源和荧光(FL)光源照射。 光源可以是发光二极管。校准器可以用于光源。当在荧光检测模式中使用系统时，可移动 光快门用来封闭亮场光。荧光滤光器组件用来仅允许激发光照射样本并且仅允许来自样本 的发射光成像于相机传感器上。相机可以是具有热电冷却能力的CCD相机。使用本发明的计数系统来采集样本中的红细胞群落的亮场图像。亮场图像针对样 本中的总红细胞(即感染的红细胞和未感染的红细胞)群落提供细胞计数。然后将系统切 换到荧光模式并且采集红细胞的荧光图像。仅有已经感染疟疾寄生虫的红细胞将在该模式 中可见，因此在该模式中将仅对感染疟疾的红细胞进行成像。荧光图像针对红细胞群落中 的感染疟疾的红细胞数目提供细胞计数。亮场图像和荧光图像中的各图像可以是整个样本 的图像。可选择地，亮场图像和荧光图像中的各图像可以是样本的部分图像。然后通过比较从亮场图像获得的总红细胞计数与从荧光图像获得的感染疟疾的 红细胞的红细胞计数来确定红细胞群落中的疟疾感染率。由于系统利用具有固定高度的有 盖室，所以可以根据细胞计数来确定疟疾感染率。对脂肪细胞讲行鉴定和计数脂肪细胞是主要组成专用于将能量存储为脂肪的脂肪组织的细胞。有白色脂肪组 织和棕色脂肪组织这两种类型的脂肪组织。白色脂肪细胞或者单液泡细胞包含由细胞质层 包围的大脂滴。细胞核变平并且位于外围上。典型脂肪细胞的直径为0. 1mm，而一些为两倍 于该尺寸而其他为该尺寸的一半。存储的脂肪处于半液态并且主要由甘油三酸酯和胆固醇 酯组成。白色脂肪细胞分泌抵抗素、脂连蛋白和瘦蛋白。棕色脂肪细胞或者多液泡细胞在 形状上为多边形。不同于白色脂肪细胞，这些细胞具有大量细胞质，而脂滴随处散布。细胞 核为圆形，并且虽然位置并不居中，但是它不在细胞的外围中。棕色来自大量线粒体。一般通过光显微镜方法来完成脂肪细胞的表征。常常不可能区分脂肪细胞与脂质 球体背景，因为它们看似相同。本发明的系统可以用来提供一种用于鉴定和表征脂肪细胞 的简单、快速和可靠方法。该方法涉及到使包括脂肪细胞的样本与特异性地结合脂肪细胞的荧光标记试剂 接触。脂滴不含核酸(DNA或者RNA)，而脂肪细胞确实包含核酸。由于脂滴不含核酸，所以 荧光标记试剂应当是将标记脂肪细胞中的核酸而不影响脂滴的细胞可渗透核酸选择性荧 光染料，比如吖啶橙。在样本已经与荧光标记试剂接触之后，用吸液管吸入样本并且将样本加载到系统 的室中。通过将样本吸入到室的样本引入端口中来向室加载样本。随着样本加载到室中， 空气通过室中的排气端口离开室。示例样本尺寸为20μ 1。一旦向室加载样本，通过系统的 壳中的槽将室加载到计数系统中。在细胞计数室内的悬浮液中的细胞样本由亮场(BF)光源和荧光(FL)光源照射。 光源可以是发光二极管。校准器可以用于光源。当在荧光检测模式中使用系统时，可移动 光快门用来封闭亮场光。荧光滤光器组件用来仅允许激发光照射样本并且仅允许来自样本 的发射光成像于相机传感器上。相机可以是具有热电冷却能力的CCD相机。使用本发明的计数系统来采集样本的亮场图像。亮场图像提供样本中的脂肪细胞和脂滴的图像。然后将系统切换到荧光模式并且采集脂肪细胞的荧光图像。仅脂肪细胞将 在该模式中可见，因此在该模式中将仅对脂肪细胞进行成像。荧光图像针对样本中的脂肪 细胞数目提供细胞计数。亮场图像和荧光图像中的各图像可以是整个样本的图像。可选择 地，亮场图像和荧光图像中的各图像可以是样本的部分图像。通过比较亮场图像与荧光图 像来鉴定脂肪细胞。检测样本中的牛物分子本发明的系统可以用来提供一种用于量化地描绘来自生物样本如血清、细胞培养 上清液或者细胞溶解液的生物分子的分布的简单、快速和可靠方法。生物分子包括蛋白质、 多核苷酸(例如，DNA或者RNA)、有机材料和前述的任何组合。该方法包括使样本与涂有生物素化抗体的粒子和偶联到荧光指示剂的链霉亲和 : 角虫。歹Ijf立 /^ ^Ι 舌 5 μ m>10 μ m>15 μ m、20 μ m>25 μ m、30 μ m>35 μ m、40 μ m>45 μ m、 50μπι。粒子可以由任何材料组成。示例粒子包括金粒子、胶乳粒子、玻璃粒子或者磁粒 子。这些粒子可以涂有生物素化抗体，该抗体针对样本中的感兴趣的生物分子具有特异性。 用于将生物素偶联到抗体的方法在本领域中众所周知，例如参IManleyEssentials in Immunology and serology，Delmar，第152-153页，2002年)。用于使粒子涂有生物素化抗 体的方法在本领域中众所周知，例如参见Harlow等人的Antibodies (ColdSpring Harbor Laboratory,1988 ^)。一旦样本已经与涂有生物素化抗体的粒子和偶联到荧光指示剂的链霉亲和素接 触，用吸液管吸入样本并且将样本加载到系统的室中。通过将样本吸入到室的样本引入端 口中来向室加载样本。随着样本加载到室中，空气通过室中的排气端口离开室。示例样本 尺寸为20μ 1。一旦向室加载样本，通过系统的壳中的槽将室加载到计数系统中。在细胞计数室内的悬浮液中的细胞样本由亮场(BF)光源和荧光(FL)光源照射。 光源可以是发光二极管。校准器可以用于光源。当在荧光检测模式中使用系统时，可移动 光快门用来封闭亮场光。荧光滤光器组件用来仅允许激发光照射样本并且仅允许来自样本 的发射光成像于相机传感器上。相机可以是具有热电冷却能力的CCD相机。使用本发明的计数系统来采集样本的亮场图像。亮场图像充当一种控制，从而向 提供结合到生物素化抗体粒子/链霉亲和素偶联荧光指示剂复合物的粒子和生物分子的 图像。然后将系统切换到荧光模式并且采集生物分子对于生物素化抗体粒子/链霉亲和素 偶联荧光指示剂复合物的多种结合活性的荧光图像。荧光图像针对结合到生物素化抗体粒 子/链霉亲和素偶联荧光指示剂复合物的生物分子数目提供计数。亮场图像和荧光图像中 的各图像可以是整个样本的图像。可选择地，亮场图像和荧光图像中的各图像可以是样本 的部分图像。通过比较亮场图像与荧光图像来鉴定结合到生物素化抗体粒子/链霉亲和素 偶联荧光指示剂复合物的生物分子。亮场成像与荧光成像的组合允许监视和控制反应粒子 数目以保证一致数据。石角定j舌肝细朐,浓It或者数目i十数肝由两个主叶构成，这两个主叶均由数以千计的小叶组成。肝调节血液中的多数 化学水平并且分泌有助于从肝中带走废物的称为胆汁的产物。离开胃和肠的所有血液穿过 肝。肝处理该血液并且将营养和药物分解成更容易用于身体其余部分的形式。已经确认肝 有多于500种重要功能。这些功能中的一些功能包括产生胆汁；产生用于血浆的某些蛋白质；产生胆固醇和特殊蛋白质以有助于通过人体输送脂肪；将过量葡萄糖转换成糖原进行 存储；调节氨基酸的血液水平；处理血色素以便使用它的含铁量；将有毒氨转换成尿素；清 除药物和其他有毒物质的血液；调节血液堵塞；以及通过产生免疫因子并且从血流中去除 细菌来抵御感染。存在需要医生或者其他保健专业人员的临床护理的许多肝病症。根据American Liver Foundation，美国每年有多于1500万人患有肝疾病并且多于43，000人死于肝疾病。目前，研究者用台盼蓝将原生肝细胞染色并且在亮场配置中的显微镜之下对死细 胞和活细胞进行人工计数。使用人工计数的活细胞对台盼蓝染色的死细胞来计算样本的存 活性。如图6中所示，观察到分别用绿色和蓝色箭头代表活细胞和死细胞的两个群落。台 盼蓝存活性测试的自动化由于细胞内结构、细胞图像不一致、随物种和样本的变化以及解 簇集(declustering)而存在技术困难。此外，已经报导存在在不同原生肝细胞之间(例如 随物种、随样本和随过程)的染色变化。该变化使计数结果不一致。本发明的系统提供一种用于确定样本中的肝细胞群落中的活肝细胞浓度的快速、 简单和可靠方法。样本中的肝细胞群落中的活肝细胞浓度可以与特定肝病或者疾病状态相 关。样本在低温贮藏之前可以包括原生新肝细胞。样本也可以包括在低温贮藏之后解冻的 解冻后肝细胞。该方法涉及到使包括肝细胞的样本与至少一个荧光标记试剂接触。如果使用两 个荧光标记试剂，则荧光标记试剂应当具有不同荧光特性，即不同激发波长和不同发射波 长。当使用两个荧光标记试剂时，一个可以是吖啶橙而另一个可以是碘化丙啶(PI)。使用 这些串列试剂，吖啶橙将活肝细胞染色而PI将死肝细胞染色。例如在商业上可从Fluka BioChemica(Buchs，Switzerland)获得PI。PI是在结合到DNA时发荧光的插入试剂。PI 为膜不可渗透并且被从活细胞排除，因此PI常用来鉴定和/或确定混合群落中的非活细胞 数量。一旦样本已经与荧光标记试剂接触，用吸液管吸入样本并且将样本加载到系统的 室中。通过将样本吸入到室的样本引入端口中来向室加载样本。随着样本加载到室中，空 气通过室中的排气端口离开室。示例样本尺寸为20μ 1。一旦向室加载样本，通过系统的壳 中的槽将室加载到计数系统中。在细胞计数室内的悬浮液中的细胞样本由亮场(BF)光源和荧光(FL)光源照射。 光源可以是发光二极管。校准器可以用于光源。当在荧光检测模式中使用系统时，可移动 光快门用来封闭亮场光。荧光滤光器组件用来仅允许激发光照射样本并且仅允许来自样本 的发射光成像于相机传感器上。相机可以是具有热电冷却能力的CCD相机。使用本发明的计数系统来采集样本的两个或者更多图像。从亮场图像、活肝细胞 的荧光图像和死肝细胞的荧光图像中选择第一和第二图像，其中第一图像不同于第二图 像。亮场图像提供肝细胞群落的总细胞计数(即活细胞和死细胞)的图像。然后将系统切 换到荧光模式并且采集细胞的荧光图像。计数系统的第一荧光通道采集的第一荧光图像将 是用吖啶橙荧光标记肝细胞的荧光图像。该图像提供肝细胞群落中的活肝细胞的细胞计 数。计数系统的第二荧光通道采集的第二荧光图像将是用PI标记的肝细胞的荧光图像。该 图像提供肝细胞群落中的死肝细胞的细胞计数。图7-图14示出了用不同荧光试剂如吖啶 橙和PI染色并且在亮场和两种不同荧光这些不同条件之下成像的肝细胞。亮场图像和荧光图像中的各图像可以是整个图像的图像。可选择地，亮场图像和荧光图像中的各图像可 以是样本的部分图像。然后可以通过诸多计数方式来确定活肝细胞浓度。由于系统利用具有固定高度的 有盖室，所以可以根据细胞计数来确定细胞浓度。当第一图像为活肝细胞的荧光图像而第 二图像为死肝细胞的荧光图像时，通过比较来自活肝细胞的荧光图像的细胞计数与来自死 肝细胞的荧光图像的细胞计数来确定肝细胞群落中的活肝细胞浓度。可选择地，当第一图 像为亮场图像而第二图像为死肝细胞的荧光图像时，通过比较来自亮场图像的细胞计数与 来自死肝细胞的荧光图像的细胞计数来确定肝细胞群落中的活肝细胞浓度。可选择地，当 第一图像为亮场图像而第二图像为活肝细胞的荧光图像时，通过比较来自亮场图像的细胞 计数与来自活肝细胞的荧光图像的细胞计数来确定肝细胞群落中的活肝细胞浓度。可选择地，亮场图像、活肝细胞的荧光图像和死肝细胞的荧光图像这三个图像可 以由系统采集。亮场图像提供肝细胞群落的总细胞计数(即活细胞和死细胞)的图像。用 吖啶橙荧光标记的肝细胞的荧光图像提供肝细胞群落中的活肝细胞的细胞计数。用PI标 记的肝细胞的荧光图像提供肝细胞群落中的死肝细胞的细胞计数。然后可以通过比较来自 亮场的细胞计数与来自两个荧光图像的细胞计数来确定活肝细胞浓度。引用结合已经在本公开内容全文中进行对其他文献如专利、专利申请、专利出版物、期刊、 书籍、论文、网络内容的引用和引证。所有这样的文献出于所有目的通过引用整体结合于 此。等效形式 可以用其他具体形式实现本发明而不脱离其精神实质或者基本特性。前述实施例 因此将在所有方面理解为举例说明而不是限制这里描述的本发明。本发明的范围因此由所 附权利要求书而不是由前文说明书限定，并且在权利要求书的含义和等效范围内的所有改 变因此囊括于其中。
权利要求
1.一种用于对细胞或者生物分子进行计数的系统，包括有盖的室，具有已知高度并且配置成保持样本中的生物分子或者细胞悬浮液； 至少一个荧光光源，连接到至少一个荧光光束收窄设备； 亮场光源，连接到亮场光束收窄设备； 显微镜物镜； 检测设备；荧光滤光器组件，用于仅允许激发光照射所述样本并且仅允许来自所述样本的发射光 由所述检测设备成像；以及可移动光快门，用于在荧光检测期间阻止亮场光。
2.根据权利要求1所述的系统，还包括操作连接到所述细胞计数系统的计算机。
3.根据权利要求2所述的系统，还包括安装于所述计算机上的分析软件。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述荧光光束收窄设备为校准器。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述亮场光束收窄设备为校准器。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述检测设备为相机。
7.根据权利要求6所述的系统，其中所述相机为CCD相机。
8.根据权利要求1所述的系统，其中所述有盖的室包括样本引入端口和排气端口。
9.根据权利要求8所述的系统，其中所述有盖的室还包括计数网格。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述计数网格为所述室的顶部的集成部分。
11.根据权利要求9所述的系统，其中所述计数网格为所述室的底部的集成部分。
12.根据权利要求9所述的系统，其中所述计数网格的线宽度范围从约0.1微米到约Imm0
13.根据权利要求9所述的系统，其中所述计数网格的线宽度范围从约1微米到约25 微米。
14.根据权利要求9所述的系统，其中所述计数网格的线厚度范围从约0.1微米到约 50微米。
15.根据权利要求1所述的系统，其中所述荧光光源和所述亮场光源中的各光源为发光二极管。
16.根据权利要求1所述的系统，其中所述系统被配置成用单个图像捕获所述样本的全部。
17.根据权利要求1所述的系统，其中所述系统被配置成用单个图像捕获所述样本的 部分。
18.根据权利要求1所述的系统，其中所述样本为人类组织或者体液。
19.根据权利要求1所述的系统，其中所述生物分子选自DNA、RNA和蛋白质。
20.根据权利要求1所述的系统，其中所述样本选自血清、细胞培养上清液和细胞溶解液。
21.根据权利要求1所述的系统，其中所述生物分子或者细胞表明疾病或者疾病状态。
22.一种用于确定细胞浓度或者数目计数的方法，所述细胞表达样本中的细胞群落中 的生物标记，所述方法包括使包括表达生物标记的细胞的样本与特异性地结合所述生物标记的荧光标记试剂接触；将所述样本加载到具有已知高度的有盖的室中，其中所述细胞群落悬浮于所述室内； 采集所述室中的所述样本中的所述细胞群落的单个静态亮场图像； 采集所述室中的所述样本中的所述细胞群落的单个静态荧光图像；以及 比较来自所述亮场图像的细胞计数与来自所述荧光图像的细胞计数以确定表达所述 细胞群落中的所述生物标记的所述细胞的浓度或者数目计数。
23.根据权利要求22所述的方法，其中在所述接触步骤之前，所述方法还包括使所述 细胞群落与使所述细胞群落可渗透的试剂接触。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述生物标记为细胞表面生物标记。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述生物标记为细胞间生物标记。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述荧光标记试剂为具有用于所述生物标记的 抗原决定基的荧光标记抗体。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述生物标记与特定疾病或者疾病状态关联。
28.根据权利要求22所述的方法，其中所述样本为人类组织或者体液。
29.根据权利要求22所述的方法，其中所述单个静态亮场图像和所述单个静态荧光图 像中的各图像为整个样本的图像。
30.根据权利要求22所述的方法，其中所述单个静态亮场图像和所述单个静态荧光图 像中的各图像为样本的部分图像。
31.一种用于确定样本中的细胞群落中的干细胞浓度或者数目计数的方法，包括 使包括干细胞的样本与特异性地结合所述样本中的所述干细胞的荧光标记试剂接触；将所述样本加载到具有已知高度的有盖的室，其中所述细胞群落悬浮于所述室内； 采集所述室中的所述样本中的所述细胞群落的单个静态亮场图像； 采集所述室中的所述样本中的所述细胞群落的单个静态荧光图像；以及 比较来自所述亮场图像的细胞计数与来自所述荧光图像的细胞计数以确定所述细胞 群落中的干细胞浓度或者数目计数。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述荧光标记试剂为干细胞生物标记特有的荧 光标记抗体或者涂有干细胞生物标记特有的荧光标记抗体的粒子。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述生物标记选自TRA-l-81、TRA-l-60、Thy-l、 S SEA-3、S SEA4、0ct-4、CD9、CD30 和碱性磷酸酶。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述单个静态亮场图像和所述单个静态荧光图 像中的各图像为整个样本的图像。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述单个静态亮场图像和所述单个静态荧光图 像中的各图像为样本的部分图像。
36.一种用于确定受试者中的疟疾感染率的方法，包括使来自患有疟疾的受试者的红细胞样本与疟疾寄生虫特有的荧光标记试剂接触； 将所述样本加载到具有已知高度的有盖的室中，其中所述细胞悬浮于所述室内； 采集所述室中的所述样本中的所述细胞的单个静态亮场图像； 采集所述室中的所述样本中的所述细胞的单个静态荧光图像；以及比较来自所述亮场图像的细胞计数与来自所述荧光图像的细胞计数以确定所述受试 者中的疟疾感染率。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述受试者为人类。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述单个静态亮场图像和所述单个静态荧光图 像中的各图像为整个样本的图像。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述单个静态亮场图像和所述单个静态荧光图 像中的各图像为样本的部分图像。
40.一种用于鉴定样本中的脂肪细胞或者对其进行数目计数的方法，包括 使包括脂肪细胞的样本与特异性地结合所述脂肪细胞的荧光标记试剂接触；将所述样本加载到具有已知高度的有盖的室中，其中所述细胞悬浮于所述室内； 采集所述样本在所述室中的单个静态亮场图像； 采集所述样本在所述室中的单个静态荧光图像；以及比较所述亮场图像与所述荧光图像以鉴定所述脂肪细胞或者对其进行数目计数。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述荧光标记为DNA荧光染料。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述单个静态亮场图像和所述单个静态荧光图 像中的各图像为整个样本的图像。
43.根据权利要求40所述的方法，其中所述单个静态亮场图像和所述单个静态荧光图 像中的各图像为样本的部分图像。
44.一种用于检测样本中的生物分子的方法，包括使样本与涂有生物素化抗体的粒子和偶联到荧光指示剂的链霉亲和素接触； 将所述样本加载到具有已知高度的有盖的室中，其中所述生物分子悬浮于所述室内； 采集所述室中的所述样本的单个静态亮场图像； 采集所述室中的所述样本的静态荧光图像；以及 比较所述亮场图像与所述荧光图像以检测所述样本中的所述生物分子。
45.根据权利要求44所述的方法，其中在采集所述亮场图像之前，所述方法还包括清 洗非结合粒子。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述生物分子选自DNA、RNA和蛋白质。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述生物分子与特定疾病或者疾病状态关联。
48.根据权利要求44所述的方法，其中所述样本为人类组织或者体液。
49.根据权利要求44所述的方法，其中所述样本选自血清、细胞培养上清液和细胞溶 解液。
50.根据权利要求44所述的方法，其中所述单个静态亮场图像和所述单个静态荧光图 像中的各图像为整个样本的图像。
51.根据权利要求44所述的方法，其中所述单个静态亮场图像和所述单个静态荧光图 像中的各图像为样本的部分图像。
52.一种用于确定样本中的肝细胞群落中的活肝细胞浓度或者数目计数的方法，包括使包括肝细胞的样本与至少一个荧光标记试剂接触；将所述样本加载到具有已知高度的有盖的室中，其中所述肝细胞群落悬浮于所述室内；采集所述肝细胞群落的两个或者更多静态图像，其中第一和第二图像选自亮场图像、 活肝细胞的荧光图像和死肝细胞的荧光图像，其中所述第一图像不同于所述第二图像；比较来自所述第一图像的细胞计数与来自所述第二图像的细胞计数以确定所述肝细 胞群落中的活肝细胞浓度或者数目计数。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述肝细胞群落与两个不同荧光试剂接触。
54.根据权利要求53所述的方法，其中第一荧光试剂特异性地结合活肝细胞，而第二 荧光试剂特异性地结合死肝细胞。
55.根据权利要求M所述的方法，其中所述第一荧光试剂为吖啶橙，而所述第二荧光 试剂为碘化丙啶。
56.根据权利要求M所述的方法，其中所述第一图像为所述活肝细胞的荧光图像，所 述第二图像为所述死肝细胞的荧光图像，并且通过比较来自所述活肝细胞的荧光图像的细 胞计数与来自所述死肝细胞的荧光图像的细胞计数来确定所述肝细胞群落中的活肝细胞 浓度。
57.根据权利要求M所述的方法，其中所述第一图像为所述亮场图像，所述第二图像 为所述死肝细胞的荧光图像，并且通过比较来自所述亮场图像的细胞计数与来自所述死肝 细胞的荧光图像的细胞计数来确定所述肝细胞群落中的活肝细胞浓度。
58.根据权利要求M所述的方法，其中所述第一图像为所述亮场图像，所述第二图像 为所述活肝细胞的荧光图像，并且通过比较来自所述亮场图像的细胞计数与来自所述活肝 细胞的荧光图像的细胞计数来确定所述肝细胞群落中的活肝细胞浓度。
59.根据权利要求52所述的方法，其中所述肝细胞群落中的活肝细胞浓度与特定疾病 或者疾病状态相关。
60.根据权利要求52所述的方法，其中所述第一和第二图像中的各图像为整个样本的图像。
61.根据权利要求52所述的方法，其中所述第一和第二图像中的各图像为样本的部分图像。
62.一种用于对细胞或者生物分子进行计数的系统，包括闭合的室，配置成保持样本中的生物分子或者细胞悬浮液并且允许计算询问样本的体积；至少一个荧光光源，连接到至少一个荧光光束收窄设备； 亮场光源，连接到亮场光束收窄设备； 显微镜物镜； 检测设备；荧光滤光器组件，用于仅允许激发光照射所述样本并且仅允许来自所述样本的发射光 由所述检测设备成像；以及可移动光快门，用于在荧光检测期间阻止亮场光。
全文摘要
本发明主要地涉及用于对生物分子或者细胞进行计数的系统和方法。在某些实施例中，本发明提供一种细胞计数或者生物分子计数系统，该系统包括有盖的室，具有已知高度并且配置成保持样本中的生物分子或者细胞悬浮液；至少一个荧光光源，连接到至少一个荧光光束收窄设备；亮场光源，连接到亮场光束收窄设备；显微镜物镜；检测设备；荧光滤光器组件，用于仅允许激发光照射样本并且仅允许来自样本的发射光由检测设备成像；以及可移动光快门，用于在荧光检测期间阻止亮场光。
文档编号C12M1/34GK102089418SQ200980121707
公开日2011年6月8日 申请日期2009年4月8日 优先权日2008年4月9日
发明者A·皮拉尼, B·林, J·邱, P·李, T·史密斯, T·索博莱维斯基 申请人:耐克思乐生物科学