通过阻断肿瘤生长、血管发生和转移抵抗癌症的新型抗体的制作方法

专利名称：通过阻断肿瘤生长、血管发生和转移抵抗癌症的新型抗体的制作方法
通过阻断肿瘤生长、血管发生和转移抵抗癌症的新型抗体相关申请的交叉参考本申请要求2008年4月4日提交的美国专利申请61/042，604和2008年11月10 日提交的美国专利申请61/113，053的优先权，通过引用将它们的全部内容纳入本文。对于联邦资助研发作出的发明的权益声明本发明得到NIH/NCI SOMI Training Grant R25 CA 098010 和 NIH/NCI UCLA Prostate SPORE, P50 CA 092131的部分支持。政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
前列腺癌是最常见的恶性肿瘤，并且是美国男性的第二大癌症死因。前列腺癌是一种生物学和临床异质疾病。大多数患有这种恶性肿瘤的男性具有可能不会影响个体寿命的缓慢生长的肿瘤，但其他人会受到快速生长的转移性肿瘤的攻击。PSA筛选的局限性在于缺乏特异性以及无法预测哪些患者有患上激素难治性转移性疾病的风险。最近的研究提出，PSA诊断阈较低有可能增加前列腺癌诊断的数量，从而使缓慢进展癌症患者和侵袭性癌症患者之间的鉴定更加复杂(Punglia等，N Engl J Med, 349 :335-342 (2003))。迫切需要能与临床结果相关联或能鉴别患有潜在的侵袭性疾病的患者的新血清和组织标记物(Welsh 等，Proc Natl Acad Sci USA，100 :3410-3415 (2003))。最近的表达概况研究提示，转移性肿瘤和非转移性肿瘤的表达特征(signature) 可能存在于原发性肿瘤中(Ramaswamy 等，Nat Genet, 33 :49-54(2003) ；Sotiriou 等，Proc Natl Acad Sci USA, 100 10393-10398 (2003)) 使肿瘤易于转移到特定器官的其他特征也可能以一定概率存在于原发性肿瘤中(Kang等，Cancer Cell, 3 =537-549 (2003)) 0这些最近的观察结果提示，可在疾病早期阶段鉴别转移前或激素难治性前列腺癌前的新型标记物。这些标记物也在转移性或激素难治性前列腺癌进展的生物学中发挥作用。与结果相关并在前列腺癌进展的生物学中发挥作用的存在于原发性肿瘤中的基因的最新例子包括 EZH2 和 LIM 激酶(Varambally 等，Nature,419 :624-629(2002) ；Yoshioka 等，Proc Natl Acad Sci USA,100 =7247-7252 (2003)) 然而这两种基因都不是分泌型的。为鉴定激素难治性前列腺癌的新候选血清或组织标记物，我们比较了成对的激素依赖性和激素难治性前列腺癌异种移植物的基因表达特征。LAPC-9异种移植物建立于成骨细胞骨转移，并在阉割免疫缺陷小鼠后从雄激素依赖进展到不依赖(Craft等， Cancer Research，付印(In Press，1999))。之前，其已用来鉴定前列腺癌的候选治疗靶。 验证了差异表达基因，然后测试了相对于分泌蛋白或细胞表面蛋白的序列同源性。同时在激素难治性前列腺癌和膀胱癌中表达的N-钙粘蛋白的鉴定、表征和最初确认已被报道 (W0/2007/109347)。我们之前已经披露，我们将N-钙粘蛋白鉴定为前列腺癌和膀胱癌的假定诊断和治疗靶(W0/2007/109347)。我们之前披露的内容证实，该靶标在高风险性和进行性前列腺和膀胱肿瘤中显著表达，并显示该靶标的表达与预后不良和进展成雄激素非依赖性相关。 尽管之前曾推测，N-钙粘蛋白可能是有用的治疗靶，但唯一存在的药物是肽拮抗剂，它对于前列腺癌不显示出任何临床前活性。据我们所了解，我们的发明首次提供了有效抵抗表达
4该靶标的癌症的单克隆抗体。此外，现有N-钙粘蛋白拮抗剂仅靶向该蛋白的第一胞外结构域。我们描述了靶向第一和第四胞外结构域的抗体。全部(抗体)都具有明显的抗肿瘤活性。据我们所知，这是第一次描述靶向第四胞外结构域的概念。我们的抗体可用作单一试剂、组合使用，并且在理论上可以与N-钙粘蛋白平行途径或下游途径的拮抗剂组合使用。本发明包括多种针对N-钙粘蛋白第一和第四胞外结构域的单克隆抗体。这些抗体在前列腺癌和其他癌症的体内模型中阻断肿瘤生长、血管发生和转移。它们通过阻断负责肿瘤生长、侵袭、血管发生和转移的N-钙粘蛋白信号转导途径而发挥作用。所述抗体还可用于体内控制N-钙粘蛋白阳性肿瘤和/或用于组织诊断和预后。本发明可仅作为单一抗体使用以治疗或预防肿瘤生长和转移。它们也可用作佐剂或作为已有肿瘤的治疗剂。它们可组合使用以阻断N-钙粘蛋白的多个结构域。它们也可与化疗剂或其他靶向癌症药剂组合使用，尤其是与那些靶向协同信号转导途径或那些靶向 N-钙粘蛋白介导的信号转导下游或上游途径的药剂组合使用。目前尚没有获得批准的靶向N-钙粘蛋白的疗法或诊断方法。靶向该途径的唯一药物在II期临床中不是很成功，它在临床前模型中无活性，而我们的发明对该临床前模型是有活性的，这说明我们的方法和试剂有明显的优越性。因此，本发明提供了靶向N-钙粘蛋白的组合物和方法，以诊断、预后和治疗表达 N-钙粘蛋白的癌症，其中包括但不限于前列腺癌和膀胱癌。发明简述一方面，本发明提供了以ATCC登录号PTA-9387保藏的杂交瘤细胞系以及由该杂交瘤细胞系产生的抗体，以及另一种以ATCC登录号PTA-9388保藏的杂交瘤细胞系和由该杂交瘤细胞系产生的抗体。还提供了一种能够在体内或体外结合N-钙粘蛋白结构域1-3 的抗体或其片段，该结构域1-3与以ATCC登录号PTA-9387保藏于美国模式培养物保藏所的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体结合的N-钙粘蛋白抗原决定簇相同，或能够在体内或体外结合N-钙粘蛋白结构域4的抗体或其片段，该结构域4与以ATCC登录号PTA-9388 保藏于美国模式培养物保藏所的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体结合的N-钙粘蛋白抗原决定簇相同。这种抗体可以是人源化的或完全人的；或者它可以是双特异性抗体或单链抗体(scFv) ο在第二方面，本发明提供了一种抑制癌细胞在患者体内生长的方法。该方法包括以下步骤在足以使所述抗体(或其片段)结合表达或过表达N-钙粘蛋白的癌细胞的条件下，给予患者本发明的抗体(或其片段)。所述抗体(或其片段)通过以下途径抑制癌细胞生长(a)激活或抑制NFK-β信号传导和转录；(b)激活或抑制N-钙粘蛋白内在化；(c) 激活或抑制PI3激酶或Akt途径；(d)激活或抑制连环蛋白信号传导；(e)阻断N-钙粘蛋白与FGFR或其他酪氨酸激酶受体的异二聚化；或(f)阻断或增强被ADAMlO或其他金属肽酶切割。在一些实施方式中，所述癌细胞是泌尿生殖器癌细胞、前列腺癌细胞或膀胱癌细胞。在第三个方面，本发明提供一种治疗癌症患者的方法。该方法包括以下步骤(a) 从有患上表达N-钙粘蛋白的癌症的风险的个体获得测试组织样品；(b)与已知为癌症阴性的患者的对照组织样品相比，确定测试组织样品中N-钙粘蛋白的存在与否或含量；从而诊断所述表达N-钙粘蛋白的癌症，其中所述N-钙粘蛋白以正常或低水平表达，或由细胞亚群表达，或是过表达的；和(C)给予有患上表达N-钙粘蛋白的癌症的风险的个体有效量的本发明N-钙粘蛋白抗体(或其片段)。在一些实施方式中，所述组织样品是前列腺或膀胱组织。在一些实施方式中，所述癌症是前列腺癌或膀胱癌，或者可以是转移癌。在一些实施方式中，所述抗体(或其片段) 阻断激素难治性前列腺癌，或所述抗体阻断癌症干细胞。在一些情况下，所述抗体是单克隆抗体、scFv或双特异性抗体。在其他一些实施方式中，所述组织样品是前列腺或膀胱组织。在第四个方面，本发明提供一种诊断癌症患者的方法。该方法包括以下步骤(a) 从有患上表达N-钙粘蛋白的癌症的风险的个体获得测试组织样品；(b)与已知为癌症阴性的患者的对照组织样品相比，通过使样品接触有效量的本发明的N-钙粘蛋白抗体(或其片段)来确定测试组织样品中N-钙粘蛋白的存在与否或含量；从而诊断所述表达N-钙粘蛋白的癌症，其中所述N-钙粘蛋白以正常或低水平表达，或由细胞亚群表达，或是过表达的。在第五个方面，本发明提供一种鉴定癌症干细胞的方法。该方法包括以下步骤 (a)从有患上表达N-钙粘蛋白的癌症的风险的个体获得测试组织样品；(b)与已知为癌症阴性的患者的对照组织样品相比，采用本发明的抗体(或其片段)确定测试组织样品中癌症干细胞的存在与否；其中所述N-钙粘蛋白以正常或低水平表达，或由干细胞亚群表达且不是过表达的。在一些实施方式中，所述组织样品是前列腺或膀胱组织。在一些实施方式中，所述癌症是前列腺癌、膀胱癌、激素难治性前列腺癌或转移癌。在第六个方面，本发明提供了一种鉴定抗-N-钙粘蛋白抗体或抑制患者体内癌细胞生长的化合物的方法。该方法包括以下步骤(i)使候选化合物或抗体接触表达或过表达N-钙粘蛋白多肽的细胞；和(ii)通过确定所述候选化合物或抗体是否具有以下作用来确定所述化合物或抗体对N-钙粘蛋白多肽的功能效应(a)激活或抑制NF κ-β信号传导和转录；(b)激活或抑制N-钙粘蛋白内在化；(c)激活或抑制PI3激酶或Akt途径；(d)激活或抑制β-连环蛋白信号传导；(e)阻断N-钙粘蛋白与FGFR或其他酪氨酸激酶受体的异二聚化；或(f)阻断或增强被ADAMlO或其他金属肽酶切割。如果候选化合物或抗体显示出具有(a)-(f)中任一项所述的活性，则该抗体或化合物被认为是抗-N-钙粘蛋白抗体或是抑制患者体内表达N-钙粘蛋白的癌症的生长的化合物。例如，当抗体或化合物抑制NF κ - β 信号传导或转录；或者当抗体或化合物抑制N-钙粘蛋白内在化时，所述抗体或化合物被认为是抗-N-钙粘蛋白抗体或是抑制患者体内表达N-钙粘蛋白的癌症的生长的化合物。附图简要说明

图1.前列腺癌中N-钙粘蛋白的信号传导模式。图2. N-钙粘蛋白活化NF- γ β。图3. N-钙粘蛋白活化NF- γ β。图4. N-钙粘蛋白在Cl细胞的细胞表面表达。图5.NF-Y β局限于N-钙粘蛋白阳性细胞(Cl)的细胞核。图6. N-钙粘蛋白表达导致诱导IL-6、IL-8、TGF β 2和bcl_2。图7 诱导基因与N-钙粘蛋白水平相关。图8 =N-钙粘蛋白敲减导致IL-6和IL-8下调。
图9. N-钙粘蛋白抗体处理后的NF- γ β活性。
图10. PC3细胞中的N-钙粘蛋白48小时抗体培育。
图11. N-钙粘蛋白敲减导致活化的Akt下调。图12. N-钙粘蛋白特异性抗体活化，然后下调Akt活性。图13.靶向N-钙粘蛋白第一胞外结构域的抗体克隆的FACS分析。图14.靶向N-钙粘蛋白第四胞外结构域的抗体克隆的FACS分析。图15.纯化的单克隆N-钙粘蛋白抗体克隆的FACS分析。图16.单克隆N-钙粘蛋白抗体克隆的体外侵袭试验。图17.用抗N-钙粘蛋白抗体1H7和EC4处理的N-钙粘蛋白空白肿瘤(null tumors)的生长曲线，未显示出显著的抑制效应(17a)。用相同抗体处理的PC3前列腺癌细胞的肿瘤生长曲线，证明对生长抑制有效(17b)。用1H7和EC4抗体处理下建立的大PC3肿瘤的生长曲线(17c)。用EC4抗体处理下PC3肿瘤的长期生长曲线(17d)。图18.显示抗体对N-钙粘蛋白的影响的体内实验。图19. (a)雄激素非依赖性LAPC9前列腺癌的免疫组织化学染色；(b)用N-钙粘蛋白抗体治疗雄激素依赖性和非依赖性LAPC-9肿瘤。图20.分选的和未分选的LAPC9AI细胞的肿瘤生长曲线。图21和22.进展的N-钙粘蛋白分选肿瘤的FACS结果。图23. LNCaP-Cl肿瘤的生长曲线，显示了 N-钙粘蛋白抗体的抑制效应。图N-钙粘蛋白抗体抑制建立的LAPC-9雄激素非依赖性肿瘤(Ma)和建立的大LAPC-9雄激素非依赖性肿瘤的生长。图25.抗体EC4以剂量相关方式抑制裸鼠中PC3肿瘤生长。图26.在长达45天和70天监测的肿瘤进展的两项研究中，N-钙粘蛋白抗体1H7和EC4对LAPC-9雄激素依赖性肿瘤生长显示出抑制效应。性。
图27. N-钙粘蛋白分选细胞在阉割SCID小鼠中显示出生长优势。 图28.在LAPC9肿瘤细胞连续传代中N-钙粘蛋白表达和雄激素受体水平的相关
发明详述
本发明涉及用于治疗表达N-钙粘蛋白的癌症的靶向细胞表面蛋白N-钙粘蛋白的新型单克隆抗体。所述癌症可以是前列腺癌、膀胱癌、或表达N-钙粘蛋白的其他癌症。本发明还涉及用靶向N-钙粘蛋白的抗体治疗癌症的方法。本发明人发现，所述抗体可通过如下方式发挥作用激活或抑制NF κ-β信号传导和转录；激活或抑制N-钙粘蛋白内在化；激活或抑制ΡΙ3激酶或Akt途径；激活或抑制连环蛋白信号传导；阻断N-钙粘蛋白与FGFR或其他酪氨酸激酶受体的异二聚化；或阻断或增强被ADAMlO或其他金属肽酶的切割。图1是N-钙粘蛋白介导的信号转导的概述。图1显示了 NF-K i3、Akt和β-连环蛋白途径的活化。本发明人提出的证据显示，N-钙粘蛋白抗体通过改变这些途径中的一个或多个而发挥作用。^X“N-钙粘蛋白和E-钙粘蛋白”表示具有以下特点的核酸(例如，基因、前-mRNA、 mRNA)以及多肽、多态变体、等位基因、突变体和种间同源物)(1)所具有的氨基酸序列优选在至少约25、50、100、200、500、1000或更多氨基酸的区域上与由各参考核酸编码的多肽或本文所述氨基酸序列(例如描述于GenBank登录号NM_001792 (N-钙粘蛋白mRNA)、NP_001783 (N-钙粘蛋白)、ΝΜ_004360 (Ε-钙粘蛋白 mRNA)和 ΝΡ_004351 (Ε-钙粘蛋白))具有高于约60%的氨基酸序列相同性，6570%,75%,80%,85%,90%、优选91 %、92%、 93% ,94^^95% ,96^^97^^98%或99%或更高的氨基酸序列相同性；(2)特异性结合于抗体(例如，多克隆抗体)，所述抗体针对包含如GenBank登录号NP_001783(N_钙粘蛋白)或NP_004351(E-钙粘蛋白)所述参考氨基酸序列的免疫原；其各自的免疫原性片段，以及其各自的保守性修饰变体；(3)在严格杂交条件下与编码分别如GenBank登录号 NP_001783(N-钙粘蛋白)或NP_004351 (E-钙粘蛋白)所述的参考氨基酸序列的核酸及其各自的保守性修饰变体特异性杂交；(4)具有的核酸序列优选在至少约25、50、100、150、 200、500、1000或更多核苷酸的区域上与如GenBank登录号NM_001792 (N-钙粘蛋白mRNA) 或ΝΜ_004360 (Ε-钙粘蛋白mRNA)所示的参考核酸序列具有高于约95%，优选高于约96%、 97^^98^^99%或更高的核酸序列相同性。多核苷酸或多肽序列通常来自哺乳动物，包括但不限于灵长类，例如人；啮齿类，如大鼠、小鼠、仓鼠；牛、猪、马、绵羊或任何哺乳动物。 本发明的核酸和蛋白质包括天然产生的或重组的分子。“癌症”表示人的癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病等，包括实体瘤和淋巴样癌、肾癌、 乳腺癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、脑癌、头颈癌、皮肤癌、子宫癌、睾丸癌、食道癌、肝癌、淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤)、白血病、以及多发性骨髓瘤。“泌尿生殖器癌症”表示泌尿道和生殖组织的人类癌症，所述组织包括但不限于肾脏、膀胱、泌尿道、尿道、前列腺、阴茎、睾丸、外阴、阴道、宫颈和卵巢组织。文中，要治疗的癌症可以是以N-钙粘蛋白过度活化为特征的癌症。或者，本文的要治疗的癌症可以是N-钙粘蛋白以正常或较低水平表达的癌症，或是N-钙粘蛋白被某细胞亚群表达的癌症，以及N-钙粘蛋白未过表达的癌症。在本发明的一个实施方式中，将进行诊断或预后试验以确定患者的癌症是否以表达N-钙粘蛋白为特征。可考虑各种确定这种扩增/表达的试验，包括免疫组织化学、FISH和流出抗原试验(shed antigen assay), DNA印迹、或PCR技术。此外，可用体内诊断试验，例如通过给予结合待检测分子并被可检测标记(例如，放射性同位素)标记的分子(如抗体)并在外部扫描患者以确定标记的定位， 来评价N-钙粘蛋白的表达或扩增。在一些实施方式中，待治疗的癌症还不是侵袭性的，但表达N-钙粘蛋白。“疗法抗性的”癌症、肿瘤细胞和肿瘤表示对凋亡-介导的(例如，通过死亡受体细胞信号传导，如，Fas配体受体，TRAIL受体，TNF-Rl，化疗药物，射线)或非-凋亡介导的 (例如，毒药，化学药剂)癌症疗法(包括化疗、激素疗法、放疗和免疫疗法)产生抗性的或难治性的癌症。“过表达”表示N-钙粘蛋白、LY6-E和E-钙粘蛋白在测试组织样品中的RNA或蛋白质表达明显高于N-钙粘蛋白、LY6-E和E-钙粘蛋白分别在对照组织样品中的RNA或蛋白质表达。在一个实施方式中，所述组织样品是自体的。与来自不太可能发展到转移的患者的癌组织或与正常(即，非癌性)组织样品的N-钙粘蛋白或LY6-E表达相比，与侵袭、转移、 激素非依赖性(例如，雄激素非依赖性)或治疗难治性相关或类似可能性增加的癌性测试组织样品(例如，膀胱，前列腺)的N-钙粘蛋白或LY6-E mRNA或蛋白质的表达通常至少是 2倍，通常高达3、4、5、8、10或更高倍数。当观察大致相似地负载有测试样品和对照样品的凝胶条带时，更容易发现这种差异。表达增量的N-钙粘蛋白或Ly6-E的前列腺癌更可能变
8成侵袭性、转移性、或发展成雄激素非依赖性或治疗难治性癌症。由于原发性肿瘤中的小比例N-钙粘蛋白或Ly6-E阳性细胞有可能鉴定出具有高复发和转移风险的肿瘤，因此N-钙粘蛋白或Ly6-E阳性可与各种截断值(cutoff)相关。术语“过表达”或“过表达的”可互换指代与正常细胞相比，通常在癌细胞中可检测到更高水平的转录或翻译的基因。因此，过表达是指蛋白质和RNA的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工、稳定性改变以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达，和功能活性提高(例如在底物的酶水解作用增加的情况下)。过表达也可以是相比正常细胞或参比细胞(例如，BPH细胞)提高50%、60%、70%、80%、90%或更高。术语“表达N-钙粘蛋白的癌症”和“与N-钙粘蛋白的表达相关的癌症”可互换使用，表示表达按照上述定义的N-钙粘蛋白的癌细胞或组织。术语“癌症相关抗原”或“肿瘤特异性标记物”或“肿瘤标记物”可互换使用，表示相比正常细胞，优先在癌细胞中表达并可用来将药剂优先靶向癌细胞的分子(通常是蛋白质、碳水化合物或脂质)。标记物或抗原可在细胞表面或细胞内表达。通常，癌症相关抗原是相比正常细胞，在癌细胞内以最小降解状态稳定或表达的分子，例如，与正常细胞相比表达为2倍、3倍或更高倍数。通常，癌症相关抗原是在癌细胞内不正常合成的分子，例如，相比在正常细胞上表达的分子，含有缺失、添加或突变的分子。通常，癌症相关抗原将仅在癌细胞内表达，且不会在正常细胞内合成或表达。示例性的细胞表面肿瘤标记物包括，乳腺癌的蛋白c-erbB-2和人表皮生长因子受体(HER)，前列腺癌的PSMA，以及包括乳腺癌、卵巢癌和结肠直肠癌在内的许多癌症的碳水化合物粘蛋白类。示例性的胞内肿瘤标记物包括，例如，突变的肿瘤抑制剂或细胞周期蛋白，如P53。相反，在来自更可能变成侵袭性、转移性、或发展成雄激素非依赖性或治疗难治性癌症的癌症患者的组织样品中的癌组织样品中，E-钙粘蛋白通常表达不足。这种表达不足可以是2倍、3倍、4倍或至少5倍。在观察大致类似地负载有测试样品和对照样品的凝胶条带时，更容易发现这种差异。在更可能变成侵袭性、转移性、或发展成雄激素非依赖性或治疗难治性癌症的癌症中，N-钙粘蛋白/E-钙粘蛋白组合值因此更高，可以高到至少2倍、 3倍、4倍、5倍、10倍或者20倍。由于原发性肿瘤中的小比例N-钙粘蛋白阳性细胞有可能鉴定出具有高复发和转移风险的肿瘤，因此N-钙粘蛋白阳性/e-钙粘蛋白阴性可与各种截断值相关。“激动剂"指结合于本发明多肽或多核苷酸，并刺激、提高、激活、促进、增强活性、敏化或上调本发明多肽或多核苷酸的活性或表达的试剂。“拮抗剂"指抑制本发明多肽或多核苷酸的表达、或结合、部分或完全阻断刺激、 降低、防止、延迟激活、灭活、降低敏感性或下调本发明多肽或多核苷酸活性的试剂。表达或活性的“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”分别用来表示用体外和体内表达或活性试验鉴定的抑制、激活或调节分子，例如，配体、拮抗剂、激动剂以及它们的同系物和模拟物。术语“调节剂”包括抑制剂和激活剂。抑制剂是，例如，抑制本发明多肽或多核苷酸表达，或者结合、部分或完全阻断刺激或酶活性、降低、防止、延迟激活、灭活、脱敏或下调本发明多肽或多核苷酸活性的物质，如拮抗剂。激活剂是，例如，诱导或激活本发明多肽或多核苷酸的表达，或者结合、刺激、提高、打开、激活、促进、增强活化或酶活性、敏化或上调本发明多肽或多核苷酸活性的物质，如激动剂。调节剂包括天然产生的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、化学小分子等。鉴定抑制剂和激活剂的实验包括例如，在存在或不存在本发明多肽或多核苷酸的条件下，将推定的调节剂化合物施加于细胞，然后测定其对本发明多肽或多核苷酸活性的功能性影响。将用潜在的激活剂、抑制剂或调节剂处理的包含本发明多肽或多核苷酸的样品或试验物与没有抑制剂、激活剂或调节剂的对照样品作比较，以检测影响程度。将对照样品(未用调节剂处理)的相对活性值指定为100%。相对于对照，本发明多肽或多核苷酸的活性值约为80%，任选为50%或25-1%时，实现了抑制。相对于对照，本发明多肽或多核苷酸的活性值为110%，任选为150%，任选为200-500%，或1000-3000%或更高时，实现了激活。本文所用的术语“测试化合物”或“候选药物”或“调节剂”或其语法等价体描述了天然产生或合成的任何分子，例如蛋白质、寡肽(例如，长约5-约25个氨基酸，优选长约 10-20或12-18氨基酸，优选长12、15或18氨基酸)、有机小分子、多糖、脂质、脂肪酸、多核苷酸、RNAi、siRNA、抗体、寡核苷酸等。测试化合物可以是测试化合物文库的形式，例如提供足够多样性的组合文库或随机文库。测试化合物任选地连接于融合伙伴，如靶向化合物、 拯救化合物、二聚化化合物、稳定化合物、可寻址化合物和其它官能部分。一般可通过鉴定具有某些所需特性或活性(例如抑制活性)的测试化合物(称为“前导化合物”)、产生该前导化合物的变体、并评估那些变体化合物的特性和活性来产生具有有用特性的新化学实体。这种分析中常常采用高通量筛选(HTQ方法。“有机小分子”指天然产生或合成的有机分子，其分子量大于约50道尔顿并小于约 2500道尔顿，优选小于约2000道尔顿，优选介于约100-约1000道尔顿之间，更优选介于约 200-约500道尔顿之间。细胞毒剂包括“细胞周期特异性”或“抗有丝分裂”或“细胞骨架相互作用”药齐U。 这些术语可互换使用，表示阻断有丝分裂中的细胞的任何药剂。这种药剂可用于化疗。通常，细胞周期特异性药物结合细胞骨架蛋白微管蛋白并阻断微管蛋白聚合形成微管，从而导致细胞分裂停留在中期。示例性的细胞周期特异性药物包括长春花生物碱类、紫杉烷类、 秋水仙碱和鬼白毒素。示例性的长春花生物碱类包括长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。示例性的紫杉烷类包括紫杉醇和多西紫杉醇。细胞骨架相互作用药物的其他例子包括 2-甲氧基雌二醇。“siRNA”或“RNAi”表示形成双链RNA的核酸，当siRNA在与某基因或靶基因相同的细胞内表达时，该双链RNA能够降低或抑制所述基因或靶基因的表达。“siRNA”或“RNAi” 因此表示由互补链形成的双链RNA。杂交形成双链分子的siRNA的互补部分通常基本相同或完全相同。在一个实施方式中，siRNA表示与靶基因基本相同或完全相同并形成双链 siRNA的核酸。通常，siRNA的长度至少约15-50个核苷酸(例如，双链siRNA每条互补序列的长度为15-50个核苷酸，且双链siRNA的长度为约15-50个碱基对，优选约20-30个碱基核苷酸，优选长度为约20-25个或约24- 个核苷酸，例如长度为20、21、22、23、对、25、 26,27,28,29或30个核苷酸。siRNA分子和载体的设计和制造是本领域普通技术人员熟知的。例如，设计合适的 siRNA的有效方法是从mRNA转录本的AUG起始密码子开始(例如，参见，图5)并扫描AA 二核苷酸序列(参见Elbashir等EMBO J 20 :6877-6888 (2001)。每个AA和3，相邻核苷酸是潜在的siRNA靶位点。相邻位点序列的长度将决定siRNA的长度。例如，19个相邻位点
10将得到21个核苷酸长的siRNA，具有3’突出端UU 二核苷酸的siRNA通常是最有效的。该方法也和用RNA pol III来转录发夹siRNA—致。RNA pol III在4_6个核苷酸poly (T) 处终止转录，从而形成具有短poly (U)尾的RNA分子。然而，具有其他3’末端二核苷酸突出端的siRNA也能有效产生RNAi，可根据经验选择该序列。在选择时，可通过BLAST检索避免与其他编码序列的同源性超过16-17个毗连碱基对的靶序列(参见美国国家生物技术信息中心(NCBI,National Center for Biotechnology Information),网址ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)。可直接施用siRNA，或用siRNA表达载体来诱导RNAi，其设计标准不同。载体可插入有由短间隔序列隔开并终止于用于终止转录的一串T的两条反向重复序列。预计表达的 RNA转录物将折叠成短发夹siRNA。对于siRNA靶序列、编码假设的发夹的茎的反向重复序列的长度、反向重复序列的顺序、编码发夹的环的间隔序列的长度和组成、以及是否存在5’ 突出端的选择是可变的。siRNA表达盒的优选顺序是有义链、短间隔、和反义链。具有这些不同茎长度(例如，15-30)的发夹siRNA是适用的。连接发夹siRNA的有义链和反义链的环的长度是可变的(例如，3-9个核苷酸，或更长)。载体中可包含启动子和表达增强子或操作性连接于编码siRNA的核苷酸序列的其他调控元件。表述“控制序列”是指可操作连接的编码序列在特定宿主有机体内表达所必须的DNA序列。适用于原核细胞的控制序列， 例如，包括启动子、任选操纵子序列以及核糖体结合位点。真核细胞已知利用启动子、多聚腺苷酸信号和增强子。这些控制元件可设计成允许临床医生通过加入或控制被这些控制元件所响应的外部因素而关闭或打开基因表达。构建含有所需治疗基因编码和控制序列的合适载体时采用了本领域熟知的标准连接和限制技术(参见Maniatis等，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)，冷泉港，纽约(1982))。分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸可被切割、修整、或重新连接成所需形式。当核酸与另一种核酸序列处于功能性相互关系中时，则该核酸是“可操作连接的”。例如，当前序列或分泌前导子的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白时，则该DNA与多肽的DNA可操作地连接；当启动子或增强子可影响编码序列的转录时，则该启动子或增强子与该编码序列可操作地连接；或者当核糖体结合位点所处的位置能促进翻译时，则该核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作连接”意味着被连接的DNA序列是相互靠近的，以及在分泌前导序列中是毗连的，并且处于阅读框架中。然而，增强子不一定是连续的。在方便的限制性酶切位点上通过连接反应可完成连接。如果这样的位点不存在，那么可按照常规实践合成寡核苷酸接头或连接子。“测定功能效应”表示对升高或降低间接或直接受本发明的多核苷酸或多肽影响的参数的化合物的测定，例如，测量物理和化学或表型效应。这种功能效应可通过本领域技术人员已知的任何方法来测定，例如，蛋白质的分光(例如，荧光、吸光度、折射率)、流体动力学(例如，形状)、色谱或溶解性的改变；测量可诱导标记物或蛋白质转录活性；测量结合活性或结合试验，例如，与抗体的结合；测量配体结合亲和力的改变；测量钙流；测量本发明多肽的酶产物的累积或者底物的消耗；改变酶活性，例如，激酶活性，测量本发明多肽蛋白质水平的变化；测量RNA稳定性；G蛋白结合；G蛋白偶联受体(GPCR)磷酸化或去磷酸化； 信号转导，例如，受体-配体相互作用，第二信使浓度(例如，cAMP、IP3、或胞内Ca2+)；鉴定下游或报告基因(CAT、萤光素酶、β-gal、GFP等)的表达，例如，通过化学发光、荧光、比色反应、抗体结合、可诱导标记物以及配体结合试验。将用潜在的激活剂、抑制剂或调节剂处理的包含本发明所述核酸或蛋白质的样品或试验物与没有抑制剂、激活剂或调节剂的对照样品作比较，以检测抑制程度。将对照样品 (未用抑制剂处理)的相对蛋白活性值指定为100%。相对于对照，活性值约为80%，优选 50%，更优选25-0%时，可实现抑制。当活性值相对于对照(未用激活剂处理)为110%， 更优选150%，更优选200-500% (即是对照的2-5倍)，更优选1000-3000%时，可实现活化。“生物样品”包括组织切片，例如活检和尸检样品，以及为组织学目的取得的冷冻切片。这种样品包括血液和血液组分或产物(例如，血清、血浆、血小板、红细胞等)、痰、组织、培养细胞，例如原代培养物、外植块、以及转化细胞、粪便、尿液等。生物样品通常获自真核生物体，最优选哺乳动物，例如灵长动物，如黑猩猩或人；牛；犬；猫；啮齿动物，如豚鼠、 大鼠、小鼠；兔；或鸟类；爬行动物；或鱼类。“活检”指取出组织样品以供诊断或预后评估的过程，也指组织样本自身。可将本领域已知的任何活检技术应用于本发明的诊断和预后方法。所应用的活检技术通常取决于待评估的组织类型(即，前列腺、淋巴结、肝脏、骨髓、血细胞)、肿瘤的大小和类型(即实体的或悬浮的(即，血液或腹水))等因素。代表性的活检技术包括切除活检、切取活检、 针吸活检、手术活检和骨髓活检。“切取活检”表示将整个肿瘤体以及围绕它的薄薄一层正常组织切离。“切开式活检”表示切取一包含肿瘤的横切面直径的楔形组织。通过内窥镜检查或荧光显微术做出的诊断或预后可要求对肿瘤实体进行“芯针活检”或“细针抽吸活检”，其通常将获得肿瘤实体内细胞的悬液。关于活检技术的讨论可参见，例如Harrison' s Principles of Internal Medicine (内科学哈里森原理)，Kasper 等编，第 16 版，2005，第 70章，以及整个第V部分。就两条或更多条核酸或多肽序列而言，术语“相同”或“相同性”百分比指利用默认参数如下所示的BLAST或BLAST 2. 0序列比较算法，或通过手工比对和目测观察(参见， 例如NCBI网址ncbi. nlm. nih. gov/BLAST等)测定到两条或更多条序列或子序列相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗或指定区域进行最大对应性的比较和比对时，在特定区域上有约60%相同性，优选65%、70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高相同性)。然后称这些序列“基本上相同”。该定义还指或可适用于测试序列的互补(compliment)。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些序列。如下所述，优选的算法可说明缺口等。优选在至少约25个氨基酸或核苷酸长度，或更优选在50-100个氨基酸或核苷酸长度的区域具有相同性。在序列比较中，一般将一种序列用作与测试序列相比的参比序列。使用序列比较算法时，将测试和参比序列均输入计算机，如果必要则指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选使用默认的程序参数，或者可指定另选的参数。然后，该序列比较算法根据程序参数计算出测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。本文所用的“比较窗”包括参考选自20-600，通常约50-200，更常见约100-150中任一数量的毗连位置的区段，对两个序列进行最优比对后，可将该区段中的序列与相同数量毗连位置的参比序列作比较。比对序列进行比较的方法是本领域熟知的。可通过，例如如下的方法进行最优序列比对以便比较=Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv. Appl. Math. 2 :482(1981)，Needleman 和 Wunsch 的同源性比对算法，J. Mol. Biol. 48 :443(1970)， Pearson 和 Lipman 的相似性搜索法，Proc. Nat，1. Acad. Sci. USA 85 :2444(1988)，计算机化执行这些算法(遗传学计算组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包 (Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，575 理学博士(Science Dr.)，威斯康星州麦迪逊(Madison，WI))，或手工比对和目测(参见例如， 《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology) (Ausubel等编， 1995 增刊))。适合测定序列相同性和序列相似性百分数的算法的优选例子分别是BLAST和 BLAST 2. O 算法，参见 Altschul 等，Nuc. Acids Res. 25 :3389-3402 (1977)和 Altschul 等， J. Mol. Biol. 215 =403-410 (1990)。使用BLAST和BLAST 2. 0，设定本文所述的参数，以确定本发明核酸和蛋白质的序列相同性百分数。进行BLAST分析的软件可从公众渠道由国家生物技术信息中心(NCBI)网站获得。该算法包括首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字 (short words)来鉴定高评分序列对(HSP)，该短字与数据库序列中相同长度的字比对时， 匹配或满足一些正值阈值评分Τ。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。将这些初始相邻字的命中用作启动搜索发现含有它们的更长的HSP的种子。该字命中在沿各序列的两个方向上延伸，直到可增加累积的比对评分。对于核苷酸序列而言，利用参数M(—对匹配残基的奖励评分；总是> 0)和N(错配残基的罚分；总是< 0)计算累积评分。对于氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。在以下情况出现时，中止字命中在各个方向上的延伸累积比对评分比最大获得值降低X ；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到各序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对核苷酸序列而言)采用的默认值如下字长(W)ll，期望值(E)10，M =5, N = -4，以及比较两条链。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默认值为字长3， 期望值(E) 10，BL0SUM62 评分矩阵(参见 Henikoff 和 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915(1989))比对(B) 50，期望值(E) 10，M = 5，N =-4，以及比较两条链。“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和它们的聚合物及其互补体。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，它们是合成、天然产生的和非天然产生的，它们与参比核酸的结合特性类似，它们与参比核苷酸的代谢方式类似。这类类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯 (phosphoramidates)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2_0_甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有表明，特定核酸序列也隐含包括其保守修饰变体(如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体说，可通过产生一个或多个选择的(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代(Batzer 等，Nucleic Acid Res. 19 :5081 (1991) ；Ohtsuka 等，J. Biol. Chem. 260 2605-2608(1985) ；Rossolini 等，Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。术语核酸与基因、 cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互换使用。特定的核酸序列还隐含包括“剪接变体”。类似地，核酸编码的特定蛋白质隐含包括该核酸的剪接变体编码的任何蛋白质。如其名称所暗示的，“剪接变体”是基因的可变剪接产物。转录后，可剪接初始核酸转录物，因而不同的(可变)核酸剪接产物能编码不同多肽。产生剪接变体的机制有所不同，但包括外显子的可变剪接。该定义还包括通过通读转录而源自同一核酸的可变多肽(alternate polypeptide) 0该定义包括剪接反应的任何产物，包括重组形式的剪接产物。钾通道剪接变体的例子描述于Leicher等，J.Biol. Chem. 273(52) :35095-35101 (1998)。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，指代氨基酸残基的聚合物。该术语可应用于一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。术语“氨基酸”指天然产生和合成的氨基酸、以及通过与天然产生氨基酸相类似方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是遗传密码编码的氨基酸， 以及随后修饰的氨基酸，如羟基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然产生的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基结合的 α碳，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基 (如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但与天然产生的氨基酸的基本化学结构保持相同。氨基酸模拟物指结构不同于氨基酸的普通化学结构，但作用方式类似于天然产生的氨基酸的化学化合物。在本文中，氨基酸可用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的通用三字母代号或单字母代号表示。同样，核苷酸可用其普遍接受的单字母代码表示。“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和G⑶都编码丙氨酸。因此，在密码子确定为丙氨酸的每个位置上，可将密码子改变为所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰变异的一种。本文所述的编码多肽的每种核酸序列也描述该核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，可修饰核酸中的各个密码子(除了 AUG和TGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能相同的分子。 因此，就表达产物但不针对实际探针序列而言，在所述的各序列中暗示了编码多肽的核酸的各沉默变异。至于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行单个取代、缺失或加入，以在编码序列中改变、加入或删除一个氨基酸或少量氨基酸是“保守修饰变体”，该改变使得某一氨基酸被化学相似的氨基酸所取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。这类保守修饰的变体包括并不排除本发明的多态性变体、 种间类似物和等位基因。以下八组各自含有可互相保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)，谷胺酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K) ；5)异亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸 (W) ；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton， Proteins(1984))ο“标记”或“可检测部分”是能通过分光光度方法、光化学方法、生物化学方法、免
14疫化学方法、化学方法或其它物理方法检测的组成物。例如，有用的标记物包括32P、荧光染料、电子密度试剂、酶(如经常用于ELISA)、生物素、地高辛、或可通过例如将放射性标记物掺入肽中而可检测或可用于检测与肽特异性反应的抗体的蛋白质和半抗原。在述及例如细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质作了修饰，或该细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因或表达在其它情况下异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。用于核酸部分时，术语“异源”指该核酸包含在天然情况下不存在于同一关系中的两个或多个子序列。例如，核酸一般是重组产生的，具有两个或多个来自无关基因的序列， 它们经排列组成新的功能性核酸，例如启动子来自一个来源而编码区来自另一来源。相似地，异源蛋白表示该蛋白包含天然情况下不存在于同一关系中的两个或多个子序列(如融合蛋白)。短语“严格杂交条件”指探针与其靶子序列(通常在核酸的复杂混合物中)杂交，但不与其它序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同环境中会有差异。较长的序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的详细指导参见Ti jssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes (生物化学和分子生物学技术-用核酸探针杂交)，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays (杂交原理和核酸试验方案概述)〃(1993)。 严格条件通常选择比具体序列在规定离子强度PH下的热解链温度(Tm)低约5-10°C。Tm是在规定的离子强度、PH和核酸浓度下，50%的与靶标互补的探针与靶序列杂交平衡时的温度(由于存在的靶序列过量，Tffl时，在平衡时有50%的探针被占据)。还可进入去稳定剂， 例如甲酰胺来获得严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选是背景杂交的10倍。示范性的严谨杂交条件可以如下所述50%甲酰胺、5XSSC和 SDS，42°C培育，或者 5XSSC、1% SDS、65°C培育，用 0. 2X SSC 和 0. SDS 在 65°C洗涤。如果编码的多肽基本相同，那么在严格条件下不相互杂交的核酸仍然基本相同。 例如，用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，可能发生这种情况。在这种情况下，核酸一般在中等严格的杂交条件下杂交。示范性“中等严格杂交条件”包括37°C， 在40%甲酰胺、IM NaClU% SDS的缓冲液中杂交，45°C，1 XSSC洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。本领域普通技术人员不难认识到，可利用其他杂交和洗涤条件提供类似严格性的条件。许多参考文献提供了确定杂交参数的其它指导，例如《新编分子生物学实验指南》 (Current Protocols in Molecular Biology), Ausubel^lt 1 ^^^ ] (John ffiley&Sons)。对于PCR，低严格性扩增的温度通常是约36°C，虽然退火温度可以根据引物长度而介于约32 °C和48 °C之间不等。对于高严格性PCR扩增，典型的温度是约62 °C，虽然高严格性退火温度可以根据引物长度和特异性而介于约50°C和约65°C之间不等。高和低严格性扩增的典型循环条件包括90°C -95°C，30秒-2分钟的变性阶段，持续30秒-2分钟的退火阶段，和约72°C，1-2分钟的延伸阶段。低和高严格性扩增反应的方案和指导见，例如Irmis 等，(1990) PCR Protocols, AGuide to Methods and Applications (PCR 方案，方法和应用指南)，学术出版社公司(Academic Press, Inc.)，纽约)。
“抗体”指包含免疫球蛋白基因的框架区的多肽，或其特异性结合和识别抗原的片段。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε、和μ恒定区基因以及大量免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为Y、μ、α、δ或ε，进而分别限定了免疫球蛋白类别，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗体的抗原结合区对于结合的特异性和亲和力至关重要。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单位包含四聚体。各四聚体由相同两对多肽链构成，各对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。各链的N-末端限定了主要负责抗原识别的约100-110或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链和可变重链(Vh)分别指这些轻链和重链。存在的抗体可以是，例如完整的免疫球蛋白或用各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段。因此，例如，胃蛋白酶消化抗体绞链区下的二硫键以产生F(ab) ’2，即Fab的二聚体，Fab本身是通过二硫键连接于Vh-ChI的轻链。F(ab)’2可在温和条件下还原以打开绞链区的二硫键，从而将F(ab)’ 2 二聚体转化成Fab’单体。Fab’单体实质上是具有绞链区部分的Fab (参见Fundamental Immunology (基础免疫学)(Paul编，第3版，1993)。虽然根据完整抗体的消化定义了各种抗体片段，技术人员应知道，可通过化学方法或采用重组DNA 技术从头合成这些片段。因此，本文所用的术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或采用重组DNA方法从头合成的那些(例如，单链Fv)或利用噬菌体展示文库鉴定的那些(参见，例如 McCafferty 等，Nature 348 :552-554 (1990)) 为了制备合适的本发明抗体以及为了本发明的应用，如重组体、单克隆或多克隆抗体，可适用本领域已知的多种技术(参见，例如，Kohler&Milstein，Nature 256 495-497(1975) ；Kozbor 等，Immunology Today 4:72(1983) ；Cole 等，第 77-96 页，《单克隆抗体禾口癌症治疗》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy), Alan R. Liss, Inc. (1985) ；Coligan，《免疫学最新实验指南》(Current Protocols in Immunology) (1991)； Harlow&Lane，《抗体实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual) (1988)；和 Goding， 《单克隆抗体原则与实践》(Monoclonal Antibodies =Principles and Practice)(第二版， 1986))。编码感兴趣抗体重链和轻链的基因可从细胞克隆，例如，编码单克隆抗体的基因可从杂交瘤克隆并用来制造重组单克隆抗体。编码单克隆抗体重链和轻链的基因文库也可从杂交瘤或血浆细胞制造。重链和轻链基因产物的随机组合将产生大量具有不同抗原特异性的抗体(参见，例如，Kuby，Immunology (第三版，1997))。制造单链抗体或重组抗体的技术 (美国专利4，946，778，美国专利4，816，567)也适用于制造本发明多肽的抗体。同时，转基因小鼠或其他生物(如其他哺乳动物)也可用来表达人源化抗体或人抗体(参见，例如，美国专利 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，661，016，Marks 等， Bio/Technology 10:779-783(1992) ；Lonberg 等，Nature 368:856-859(1994) ；Morrison, Nature 368:812-13(1994) ；Fishwild 等，Nature Biotechnology 14:845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996)； 禾口 Lonberg&Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93 (1995))。或者，噬菌体展示技术可用来鉴定特异性结合所选抗原的抗体和异聚 Fab 片段(参见，例如，McCafferty 等，Nature348 :552-554(1990) ；Marks 等， Biotechnology 10 :779-783 (1992))。抗体可被制成双特异的，即能够识别两种不同抗原(参见，例如，WO 93/08829，Traunecker 等，EMBO J. 10 :3655-3659(1991)；禾口 Suresh等，《酶学方法》(Methods in Enzymology) 121 :210(1986)) 0抗体也可以是异源偶联物， 例如，两个共价结合的抗体，或免疫毒素(参见，例如，美国专利4，676，980，WO 91/00360 ； W092/200373 ；和 EP 03089)。人源化或灵长动物化非人抗体的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体含有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为输入残基(import residue)，它们通常取自输入可变区。人源化实质上可根据Winter及其同事(参见，例如，Jones 等，Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature 332 :323-327(1988) ；Verhoeyen 等，kience 239:1534-1536(1988)和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992))的方法，用啮齿类CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列。因此，这种人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4，816，567)，其中基本上短于完整的人可变区被非人种类的相应序列取代。在实践中，人源化抗体一般是一些CDR残基，可能是一些FR残基被啮齿动物抗体中相似位点的残基所取代的人抗体。“嵌合抗体”是满足以下条件的抗体分子，其中(a)恒定区，或其部分，是改变的、 取代的或交换的，从而抗原结合位点(可变区)连接于类别、效应功能和/或种类不同或改变的恒定区，或连接于能赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区，或其部分，是改变的、取代的或交换的，从而可变区具有不同的或改变的抗原特异性。优选本发明的抗体以及优选用于本发明的抗体包括人源化抗体和 /或嵌合单克隆抗体。一个实施方式中，所述抗体偶联于“效应物”部分。效应物部分可以是任何数量的分子，包括标记物部分，例如放射性标记物或荧光标记物，或者可以是治疗部分。在一方面， 抗体调节蛋白质的活性。这种效应物部分包括，但不限于，抗肿瘤药、毒素、放疗剂、细胞因子、第二抗体或酶。此外，本发明提供的一个实施方式中，本发明的抗体连接于将前药转变为细胞毒剂的酶。免疫偶联物可用来将效应物部分靶向N-钙粘蛋白阳性细胞，尤其是表达N-钙粘蛋白或Ly6蛋白的细胞。通过观察类似地负载有测试样品和对照样品的凝胶条带，很容易发现这种差异。细胞毒剂的例子包括，但不限于蓖麻蛋白，多柔比星，柔红霉素，紫杉醇， 溴化乙锭，丝裂霉素，依托泊甙，替尼泊甙，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，二羟基炭疽菌素二酮，放线菌素D，白喉毒素，假单胞菌外毒素(PE)A，PE40，相思豆毒蛋白，和糖皮质激素和其他化疗剂，以及放射性同位素。合适的检测标记物包括，但不限于，放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。在部分实施方式中，本发明提供了抗N-钙粘蛋白的抗体。N-钙粘蛋白抗体可全身使用以治疗癌症(例如，前列腺或膀胱癌)，可单独使用或与效应物部分偶联。偶联于毒剂(如蓖麻蛋白)的N-钙粘蛋白抗体、以及未偶联的抗体可为天然靶向带有N-钙粘蛋白的前列腺癌细胞的有用的治疗剂。这种抗体可用于阻断侵袭。适用于本发明的N-钙粘蛋白抗体包括，但不限于，GC4、1H7、1F12和2B3。此外，包含任何一种本发明所述单克隆抗体的抗原结合区的本发明的重组蛋白可用来治疗癌症。在这种情况下，重组蛋白的抗原结合区结合于具有治疗活性的第二蛋白的至少一个功能活性部分。所述第二蛋白可包括，但不限于酶、淋巴因子、制瘤素或毒素。 合适的毒素包括多柔比星，柔红霉素，紫杉醇，溴化乙锭，丝裂霉素，依托泊甙，替尼泊甙，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，二羟基炭疽菌素二酮，放线菌素D，白喉毒素，假单胞菌外毒素 (ΡΕ) A，PE40，蓖麻蛋白，相思豆毒蛋白，糖皮质激素和放射性同位素。将治疗剂偶联于抗体的技术是公知的，参见例如，Arnon等，“在癌症治疗中用药物的免疫革巴向的单克隆抗体” (Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)，刊于《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)，Reisfeld 等(编)，第对3_56 页(ARL 公司(Alan R. Liss, Inc.) 1985)； Hellstrom等，“用于药物递送的抗体”(Antibodies For Drug Delivery)，刊于《控制的药物递送》(Controlled Drug Delivery)(第 2 版)，Robinson 等(编)，第 623-53 页 (MD公司(Marcel Dekker，Inc). 1987) Jhorpe，“癌症治疗中细胞毒剂的抗体载体综述，，(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review),干丨J于《单克隆抗体，84 :生物和临床应用》(Monoclonal Antibodies' 84 =Biological and Clinical Applications) ,Pinchera等(编)，第 475-506 页(1985)；和 Thorpe 等，“抗体-毒素偶联物的制备禾口细胞毒特性”(The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates), Immunol. Rev. ,62 :119-58(1982))。涉及蛋白质或肽时，术语“特异性(或选择性)结合”于抗体或“与...发生特异性(或选择性)免疫反应”指能在蛋白质和其它生物物质的异质群体中确定该蛋白质的存在的结合反应。因此，在指定的免疫试验条件下，该特异性抗体与特定蛋白质的结合至少为背景的两倍，更一般是背景的10-100倍以上。在这些条件下，抗体的特异性结合需要根据其与特定蛋白质的特异性而选择的抗体。例如，可选择多克隆抗体，以便只获得与所选抗原而不与其他蛋白质发生特异性免疫反应的多克隆抗体。可通过减去与其他分子发生相互作用的抗体来实现这种选择。可利用各种免疫测定形式选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，通常用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质发生特异性免疫反应的抗体(参见,例如，Harlow&Lane,《抗体应用实验室手册》(Using Antibodies, A Laboratory Manual) (1998)中描述了用来确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件)。本文的“治疗有效量或剂量”表示产生给药所需作用的剂量。准确剂量和制剂将取决于治疗目的，并将由本领域技术人员采用已知技术确定(参见，例如，Lieberman，《药物剂型》(Pharmaceutical Dosage Forms)(第1-3卷，1992) ；Lloyd，《制药工艺、科学与技术》 (The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding) (1999)；《雷明顿药物禾斗学与实践〉〉(Remington :The Science and Practice of Pharmacy),第 20 版,Gennaro 编(2003)；以及 Pickar，《剂量计算》(Dosage Calculations) (1999))。术语"药学上可接受的盐"或"药学上可接受的载体"应包括根据本文所述化合物上发现的具体取代基，用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。当本发明化合物含有相对酸性的官能团时，可通过将该化合物的中性形式接触足量所需碱来获得碱加成盐，所述碱可以是纯的碱形式或在合适惰性溶剂中的形式。药学上可接受的碱加成盐的例子包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基或镁盐，或类似盐。当本发明化合物含有相对碱性的官能团时，可通过将该化合物的中性形式接触足量所需酸来获得酸加成盐，所述酸可以是纯酸形式或在合适惰性溶剂中的形式。药学上可接受的酸加成盐的例子包括衍生自无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐，磷酸盐、磷酸氢盐，磷酸二氢盐、 硫酸盐、硫酸氢盐、氢碘酸盐或亚磷酸盐等，以及衍生自相对无毒的有机酸的盐，如乙酸盐、
18丙酸盐、异丁酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、乳酸盐、 扁桃酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、对甲基苯磺酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。也包括氨基酸的盐，如精氨酸盐等，和有机酸的盐，如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如，Berge 等，Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19(1977))。本发明的某些特定化合物含有能够使该化合物转变为碱或酸加成盐的碱性和酸性官能团。本发明适合使用本领域技术人员已知的其它药学上可接受的载体。可将该盐与碱或酸接触，并以常规方式分离母体化合物，从而再生该化合物的中性形式。该化合物的母体形式的某些物理特性(例如在极性溶剂中的溶解度)与各种盐形式不同，但在本发明目的的其它方面该盐等同于该化合物的母体形式。除盐形式以外，本发明还提供前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是在生理条件下容易通过化学改变而提供本发明的化合物。此外，在离体环境下，前药可通过化学或生化方法转变为本发明化合物。例如，放置在含有合适酶或化学试剂的透皮贴片储库中时，前药可缓慢转变为本发明化合物。本发明的某些化合物可以非溶剂合形式以及溶剂合形式(包括水合形式)存在。 通常，溶剂合形式等同于非溶剂合形式，均应落入本发明范围。本发明某些化合物可以多晶形式或无定形形式存在。通常，在本发明所考虑的应用中所有物理形式是等同的，这些物理形式均应落入本发明范围。本发明某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋物、非对映异构体、几何异构体和单个异构体均应落入本发明范围。上皮向间质转化(EMT)表示上皮肿瘤细胞获得了间质特征。在癌症中，EMT与侵袭和运动行为(motile behavior)相关，并且可能是转移情况下的主要过程。EMT与预后不良相关，并由多种转录因子(如SNAIL、SLUG和TWIST)介导。E-钙粘蛋白是一种细胞表面蛋白，它参与上皮细胞-细胞黏附，且通常在侵袭性和转移性实体瘤中消失。详细实施方式本发明描述了两种产生能结合N-钙粘蛋白抗原决定簇的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系。所述小鼠杂交瘤细胞系以ATCC登录号PTA-9387(1H7)和ATCC登录号 PTA-9388 (EC4)保藏。在本发明的一个实施方式中，抗体是由以ATCC登录号PTA-9387保藏的杂交瘤细胞系产生的。在本发明的另一个实施方式中，抗体是由以ATCC登录号PTA-9388保藏的杂交瘤细胞系产生的。以ATCC登录号PTA-9387和ATCC登录号PTA-9388保藏的细胞遵照布达佩斯条约，于2008年7月23日保藏于美国模式培养物保藏所(ATCC)，10801大学路(University Boulevard)，马纳萨斯，弗吉尼亚州，20110。在2008年8月29日检测并证实了存活。在本发明的一些实施方式中，制造了能够在体内或体外结合与以ATCC登录号 PTA-9387保藏于美国模式培养物保藏所的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体相同的N-钙粘蛋白抗原决定簇的抗体或其片段。在本发明的一些实施方式中，制造了能够在体内或体外结合与以ATCC登录号PTA-9388保藏于美国模式培养物保藏所的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体相同的N-钙粘蛋白抗原决定簇的抗体或其片段。
在一些实施方式中，所述抗体能够结合N-钙粘蛋白的第一胞外结构域。在一些实施方式中，所述抗体能够结合N-钙粘蛋白的第二胞外结构域。在一些实施方式中，所述抗体能够结合N-钙粘蛋白的第三胞外结构域。在一些实施方式中，所述抗体能够结合N-钙粘蛋白的第一到第三胞外结构域。在一些实施方式中，所述抗体能够结合N-钙粘蛋白的第四胞外结构域。本发明还涉及抑制患者体内癌细胞生长或将所述癌细胞杀死的方法。所述方法通常包括在下述条件下，将权利要求5或11所述的抗体或其结合片段给予患者足以使所述抗体或其结合片段结合所述肿瘤细胞或前列腺癌肿瘤细胞；调节细胞活性；抑制肿瘤细胞血管发生；以及造成肿瘤细胞生长抑制或死亡，其中所述癌细胞表达或过表达N-钙粘蛋白。在本发明的一些实施方式中，所述抗体通过激活或抑制NF κ-β信号传导和转录而调节细胞活性。在本发明的一些实施方式中，所述抗体通过激活或抑制N-钙粘蛋白内在化而调节细胞活性。在本发明的一些实施方式中，所述抗体通过激活或抑制ΡΙ3激酶或Akt 途径而调节细胞活性。在本发明的一些实施方式中，所述抗体通过激活或抑制连环蛋白信号传导而调节细胞活性。在本发明的一些实施方式中，所述抗体通过阻断N-钙粘蛋白与FGFR或其他酪氨酸激酶受体的异二聚化而调节细胞活性。在本发明的一些其他实施方式中，所述抗体通过阻断或增强ADAMlO或其他金属肽酶的切割作用而调节细胞活性。在一些实施方式中，所述抗体抑制患者体内泌尿生殖器癌细胞生长或将所述癌细胞杀死。在一些实施方式中，所述抗体抑制患者体内前列腺癌细胞生长或将所述癌细胞杀死。在一些其他实施方式中，所述抗体抑制患者体内膀胱癌细胞生长或将所述癌细胞杀死。制剂和给药按照已知方法将抗-N-钙粘蛋白抗体或免疫偶联物给予人类患者，如静脉内给药，例如作为推注或通过在一段时间内连续灌注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内 (intracerobrospinal)、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。优选通过静脉内或皮下给予抗体。给药可以是局部给药或全身给药。要给予的组合物通常包含溶于药学上可接受载体(优选水性载体)的本文所述药剂(例如，N-钙粘蛋白抑制剂，N-钙粘蛋白抗体和免疫偶联物，N-钙粘蛋白siRNA以及它们的载体)。可使用各种水性载体，如缓冲盐水等等。这些溶液是无菌的且通常不含不需要的物质。这些组合物可通过常规的已知灭菌技术除菌。该组合物可含有模拟生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如PH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、 氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的活性剂浓度可广泛变化，主要根据液体体积、粘度、体重等因素，按照所选的特定给药方式和患者需要进行选择。因此，典型的供静脉内给药的药物组合物将随药剂而不同。制备可通过胃肠外途径给药的组合物的实际方法是本领域技术人员所熟知的，更详细描述参见《雷明顿药物科学》，第15版，麦克出版公司(Mack Publishing Co.，Easton，PA，1980)等出版物中。可根据给药方法以各种单位剂型给予药物组合物。例如，适合口服给药的单位剂型包括但不限于粉末、片剂、药丸、胶囊和锭剂。已知当通过口服给予抗体时，应对其进行保护以避免被消化。这通常是通过将分子与使分子抵抗被酸和酶水解的组合物进行复合， 或通过将分子包装在具有恰当抗性的载体(如脂质体或保护屏障)中实现的。保护药剂避免被消化的方法是本领域已知的。药物制剂，尤其是用于本发明的抗体和免疫偶联物以及抑制剂的药物制剂，可通过将具有所需纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合制成。这种试剂可以是冻干制剂或水性溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用剂量和浓度下对受体无毒。可接受的载体、赋形剂或稳定剂可以是乙酸、磷酸、柠檬酸、以及其他有机酸；抗氧化剂(例如，抗坏血酸)防腐剂；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白或明胶，或亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；以及氨基酸、单糖、二糖、以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂；以及离子和非离子表面活性剂(例如，聚山梨酯)；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂。可将抗体的浓度配制成 0. 5-200mg/ml 或 10-50mg/mlo制剂中也可提供其他活性化合物，包括化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂和抗激素试剂。活性成分也可被制成缓释制剂(例如，固体疏水聚合物的半透基质(例如， 聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚丙交酯。抗体和免疫偶联物也可包入通过(例如)凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中，例子分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，或包入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)或包入粗滴乳液(macroemulsion)中。可给予所述组合物进行治疗或预防处理。在治疗应用中，可将“治疗有效量”的组合物给予患病(例如，癌症)患者。对这种应用有效的量将取决于疾病的严重性以及患者的总体健康状态。根据所需剂量和频率以及患者的耐受性采取单次或多次给予组合物。出于本发明的目的，“患者”或“对象”包括人和其他动物，尤其是哺乳动物。因此，所述方法可用于人类治疗和兽医应用。在优选实施方式中，所述患者是哺乳动物，优选灵长类，在最优选实施方式，所述患者是人。其他已知癌症疗法可与本发明方法组合使用。例如，用于本发明的组合物也可用来将细胞靶向其他癌症治疗剂或使细胞对其他癌症治疗剂敏感，所述其它癌症治疗剂为例如5FU、长春碱、放线菌素D、顺钼、甲氨蝶呤等。在其他实施方式中，本发明方法与其他癌症疗法(例如，根治性前列腺切除术)， 放疗(外线束或近距离放射疗法)，激素疗法(例如，睾丸切除术，抑制睾酮产生的LHRH-类似物疗法，抗-雄激素疗法)，或化疗组合使用。根治性前列腺切除术包括除去完整前列腺和某些外围组织。当癌症还未扩散出该组织时通常采用这种处理。放疗通常用来治疗仍旧局限在前列腺内或已经扩散到周围组织的前列腺癌。如果疾病进一步发展，可采用放疗来缩小肿瘤体积。激素疗法通常用于前列腺癌已经扩散到前列腺之外的患者或复发患者。激素疗法的目的是降低男性激素雄激素的水平，从而使前列腺癌缩小或生长更加缓慢。促黄体素释放素(LHRH)促进睾酮产生的减少。这些药剂可每月或更长时间注射一次。两种这样的类似物是亮丙瑞林和戈舍瑞林。也可采用抗雄激素(例如，氟他胺、比卡鲁胺和尼鲁米特)。雄激素完全阻断表示组合使用抗雄激素和睾丸切除术或LHRH类似物。化疗可用于前列腺癌已经扩散到前列腺外且激素疗法失败的患者。它不能破坏全部的癌细胞，但能减慢肿瘤生长和减轻疼痛。一些化疗药可用来治疗用激素疗法治疗后肿瘤恢复生长或继续生长并且发生扩散的前列腺癌，这些化疗药为例如多柔比星(亚德里亚霉素)、雌氮芥、依托泊甙、米托蒽醌、长春碱和紫杉醇。两种或多种药物通常一起给予以降低癌细胞对化疗产生耐药性的可能性。小细胞癌是一种罕见的前列腺癌，相比激素疗法，它对化疗的响应更强。
在一些实施方式中，“保心药”也与N-钙粘蛋白抗体、N-钙粘蛋白结合抑制剂或N-钙粘蛋白siRNA分子组合用于本发明(参见，美国专利6，949，M5)。保心药是一种防止或降低与施用药物(如给患者施用蒽环类抗生素)相关的心肌功能障碍(即心肌病和/或充血性心力衰竭)的化合物或组合物。保心药可以，例如，阻断或降低自由基介导的心脏毒效应和/或防止或降低氧化应激损伤。该定义所包含的保心药的离子包括铁螯合剂右雷佐生(ICRF-187) (Seifert等，《药物治疗年鉴》(The Annals of Pharmacotherapy) 28 :1063-1072(1994))；降脂药和 / 或抗氧化剂，如普罗布考(Singal 等，J. Mol. Cell Cardiol. 27 :1055-1063(1995))；氨磷汀(氨基硫醇 2_[ (3-氨基丙基) 氨基]乙硫醇-二氢磷酸酯，也称为WR-2721，以及称为WR-1065的其脱磷酸细胞摄取形式)和S-3-(3-甲基氨基丙基氨基)丙基磷-硫代酸(WR-151327)，参见Green等，Cancer Research 54:738-741(1994)；地高辛(Bristow, Μ. R.选自 Bristow M R 编的《药物诱导的心脏病》(DrugHnduced Heart Disease)，纽约Elsevier 191-215 (1980)) ； β -阻断剂，如美托洛尔(Hjalmarson 等 Drugs 47 =Suppl 4 :31-9(1994)；和 Shaddy 等，Am. Heart J. 129:197-9(1995))；维生素E ；抗坏血酸(维生素C)；自由基清除剂，如齐墩果酸，熊果酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)；自旋捕获化合物，如α-苯基-叔丁基硝酮(PBN) ； (Paracchini 等，Anticancer Res. 13 :1607-1612 (1993))；有机硒基化合物如 P251 (Elbesen)；等等。组合给药考虑采用单独的制剂或单一药物制剂同时服药，以及以任意顺序连续给药，其中优选在一定时期内两种(或所有)活性剂同时发挥它们的生物学活性。经鉴定的间接或直接调节N-钙调蛋白表达和/或功能的分子和化合物可分别用来治疗表达N-钙调蛋白的癌症。N-钙粘蛋白调节剂可单独给予或与常规的化疗、放疗或免疫疗法以及现已开发的疗法组合给予。适合口服给药的制剂包括(a)液体溶液，如悬浮在稀释剂(如水、盐水和/或PEG 400)中的有效量的包装核酸；(b)胶囊、囊剂或片剂，其各自含有预定量的液态、固态、颗粒状或凝胶状的活性成分；(c)悬浮在合适液体中的悬浮液；和(d)合适的乳剂。片剂形式可包含以下一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸、以及其他赋形剂、着色剂、填料、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学上相容的载体。锭剂形式可在调味剂(如蔗糖)中包含活性成分，同时，软锭剂的活性成分包含在惰性基质中，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳剂、凝胶等，其中除了包含活性成分以外，还含有本领域已知的载体。单独的或与其他合适化合物组合的所选化合物，可被制成气溶胶制剂(即可“喷雾”)以便通过吸入给予。可将气溶胶制剂放入可接受的加压推进剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。适合直肠给药的制剂包括，例如，栓剂，其由包装的核酸和栓剂基质构成。合适的栓剂基质包括天然或合成的甘油三酯或链烷烃类。此外，也可能使用明胶直肠胶囊，它由选出的化合物和基质组合而成，所述基质包括，例如，液体甘油三酯、聚乙烯二醇和链烷烃。适合肠胃外给药(例如通过节间(关节内)、静脉内、肌内、瘤内、真皮内、腹膜内、 和皮下途径给药)的制剂包含水性和非水性的等渗无菌注射液，其中可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与受者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，其中可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在本发明的实践中，可通过例如静脉输注、口服、局部、腹膜内、膀胱内或鞘内途径给予组合物。优选的给药方法是肠胃外给药、口服给药和静脉内给药。化合物的制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器内，如安瓿或药瓶。可从之前描述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备注射溶液或悬浮液。被用于离体疗法的核酸转化的细胞也可通过上述静脉内或肠胃外途径给予。药物制品优选采取单位剂型。在这种形式中，制品被分成含有适量活性组分的单位剂量。所述单位剂型可以是包装的制品，所述包装内含有单独量的制剂，如包装在药瓶或安瓿中的药片、胶囊和粉末。同时，单位剂型也可以是胶囊、药片、扁胶囊或锭剂本身，或者可以是含合适数量胶囊、药片、扁胶囊或锭剂的包装形式。如果需要，组合物中也可含有其他相容的治疗剂。优选的药物制品将一种或多种活性N-钙粘蛋白调节剂，任选与一种或多种化疗剂或免疫治疗剂组合，以缓释制剂形式递送。通常，在治疗应用中，N-钙粘蛋白调节剂作为致敏剂给予，用来提高肿瘤细胞对包括化疗、放疗、免疫疗法和激素疗法在内的其他细胞毒癌症疗法的敏感型。在治疗癌症的治疗用途中，用于本发明药物方法的N-钙粘蛋白调节剂或抑制剂的最初给药剂量为每天约0. 001至约1000mg/kg。可采用的日剂量范围从约0. 01mg/kg至约 500mg/kg，或约 0. lmg/kg 至约 200mg/kg，或约 lmg/kg 至约 100mg/kg，或约 10mg/kg 至约 50mg/kg。然而，剂型也可根据患者的需求、治疗的疾病的严重性以及所采用的化合物而变化。例如，可考虑特定患者所诊断的癌症类型和阶段，根据经验决定剂量。就本发明而言，给予患者的剂量在一段时间后，应足以产生有益治疗反应。剂量范围将取决于特定患者中与给予特定载体或转导细胞类型相伴的任何不良副作用的存在、性质和程度。医师懂得如何决定用于具体情况的合适剂量。通常，用小于该化合物最优剂量的较小剂量开始治疗。之后，以较小振幅提高剂量，直至在相应条件下达到最佳效果。为简便起见，如果需要，可将总的日剂量分开并在一天内分次给予。用于本发明的药物制品(例如，N-钙粘蛋白siRNA、N-钙粘蛋白抗体、N-钙粘蛋白疫苗、N-钙粘蛋白抑制剂和免疫偶联物)通常被递送给哺乳动物，包括人和其他非人哺乳动物。用本发明方法治疗的非人哺乳动物包括家养动物(即狗类、猫类、鼠类、啮齿动物类、和兔类)以及农业动物(牛、马、羊、猪)。
实施例提供以下实施例，以说明而非限制要求保护的本发明。实施例1 采用TAL作为阴性对照的NF κ β受体实验。如图2-3所示，在稳定表达N-钙粘蛋白的细胞中NFk β受体活性提高。在充满和耗尽雄激素的介质中均如此。还显示，由于LNCaP-Cl表达的N-钙粘蛋白多于C2和C3， NFK β活性与N-钙粘蛋白表达的量相关。实施例2如图4-5所示，N-钙粘蛋白在LNCaP-Cl细胞的细胞表面表达，这些细胞具有较高量的NFk β表达，但NF κ β被激活，如Cl细胞中的强核信号所示。对照细胞也表达 NFK β，但主要定位在胞质。
23
实施例3图6-7显示N-钙粘蛋白对NF κ β的活化显示出NFk β靶基因TGF β、IL-6、IL-8 和bcl-2的上调。实施例4如图8所示，敲减(knockdown)N-钙粘蛋白造成NF κ β靶基因如IL-6和IL-8表达降低，再次显示N-钙粘蛋白调节NF κ β。实施例5图9显示了用N-钙粘蛋白靶向抗体处理前后的NF κ β启动子活性。数据显示了这些抗体介导NFk β的立即上调，随后在第7天发生下调。这些数据显示，抗体可部分通过改变NF κ β下游信号转导发挥作用。实施例6图10显示了用或未用N-钙粘蛋白靶向抗体处理的N-钙粘蛋白的染色。在对照处理细胞中，大多数N-钙粘蛋白出现在胞内；而存在抗体时，N-钙粘蛋白表达稳定于细胞表面。这些数据提示，将N-钙粘蛋白稳定在细胞表面是N-钙粘蛋白抗体的另一种作用机制。这可能导致由金属肽酶(如ADAM 10等)切割和内在化N-钙粘蛋白介导的β-连环蛋白信号传导的改变。实施例7如图11可见，N-钙粘蛋白下调可造成PII/Akt信号传导途径活化降低。实施例8如图12可见，用N-钙粘蛋白靶向抗体处理细胞造成Akt磷酸化作用或活化作用改变(上调和下调)，这支持了这些抗体全部或部分通过改变PII-Akt信号转导发挥作用的观点。实施例9 :FACS分析显示了靶向N-钙粘蛋白第一胞外结构域的抗体克隆的筛选。图13显示了前列腺癌细胞表面蛋白质的识别。实施例10 :FACS分析显示了靶向N-钙粘蛋白第四胞外结构域的抗体克隆的筛选。图14显示，克隆识别前列腺癌细胞表面的N-钙粘蛋白。实施例11 :N-钙粘蛋白抗体的亚克隆。图15显示，纯化的单克隆识别细胞表面的蛋白质。实施例12 体外侵袭试验。图16显示，由发明人小组产生的单克隆抗体1F12、1H7和2B3都抑制N-钙粘蛋白阳性癌细胞的侵袭力。GC4是对照。实施例13 :N-钙粘蛋白抗体阻断肿瘤生长和PC3前列腺癌细胞的转移，但对N-钙粘蛋白空白肿瘤无效。皮下植入PC3细胞并使其生长。如图17b所示，当第15天肿瘤达到可触阶段时给予抗体或对照，每周两次O00微克)，共两周。1H7和EC4都能够减缓肿瘤生长。它们还完全阻断转移。5/5的对照小鼠具有淋巴结转移，相比之下，1H7和EC4治疗小鼠分别为0/5 和0/5。相反，1H7和EC4抗体对N-钙粘蛋白空白肿瘤的生长没有影响(图17a)。图17c 和17d清楚显示了在处理建立的大肿瘤(从第21天开始处理)或在长期处理(处理持续长达62天)中N-钙粘蛋白抗体对PC3肿瘤生长的抑制作用。
实施例14 来自体内实验的肿瘤显示出抗体对N-钙粘蛋白的影响。如图18所示，两种对照肿瘤颜色非常红，与深层血管发生一致。它们还深深附于并侵入局部侧面肌肉组织。相反，1H7和EC4处理的小鼠具有不侵入局部肌肉的苍白、清澈的肿瘤。肿瘤容易从下层组织脱落，证明抗-N-钙粘蛋白抗体抑制了血管发生并阻断局部侵袭，这与未患转移性疾病的小鼠中发现的结果一致。实施例15 免疫组织化学染色发明人对雄激素非依赖性LAPC 9前列腺癌进行了免疫组织化学染色。结果显示， 仅有一小亚群细胞表达N-钙粘蛋白(图19a)。实施例16 雄激素依赖性和非依赖性LAPC-9肿瘤生长为确定即便当N-钙粘蛋白在细胞内未过表达或者仅在细胞亚群内表达时，N-钙粘蛋白是否能够成为治疗和诊断靶点，发明人研究了雄激素依赖性和非依赖性LAPC-9肿瘤的肿瘤生长。分别用对照PBS或N-钙粘蛋白抗体1H7和EC4处理雄激素依赖性和非依赖性LAPC-9肿瘤。结果显示，即便N-钙粘蛋白仅在一小亚群雄激素非依赖性细胞中表达， 用抗体处理也足以延迟雄激素非依赖性肿瘤的生长和发展(图20)。这些结果提示，雄激素非依赖性肿瘤的形成需要N-钙粘蛋白细胞群，将其阻断足以延迟肿瘤发展。这些结果与 N-钙粘蛋白标记雄激素非依赖性干细胞群的解释一致。阻断干细胞生长足以阻断肿瘤生长。这些结果还显示，抗体可作用于表达正常水平或者甚至低水平N-钙粘蛋白的细胞。实施例17 分选和未分选的N-钙粘蛋白阳性和阴性肿瘤细胞生长为确定N-钙粘蛋白阳性细胞对肿瘤细胞生长的影响，分选了 N-钙粘蛋白阳性和阴性细胞，分别得到了 100%和0%阳性的N-钙粘蛋白细胞群。然后将细胞注入阉割小鼠， 相比N-钙粘蛋白阴性群体，N-钙粘蛋白阳性细胞更加快且有效地形成肿瘤(图20)，这说明N-钙粘蛋白阳性细胞具有生长优势，或者它们具有干细胞特性且致瘤性强于阴性群体。 未分选的细胞的生长类似于N-钙粘蛋白阳性细胞。实施例18 来自N-钙粘蛋白分选细胞的肿瘤的FACS分析FACS分析比较由纯N-钙粘蛋白阳性和阴性细胞生长的肿瘤和对照未分选群体生长的肿瘤。来自100%N-钙粘蛋白阳性细胞的肿瘤的N-钙粘蛋白阳性率只有41. 25% (图 21和22)，说明这些细胞变成了 N-钙粘蛋白空白细胞。这与N-钙粘蛋白阳性细胞是可变成分化程度更高的N-钙粘蛋白阴性细胞的干细胞的假设一致。同时，N-钙粘蛋白阴性群体产生的肿瘤有9% N-钙粘蛋白阳性(图21和22)，与未分选的细胞类似(图21和22)。 这说明这些细胞的生长要求干细胞样群体获得或上调N-钙粘蛋白以形成雄激素非依赖性肿瘤。使N-钙粘蛋白形成雄激素非依赖性肿瘤的需要导致了致瘤性的延迟。实施例19 建立的LNCaP-Cl肿瘤的生长被N-钙粘蛋白抗体抑制。如图23可见，在第45天到第56天将N-钙粘蛋白抗体1H7和EC4给予携带 LNCaP-Cl肿瘤的小鼠，它们对肿瘤生长的抑制效应在第72天出现。实施例20 =N-钙粘蛋白抗体抑制LAPC-9雄激素非依赖性肿瘤生长。如图2 可见，从第15天开始将N-钙粘蛋白抗体1H7和EC4给予携带建立的 LAPC-9雄激素非依赖性肿瘤的小鼠(第7代)，每周两次，10mg/kgo抑制效应出现在第30 天。1H7和EC4对建立的大LAPC-9雄激素非依赖性肿瘤的抑制效应示于图Mb，其中，直到第17天时动物未接受抗体处理。
实施例21 :EC4抗体的剂量依赖性生长抑制如图25可见，PC3肿瘤在裸鼠体内的生长受到EC4抗体的抑制(在第13天到第 27天给予)，在给予较高剂量抗体的实验中观察到更突出的抑制效果。实施例22:毒性研究由于N-钙粘蛋白在各种组织内广泛表达，如果将抗-N-钙粘蛋白抗体用作治疗剂应考虑其潜在毒性。本发明的发明人发现，1H7和EC4抗体与鼠N-钙粘蛋白交叉反应性，但在长期或剂量递增小鼠研究中未观察到体内毒性。实施例23 =N-钙粘蛋白抗体抑制LAPC-9雄激素依赖性肿瘤发展成雄激素非依赖性肿瘤。如图26a和26b所示，在阉割小鼠中，N-钙粘蛋白抗体1H7和EC4有效抑制LAPC-9 雄激素依赖性肿瘤向雄激素非依赖性肿瘤发展。在第一项研究中(图^a)，从第0天到第 31天给予抗体，观察动物45天。在第二项研究中(图26b)，观察了长期抗体治疗的效果。 1H7对肿瘤发展显示出中等延迟，而EC4对阻断肿瘤发展显示出更加长期的效果。实施例M :N-钙粘蛋白阳性细胞在阉割小鼠中具有生长优势。如图27所示，在阉割过的SCID小鼠中，N-钙粘蛋白阳性LAPC-9肿瘤显示出超过 N-钙粘蛋白阴性LAPC-9肿瘤的生长优势。另一方面，图观显示，LAPC-9雄激素非依赖性细胞中N-钙粘蛋白表达水平和雄激素受体表达之间负相关，在连续传代的同时，LAPC-9细胞发展到获得雄激素非依赖性，同时它们对N-钙粘蛋白的表达增加而对雄激素受体的表达降低。本申请中引用的所有专利、专利申请和其他出版物，包括GenBank登录号，全部纳入本文用于所有目的。
2权利要求
1.一种以ATCC登录号PTA-9387保藏的杂交瘤细胞系。
2.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞系产生的抗体。
3.一种以ATCC登录号PTA-9388保藏的杂交瘤细胞系。
4.一种由权利要求4所述杂交瘤细胞系产生的抗体。
5.一种抗体或其片段，其能够在体内或体外结合与以ATCC登录号PTA-9387保藏于美国模式培养物保藏所的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体结合的N-钙粘蛋白抗原决定簇相同的N-钙粘蛋白结构域1-3。
6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体是人源化的或完全的人抗体。
7.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体是双特异性抗体或scFv。
8.一种抗体或其片段，其能够在体内或体外结合与以ATCC登录号PTA-9388保藏于美国模式培养物保藏所的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体结合的N-钙粘蛋白抗原决定簇相同的N-钙粘蛋白结构域4。
9.如权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述抗体是人源化的或完全的人抗体。
10.如权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述抗体是双特异性抗体或scFv。
11.一种抑制患者体内癌细胞生长的方法，所述方法包括以下步骤在足以使得如权利要求5或8所述抗体或其片段与所述癌细胞结合的条件下，给予该抗体或其片段，其中所述癌细胞表达或过表达N-钙粘蛋白，且其中所述抗体通过以下途径抑制癌细胞生长(a)激活或抑制NFk- β信号传导和转录；(b)激活或抑制N-钙粘蛋白内在化；(c)激活或抑制PI3激酶或Akt途径；(d)激活或抑制连环蛋白信号传导；(e)阻断N-钙粘蛋白与FGFR或其他酪氨酸激酶受体的异二聚化；或(f)阻断或增强被ADAMlO或其他金属肽酶切割。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述癌细胞是泌尿生殖器癌细胞。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述癌细胞是前列腺癌细胞。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述癌细胞是膀胱癌细胞。
15.一种治疗癌症患者的方法，包括以下步骤(a)从有患上表达N-钙粘蛋白的癌症的风险的个体获得测试组织样品；(b)与获自己知为癌症阴性的个体的对照组织样品相比，确定测试组织样品中N-钙粘蛋白的存在与否或含量；从而诊断所述表达N-钙粘蛋白的癌症，其中所述N-钙粘蛋白以正常或低水平表达，或由细胞亚群表达，或是过表达的；和(c)给予有患上表达N-钙粘蛋白的癌症的风险的个体有效量的如权利要求5或8所述的抗体或片段。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述组织样品是前列腺或膀胱组织。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述癌症是前列腺癌。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述癌症是膀胱癌。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体阻断激素难治性前列腺癌。
20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体阻断癌症干细胞。
21.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述组织样品是前列腺或膀胱组织。
22.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述癌症是转移癌。
23.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
24.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体是scFv。
25.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗体是双特异性抗体。
26.—种诊断癌症患者的方法，包括以下步骤(a)从有患上表达N-钙粘蛋白的癌症的风险的个体获得测试组织样品；(b)与获自己知为癌症阴性的个体的对照组织样品相比，通过使样品接触有效量的如权利要求5或8所述的N-钙粘蛋白抗体或片段来确定测试组织样品中N-钙粘蛋白的存在与否或含量；从而诊断所述表达N-钙粘蛋白的癌症，其中所述N-钙粘蛋白以正常或低水平表达，或由细胞亚群表达，或是过表达的。
27.一种鉴定癌症干细胞的方法，包括以下步骤(a)从有患上表达N-钙粘蛋白的癌症的风险的个体获得测试组织样品；(b)与获自已知为癌症阴性的个体的对照组织样品相比，采用权利要求5或8所述的抗体确定测试组织样品中癌症干细胞的存在与否；其中所述N-钙粘蛋白以正常或低水平表达，或由干细胞亚群表达且不是过表达的。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述组织样品是前列腺或膀胱组织。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述癌症是前列腺癌。
30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述癌症是膀胱癌。
31.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述癌症是激素难治性前列腺癌。
32.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述癌症是转移癌。
33.一种鉴定抗-N-钙粘蛋白抗体或抑制患者体内癌细胞生长的化合物的方法，所述方法包括以下步骤(i)使所述化合物或抗体接触表达或过表达N-钙粘蛋白多肽的细胞；和 ( )通过确定所述化合物或抗体是否具有以下作用来确定所述化合物或抗体对N-钙粘蛋白多肽的功能效应(a)激活或抑制NFκ-β信号传导和转录；(b)激活或抑制N-钙粘蛋白内在化；(c)激活或抑制PI3激酶或Akt途径；(d)激活或抑制连环蛋白信号传导；(e)阻断N-钙粘蛋白与FGFR或其他酪氨酸激酶受体的异二聚化；或(f)阻断或增强被ADAMlO或其他金属肽酶切割。
全文摘要
本发明提供了靶向N-钙粘蛋白第一到第三结构域和N-钙粘蛋白第四结构域的抗体，以诊断和治疗N-钙粘蛋白相关癌症。还描述了利用这些抗体进行诊断和治疗的方法。
文档编号C12N5/00GK102164956SQ200980121811
公开日2011年8月24日 申请日期2009年4月3日 优先权日2008年11月10日
发明者R·E·赖特尔, Z·韦恩伯格 申请人:加利福尼亚大学董事会