新的益生长双歧杆菌的制作方法
专利名称：新的益生长双歧杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)益生抗炎菌株，其用于预 防、减轻或治疗疾病以及用于制备人类或宠物食品的用途，或药物组合物。此外，本发明涉 及由所述菌株获得的细菌多糖、其用于治疗疾病的用途、以及包含该多糖的药物组合物。
背景技术：
乳酸菌已经长时间知晓发酵糖产生酸尤其是主要的新陈代谢组分乳酸的细菌。此类细菌 可以在牛奶或乳品、活着的或腐败植物中发现，也可以在人类和动物肠道中发现。传统上， 这类细菌被称为“乳酸菌”。乳酸菌指发酵糖产生酸(包括乳酸)的革兰氏阳性、无运动微 需氧或厌氧细菌的相当异种的一类，乳酸菌包括，例如，双歧杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属、 乳球菌属、明串珠菌属和片球菌属。几个世纪以来，乳酸菌已用于制备食品和饲料产品，包括大部分乳制品，现在，乳 酸菌在制备所有发酵乳品例如酸奶、发酵全脂牛奶、乳冻食品(junket)、乳酪和黄油中是必 不可少的。大量记载各种乳酸菌有益影响人类和/或动物健康的报道的发表吸引了对这类 细菌进一步的兴趣。尤其是，发现乳杆菌属或双歧杆菌属的特定菌株能够在肠粘膜集群，并 辅助维持宿主健康。这类细菌通常被称为益生菌或益生菌剂。益生菌益生微生物已经被定义为“在足量施用时赋予宿主健康益处的活的微生物”(FAO/ WHO 2002)。尽管已经鉴别很多益生菌(尤其是乳杆菌属或双歧杆菌属菌株)，然而大量的研 究也表明参考其系统分类并不能准确地预测益生菌。而相反地，每一菌株应当分别评价。研 究也表明即使是密切相关的益生菌也可能对健康产生相当不同的影响。然而，清楚的是，大部分鉴别的益生菌除了其健康有益效果之外，具有一些额外的 特征。抗胆汁酸通常认为，益生菌剂发挥其对肠道上皮的有益效果的先决条件是足量的活益生菌 存在。进入肠上部后，益生菌接触高水平的胆汁盐。因此，最重要的是益生菌抗胆汁酸。肠屏障功能肠屏障功能在粘膜与外界的交界处调节运输和宿主防御机制。细胞间和旁细胞流 受到膜泵、离子通道和紧密联结的严密调控，调节渗透性至生理需求。任何水平的干扰、特 别是由于增加渗透性引起的细菌易位和由于受损上皮细胞和T细胞相互作用引起的口腔 耐受性破坏，可以导致炎症和组织损伤。上皮屏障抑制诸如LPS及其他炎性化合物的高分子量物质从肠腔侧进入循环系统。
紧密联结引起该上皮屏障的功能之一。紧密联结或闭合带是膜连接在一起形成对 液体实质上的非渗透屏障的两个上皮细胞的紧密结合区域，其将血管系统与消化道腔相分 离。因此，已经证明，降低所述紧密联结屏障功能导致不需要的物质诸如LPS由肠腔进入循 环系统的侵入增加。相反地，预期诱导紧密联结屏障功能引起不需要的物质诸如LPS的侵 入减少。胞外多糖和生物膜形成尽管存活对于粘附和集群能力(即生物膜形成)是重要的，但是它也被认为是益 生菌发挥它的有益效果所需的一个重要的促成因素，无论它是通过免疫调节、病原体排除 或与粘膜的接触增强(1)。很多细菌在生物膜发生中的重要特征是粘液样物质，已知为胞外多糖(EPQ或胞 外基质。胞外多糖是包括乳杆菌属和双歧杆菌的很多细菌表面上存在的胞外聚合物O)。 EPS形成粘液层，其松弛地附着于细胞表面或分泌到环境中(3)。通过比较非EPS产生菌和EPS产生菌等基因变体研究了这些分子的生理功能。表 明细胞结合EPS保护细菌抵御噬菌体和细胞壁降解酶⑷。最近，Mao等人发现，由大肠杆 菌菌株产生的胞外多糖增强该菌在模拟胃肠流体中的存活(5)。这些发现表明，某些细菌产 生的胞外多糖事实上可能对于它们在肠中生存是必不可少的。可用于乳业制备诸如酸奶的发酵乳品的菌株很重要的技术特征是其在发酵乳品 的流变学和质地改善中的用途(30)。在很大程度上菌株的结构特征与EPS的产生相关 (30)。尽管这是重要的技术特征，EPS很可能由于其特定的化学结构对接受者产生有益的 健康效果。已经显示，乳酸菌所产生的一些种类的EPS对于人类健康具有有益效果，例如降 低胆固醇的能力(6)、免疫调节活性(7 ;8)、对胃肠粘液的微生物粘附(9;10)、抗氧化剂和 自由基清除活性(11)以及益生(双歧(bifidogenic))作用(12)。近来，已经表明，产生高水平EPS的德氏乳杆菌(LactcAacillus delbrueckii)显 著降低结肠炎的鼠模型中炎症的严重性(1 。因此，看起来清楚的是高产量特定EPS可能 与益生菌的免疫调节作用有关。涉及肠微生物群的胃肠并发症炎症是先天免疫系统的复杂反应，涉及在侵染、毒素暴露或细胞伤害位点处的白 细胞和血浆蛋白质的累积和活化。尽管炎症在控制感染和促进组织修复中起到防护功能， 其也会引起组织损伤和疾病。胃肠机能紊乱诸如炎症性肠病(克罗恩病)、溃疡性结肠炎和 过敏性肠综合征是自发性炎症。涉及胃肠炎症的其它疾病为隐窝炎、食物过敏、和食物过敏 引起的异位性皮炎(14-16)。克罗恩病和溃疡性结肠炎在北欧、英国和北美洲最为流行，其中每100，000达500 人受影响。虽然这些疾病具有不同的病因学，但均涉及机能紊乱的粘膜免疫系统对土著菌 群及其他腔抗原的不当响应(6)。这些紊乱的急性治疗依赖于抗生素和抗炎药，而在严重病 例中，手术则是必要的。长期的治疗包括生活方式改变、饮食调整和停止吸烟(7)。已经表 明益生菌通过对胃肠上皮和粘膜免疫系统发挥正效应而延长免于这些病症(8)。过敏性肠综合征(IBS)影响7-31%的已经克服由于沙门氏菌属、弯曲杆菌属或志 贺氏菌属感染导致的感染性胃肠炎患者。具有腹泻但不具有感染性起始的IBS可以在经历
4“不利”生活事件的个体中发生(17)。尽管临床试验表明在IBS中益生菌的效力变化大，但 是双盲安慰剂对照研究已经表明，某些益生菌的混合物可对IBS具有有益效果(18-20)，因 此突出了识别新的益生菌的重要性。益生菌剂的免疫调节效应已经表明，益生菌具有减轻具有胃肠炎性并发症如克罗恩病和溃疡性结肠炎的患 者症状的能力01;22)。具体地说，双歧杆菌已经被描述为在胃肠疾病的预防和治疗中具 有潜力的益生菌，如 EP 1 688481、EP 0 199535、EP 0 768 375、WO 97/00078、EP 0 577 903 和 WO 00/53200 所述。EP 0 768 375 (Nestle SA)描述了双歧杆菌属的具体菌株，其能够埋入肠内菌丛 并能够竞争性地排除病原菌粘着至肠细胞。据报道，这些双歧杆菌帮助免疫调节并因此帮 助个体健康的维持。双歧杆菌的免疫调节效应甚至可赋予未出生的儿童。WO 01/97822例 如描述了通过母亲摄入动物双歧杆菌属(Bifidobacterium animal is)菌株BB-12 ,减少 了儿童中特应性疾病的发生。此外，WO 03/099037 (Nestec SA)描述了动物双歧杆菌属菌 株BB-12 能够有利地调节免疫反应。尽管已经描述了相当多的具有抗炎性质的双歧杆菌属菌株，但只有少数菌株已经 被报道在体内有效治疗实验诱导的肠炎。W004052462A1 (B. Pot, Danisco A/S)描述了某些两歧双歧杆菌和乳双歧杆菌 (Bifidobacterium lactis)菌株能够在结肠炎的实验鼠模型中减少炎症的严重性。W02007/09369A1 (Nestec SA)描述了长双歧杆菌菌株 BL999 (ATCCBAA-999)在结 肠炎的实验鼠模型中减少炎症的严重性。EP 1688481 和EP 1141235B(University College of Cork)描述了婴儿长双歧杆 菌菌株UCC356M在结肠炎的鼠模型中减少炎症的严重性。Foligne等Q007)描述了在结肠炎的实验鼠模型中减少炎症严重性的三种双歧 杆菌。然而，这些文件对于EPS产生、菌株的EPS组成、紧密联结的强度都并未描述，并 且，除了 EP1688481之外，对于双歧杆菌属菌株的胆汁酸抗性也没有描述。由于即使是密切相关的益生菌也对健康产生颇为不同而特定的效应，因此对新的 益生菌存在持续的需求，包括能够调理炎性肠疾病、抗胆汁酸和由于高水平的EPS而能够 集群于肠的新的抗炎双歧杆菌属菌株。发明概述本发明出乎意料地发现特定长双歧杆菌菌株综合了胆汁抗性、改善肠屏障功能 和体内大量产生具有优异抗炎性的胞外多糖这些重要的益生特征。特别地，本发明人出乎意料地鉴别了长双歧杆菌的一个特定益生菌株，即长双歧 杆菌DSM 21062，其综合了所有上述重要的益生特征。预期直接来源于该益生菌的菌株很可能保持其益生特征。因此，在第一方面，本发明涉及长双歧杆菌细菌细胞的菌株，其可用于益生菌剂， 耐受胆汁盐，产生高量的胞外多糖(EPS)，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎模 型中具有抗炎效应，其特征在于所述菌株为登记号DSM 21062的长双歧杆菌菌株或其突变 株，其中所述突变株通过使用保藏菌株作为起始材料获得，并且其中所述突变株具有保留的或进一步改善的表征DSM 21062的抗炎效应、胆汁耐受性和/或EPS表达。如在实施例中表明，长双歧杆菌DSM 21062菌株在体内具有一些非凡的免疫调节 性能，表明其可以有效防御多种疾病。因此，在第二方面，本发明涉及包含长双歧杆菌DSM 21062细菌细胞或其突变株的组合物用于制备药物的用途。特别地，所述菌株可用于制备治疗哺乳动物胃肠道炎性病症的药物。许多益生菌剂用于制备食品或饲料产品；因此，本发明的另一重要方面是提供包 含长双歧杆菌DSM 21062或其突变株的人类或宠物食物组合物。当制备所述食品或饲料产品时，制造商通常使用用于加工食品和饲料产品的所谓 的起子培养物。起子培养物广泛用于乳品业。一般地，起子培养物给予各种食品或饲料产 品特定的特征。沿用已久的事实是稠度、质地、主体和口感与用于制备所述食品或饲料的起 子培养物的EPS产生强烈地相关。因此，本发明的另一方面是包含长双歧杆菌DSM 21062 或其突变株的起子培养物组合物，优选地其中所述起子培养物组合物具有以下浓度的活细 胞，所述浓度的范围为每克所述组合物IO4至1012CFU。本发明也设计一种制备食品或饲料产品的方法，所述方法包括向食品或饲料产 品起始材料添加包含长双歧杆菌DSM 21062或其突变株的起子培养物组合物，并将由此接 种的起始材料保持在所述乳酸菌代谢活跃的条件下。由实施例可见，长双歧杆菌DSM 21062不仅产生高量的胞外多糖，也产生相当不 常见类型的EPS，该EPS通常富含甘露糖和葡萄糖残基。众所周知，一些类型的EPS涉及对人类健康的特定效应(6)、(9 ； 10)、(11)、(12)。 因此，本申请考虑，长双歧杆菌DSM 21062EPS异常结构可能参与甚至负责由该菌株产生的 独特免疫调节效果。因此，另一个方面，本发明涉及由长双歧杆菌DSM 21062或其突变株分 离的多糖。包含所述长双歧杆菌DSM 21062或其突变株的多糖的药物组合物也是本发明的
一方面。进一步考虑，长双歧杆菌DSM 21062的EPS的独特结构可能通常涉及炎性疾病。先 前表明，当施用于哺乳动物时，含有甘露糖的复杂聚合物(甘露聚糖)具有显著的生物学活 性。因此，在本发明的一方面，长双歧杆菌DSM 21062细胞或所述细胞的部分通常用于治疗 炎性疾病。特别地，本发明涉及一种治疗炎性疾病的方法，其特征在于向需要治疗的人施用 有效量的包含多糖的组合物，所述组合物包含获得自DSM 21062或DSM 21062的突变株的 EPS。定义在讨论本发明的详细实施方案之前，提供与本发明的主要方面相关的特定术语的定义。本文中所用的术语“胞外多糖”指高分子量聚合物，其由通过微生物分泌到周围环 境中的糖残基组成。表达“益生菌剂(probiotics或probioticum)指的是包含益生微生物的组合物。 益生菌定义为对宿主的卫生和健康具有有益效果的微生物细胞。益生微生物已经被定义为 “在足量施用时赋予宿主健康益处的活的微生物”(FA0/WH0 2002)。表达“益生元”指增加肠内益生菌的数量的组合物或组合物的组分。因此，益生元 指任何由土著菌在结肠中特别发酵的任何非活的食品组分，认为其具有积极价值，例如，双
6歧杆菌属，乳杆菌属。联合施用益生菌与一种或多种益生化合物可以提高施用的益生菌剂 在体内的生长，产生更加显著的健康益处，称为协同益生(symbiotic)。表达“相对富含甘露糖残基的EPS”指其中甘露糖是存在的至少第二最丰富种类的 单糖的EPS。表达““Glu-N 甘露糖比”指葡糖胺(Glu-N)和甘露糖的量之间的比。表达“相对富含葡萄糖残基的EPS”指其中葡萄糖是存在的最丰富种类的单糖的 EPS。表达““Glu-N 葡萄糖比”指葡糖胺(Glu-N)和葡萄糖的量之间的比。仅通过例举的方式，如下描述本发明的实施方案发明详述本发明旨在鉴别一种新的益生菌株，其可用于预防、减轻或治疗与炎症、尤其是肠 炎相关的紊乱、病症或疾病。这里，我们第一次描述了益生长双歧杆菌菌株，其特征在于耐受胆汁盐，产生大 量胞外多糖(EPS)，加强体外上皮细胞的紧密联结，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBQ诱导的 结肠炎模型中具有抗炎效应。在本发明的优选实施方案中，所述长双歧杆菌菌株是长双歧杆菌菌株(DSM 21062)。根据国际承认用于专利程序的布达佩斯条约，所述益生长双歧杆菌菌株DSM 21062 于 2008 年 1 月 23 日保藏于德国 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)Inhoffenstra β e 7B,38124 Braunschweig。实施例1表明长双歧杆菌菌株(DSM 21062)能够在实验结肠炎小鼠模型中预防 炎症。从
图1可见，长双歧杆菌菌株(DSM 21062)对TNBS诱导的结肠炎的防护效应明 显好于其它测试菌株的效应。用DSM 21062处理的小鼠的宏观炎症分数(macroscopic inflammation score) (Wallace分数)为2. 85+/-0. 52，而该分数高于其它菌株(菌株9555 3. 5+/-0. 53 ；菌株 9553 :3. 55+/-0. 58，菌株8773 :4. 75+/-0. 77，菌株 8818 :4. 0+/-0. 58)。 TNBS参照的平均Wallace分数为5. 15+/-0. 62，而防护的阳性对照(泼尼松龙)为高度防 护性的，平均Wallace分数为2. 35+/-0. 31。在健康小鼠中没有检测到炎症迹象(Wallace 分数0. 5赋予所有乙醇-处理的小鼠)。Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TEER)使得能够测量与紧密联结破坏相关的旁细 胞离子流变化(Velarde et al. (1999) Toxicology in Vitro 13，723-727)，因此该测定可 用于定量益生菌对紧密联结的保护效应。在实施例6中，表明长双歧杆菌菌株(DSM 21062) 在其响应于紧密联结破坏性癸酸钠(ClO)时减少Caco-2细胞层跨上皮电阻(TEER)降低的 能力优于其它益生菌。不囿于理论，我们预期紧密联结强度与肠屏障功能和肠上皮的紧致 度正相关，因此可能当采用小鼠(TNBS)诱导的结肠炎模型时与上皮的响应相关。所述长双歧杆菌菌株(DSM 21062)在所述研究中进一步产生与其它菌株相比大 量的EPS。DSM 21062在实施例2所描述获得的并通过HPLC在PAlO柱(高pH阴离子交换 色谱法)测量的EPS提取物中产生至少3mg/ml，诸如超过5mg/ml，或者甚至7mg/ml或更多。然而，EPS的量和实际组成对于其功能皆是重要的。先前表明，当施用于哺乳动物 时，含有甘露糖的复杂聚合物(甘露聚糖)具有显著的生物学活性。这包括活化免疫系统，然后将甘露糖结合于识别分子例如在巨噬细胞和树突细胞上表达的甘露糖受体(CD206) (23-25)。近来已经表明甘露糖受体为新疫苗的靶标，不仅用于使免疫防御针对癌症和传染 病，也用于在自身免疫性疾病的治疗中特异性诱导耐受性06)。肠树突细胞(DC)被认为取 样并呈递共生菌至肠相关免疫系统07)并表明具有高含量甘露糖的EPS能够调节对肠微 生物群落的免疫反应。已经表明来自真菌的EPS具有免疫刺激和抗肿瘤效应，并且来自这 些真菌的EPS含有甘露糖08 ；29)。就我们所知，尚未教导真菌EPS选择其免疫刺激效应 的机制是通过与甘露糖结合受体的相互作用，我们考虑，情况正是如此。因此，认为本发明 长双歧杆菌菌株(DSM 21062)的重要特征在于其产生相对富含甘露糖残基的EPS，例如测 得Glu-N 甘露糖比为40或更高，例如超过50甚至60或更高。如表II所表明的，甘露糖 残基的绝对量也显著高于其它研究的细菌。而且，分析DSM 21062产生的EPS显示其还出 乎意料地富含葡萄糖残基。所述菌株产生相对富含葡萄糖残基的EPS，例如，测得Glu-N 葡萄糖比为50以上，例如超过100，或者甚至180以上。葡萄糖残基的绝对量也出乎意料地 尚ο这显示所述长双歧杆菌菌株(DSM2106》产生具有独特的化学组成的EPS。预 期这些独特的EPS至少部分负责所述菌株的有益效果，因此从所述长双歧杆菌菌株(DSM 21062)或其突变分离的多糖可用于配制包含所述多糖的益生元或药物组合物，其可用于预 防、减轻或治疗各种炎性疾病或病症。正如所述，所述菌株EPS的甘露糖残基的高量和葡萄 糖残基的量被认为是显著的。我们相信，特别是分离自菌株DSM 21062(或其突变体)并相 对富含甘露糖和葡萄糖残基的多糖制备物将证明特别地有效。然而，任何这里提及的包含 任一所述多糖的益生元或药物组合物为本发明的一种实施方案。如实施例4表明，所述长双歧杆菌菌株(DSM 2106 进一步能够抑制致病菌株的 生长。该实施例表明该菌株能够抑制选自以下的菌株单核细胞增多性利斯特菌、沙门氏菌 SSP、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。值得注意的是，长双歧杆菌菌株(DSM2106》能够抑制致病菌株的生长，因为产生 除了有机酸之外的抗微生物物质对于双歧杆菌属菌株而言是罕有的。只分离了少数能够产 生过氧化氢和热稳定蛋白质抗菌化合物的菌株(30)。EP1688481 (Univ. College of Cork) 描述了一种具有抗微生物活性的婴儿长双歧杆菌。该菌株的抗微生物活性可能是由于产生 了乙酸和乳酸，因为进行的测定不涉及PH调节。我们已经开发了评价来自益生菌株长双歧 杆菌 DSM 21062、CHCC9555、CHCC9553、CHCC8773 和 CHCC8818 的 pH 调节条件培养基的抗微 生物活性的测定。在该测定中，长双歧杆菌DSM 21062在抑制病原体生长上明显优异，该效 应与EP 168848中描述的婴儿长双歧杆菌菌株相反，不是由于产生乙酸或乳酸，该测定表 明长双歧杆菌DSM 21062通过独特的机制发挥其抗微生物效应。TNBS诱导的结肠炎导致小鼠重量显著损失，这可以通过DSM 21062抵消至一定程 度，但不能通过其它细菌处理实现。因此，在一实施方案中，本发明的菌株特征在于，接受所述菌株的动物经历的由于 TNBS诱导的结肠炎引起的重量损失显著小于(在ρ = 0. 1水平)接受对照菌株的动物的重
量损失。由上清楚的是DSM 21062可以用于制备药物。实施例1表明，DSM 21062可用于 制备治疗哺乳动物胃肠道炎性病症的药物。人体胃肠道炎症的实例包括过敏性肠综合征(IBS)、炎症性肠病(IBD)、脂泻病(乳糖不耐受)、克罗恩病、间质性膀胱炎、酸性肠综合征、 胃炎、溃疡性结肠炎、痢疾、斑疹伤寒症和与食物过敏相关的肠炎。在本发明的一实施方案 中，DSM 21062用于制备预防、减轻或治疗任何这些病症的药物。在另一方面，本发明涉及包含DSM 21062或其突变株的人类或宠物食物组合物。 优选，所述细菌可以作为添加剂施用至正常的饮食或者作为营养完全人类或宠物食物的组 分。剂型可以是液体或固体。在后一情况下，所述产品可以粉末化并形成片剂、颗粒或胶囊， 或者简单与其它食物组分混合，形成功能性食品。本发明的食品组合物可以是使用DSM 21062或其突变株产生的任何可摄取的材 料，选自乳、凝乳、乳基发酵产品、酸化乳、酸奶、冷冻酸奶、奶粉、乳基粉末、乳浓缩物、乳酪、 涂抹干酪、调味品、饮料、冰淇淋、发酵的基于谷物的产品、婴儿配方、片剂、液体细菌悬液、 干口服添加剂、湿口服添加剂、干管道饲喂或湿管道饲喂。在进一步的实施方案中，所述组合物进一步包含药学可接受载体。本文中所用的 术语“药学可接受载体”是指适于施用于人类或动物并且与所述益生活性有机体相容的一 种或多种固体或液体填充稀释剂或囊化物质。术语“相容的”涉及能够与DSM 21062或其 突变株混合的药物组合物组分，混合的方式使得在正常使用条件下没有会实质上降低选择 用于本发明的有机体的益生效能的相互作用。药学可接受载体必须具有足够高的纯度，并 且足够低的毒性，使得其适于施用于被处理的人类和动物。本文中所述的固体组合物优选为片剂、胶囊或颗粒(包括许多颗粒)。优选所述 固体组合物为口服剂型。常规配制技术的综述可以在例如“!"he Theory and Practice of Industrial Wiarmacy”中找到(31)或(32)。因此，所述片剂可以通过本领域已知的方法 制备，并且可以是压缩的、肠包衣的、糖包衣的、膜包衣的、或多次压缩的，含有适宜的粘合 剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂、着色剂、粉末化剂、流动-产生剂和熔化剂。具有液体或固体内 含物的胶囊(软胶囊和硬胶囊)可以根据制药工业公知的常规技术进行制备。作为一个实 例，可以使用适宜的填充机将益生活性有机体填充至明胶胶囊中。本文中所述的固体组合 物也可以是丸。所述人类或宠物食物组合物或剂型应当如上所述至少包含DSM 21062或其突变 株，从而每一个体可获得的两种菌株之一的量为约IO3-IO14CFU/天，诸如IO6-IO13CFU/天， 包括IO8-IO12CFU/天，或甚至IO9-IOiiCFU/天。该量取决于个体重量，优选对于人类为约 IO9-IO12CFU/天，对于宠物为IO7-IOiciCFU/天。然而，会理解，对于任何特定患者的具体剂量 水平将取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性、年龄、体重、健康概况、性别、饮食、 施用时间、施用途径、排泄速度、药物联合以及进行治疗的特定疾病的严重程度。在进一步的实施方案中，所述人类或宠物食物组合物或营养增补剂剂型进一步包 含一种或多种益生物质。适宜的益生物质的实例为低聚果糖(F0Q和菊糖。然而，也考虑 从DSM 21062的细菌细胞获得的其它益生物质，诸如低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)、 甚至多糖组合物。微生物参与包括大部分乳品的食品和饲料产品的制备。细菌培养物，尤其是通常 分类为乳酸菌的细菌培养物在制备所有发酵乳品、乳酪和黄油中必不可少。这些微生物的 培养物经常被经常称为起子培养物，并通过行使多种功能赋予各种乳制品特定特征。为了 使所述起子培养物发挥其功能，必不可少的是它包含足量的活细胞。因此，本发明的一个实施方案是包含活长双歧杆菌DSM21062或其突变株的起子培养物，并且优选其中所述起子 培养物组合物具有一定浓度的活细胞，该浓度在每克所述组合物IO4至IO12CFU的范围内。起子培养物通常用于通过根据食品或饲料产品起始材料添加起子培养物组合物 并将由此接种的起始材料保持在所述乳酸菌代谢活跃的条件下来制备食品或饲料产品。在 优选的实施方案中，所述食品为乳基产品，诸如乳酪、酸奶、黄油，或者液体发酵乳产品，诸 如例如酪乳或饮用酸奶。特别优选本发明用于制备牛乳产品的用途。尽管益生效应与活细胞相关，很多报道已经显示死的或失活的细菌也可以具有 独特的有益健康性能。因此，在本发明的一个实施方案中，死的或灭活的长双歧杆菌DSM 21062或其突变株或所述细胞的部分用于治疗炎性疾病。尤其是，此类细胞或者此类细胞的 部分被考虑用于制备治疗哺乳动物胃肠道炎症的药物，诸如过敏性肠综合征(IBS)、炎症性 肠病(IBD)、脂泻病(乳糖不耐受)、与食物过敏相关的肠炎、克罗恩病、间质性膀胱炎、酸性 肠综合征、胃炎、溃疡性结肠炎、痢疾或斑疹伤寒症。以权利要求的形式呈现本发明本发明的优选方面和实施方案可以所谓的权利要求的形式呈现。这些如下给出。1、长双歧杆菌细菌细胞的菌株，其可用作益生菌剂，耐受胆汁盐，产生大量胞外多 糖(EPS)，加强体外紧密联结，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎模型中具有抗 炎效应。2、权利要求1的菌株，其中计算为(IOOx(平均Wallace分数“TNBS-阳性对照 组-平均Wallace分数“处理”组)/平均Wallace分数“TNBS-阳性对照组”)的“ ％相对 防护”为35 %或更高，诸如40 %，或者甚至43 %或更高。3、前述权利要求任一项的菌株，其中当EPS根据实施例2的方法分离时，所述菌株 产生至少3mg/ml，诸如超过5mg/ml，或者甚至7mg/ml或更高。4、根据前述权利要求任一项的菌株，其中所述菌株产生相对富含甘露糖残基的 EPS，测得Glu-N 甘露糖比为40或更高，例如超过50，或者甚至60或更高。5、根据前述权利要求任一项的菌株，其中所述菌株产生相对富含葡萄糖残基的 EPS，测得Glu-N 葡萄糖比为50或更高，例如超过100，或者甚至180或更高。6、根据前述权利要求任一项的菌株，其中共培养Caco-2细胞(ATCC HTB-37)的体 外培养层与所述细菌菌株引起Caco-2细胞层的紧密联结统计上显著的加强，所述紧密联 结测量为所述Caco-2细胞层在暴露于紧密联结破坏剂癸酸钠后所述Caco-2细胞层的跨上 皮电阻。7、根据前述权利要求任一项的菌株，其中所述菌株还能够抑制致病菌株的生长。8、根据权利要求7的菌株，其中所述致病菌株选自单核细胞增多性利斯特菌、沙 门氏菌ssp、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。9、根据前述权利要求任一项的菌株，其中接受所述菌株的动物由于TNBS-诱导的 结肠炎经历重量损失，该重量损失小于接受对照菌株的动物的重量损失。10、根据前述权利要求任一项的菌株，其为登记号DSM 21062的长双歧杆菌菌株 或其突变株，其中所述突变株通过使用该保藏菌株作为起始材料获得，并且其中所述突变 株具有保留的或进一步改善的表征DSM 21062的抗炎效应、胆汁耐受性和/或EPS表达。11、包含根据前述权利要求任一项的细菌细胞的菌株或所述细胞的部分的组合物
10用于制备药物的用途。12、包含根据权利要求1至10任一项的细菌细胞的菌株或所述细胞的部分的组合 物用于制备治疗哺乳动物胃肠道炎症的药物的用途。13、权利要求12的用途，其中所述炎症选自以下病症组成的组过敏性肠综合征 (IBS)、炎症性肠病(IBD)、脂泻病(乳糖不耐受)、克罗恩病、间质性膀胱炎、酸性肠综合征、 胃炎、溃疡性结肠炎、痢疾、斑疹伤寒症和与食物过敏相关的肠炎。14、人类或宠物食物组合物，其包含至少一种权利要求1-10任一项的细菌细胞的 菌株。15、一种起子培养物组合物，其包含权利要求1至10任一项的细菌细胞，优选其中 所述起子培养物组合物具有一定浓度的活细胞，该浓度在每克所述组合物IO4至IO12CFU的 范围内。16、一种制备食品或饲料产品的方法，该方法包括将根据权利要求15的起子培养 物添加到食品或饲料产品起始材料中并将由此接种的起始材料保持在所述乳酸菌代谢活 跃的条件下。17、权利要求16的方法，其中所述食品是乳，优选牛乳。18、从权利要求1至10任一项的长双歧杆菌菌株分离的多糖。19、权利要求18的多糖，其相对富含甘露糖残基，测得Glu-N 甘露糖比为40或 更高，例如超过50，或者甚至60或更高。20、权利要求18的多糖，其相对富含葡萄糖残基，测得Glu-N 葡萄糖比为50或 更高，例如超过100，或者甚至180或更高。21、权利要求18的多糖，其根据权利要求17和18相对富含甘露糖和葡萄糖残基两者。22、药物组合物，其包含权利要求18至21任一项的多糖。23、权利要求1-10任一项的细菌细胞或所述细胞的部分用于治疗炎性疾病的用途。24、前述权利要求23的用途，其中所述疾病为过敏性肠综合征(IBS)、炎症性肠病 (IBD)、脂泻病(乳糖不耐受)、与食物过敏相关的肠炎、克罗恩病、间质性膀胱炎、酸性肠综 合征、胃炎、溃疡性结肠炎、痢疾或斑疹伤寒症。25、治疗炎性疾病的方法，其特征在于向需要治疗的人施用有效量的前述权利要 求任一项的包含多糖的组合物。在以下非限制性实施例和附图中进一步阐明本发明，其中图1 =(A)TNBS诱导的结肠炎的宏观炎症评价，表示为Wallace分数。以细菌处理 的小鼠与单独接受TNBS或假治疗的小鼠相比较。(B)TNBS诱导的结肠炎的宏观炎症评价， 表示为％防护，与单独接受TNBS或假治疗的小鼠相比较。*表明防护显著不同于假治疗， P ^ 0.05广ρ ^0.01的统计显著性水平( 0. 002的统计显著性水平；O不显著(t检 验)。误差棒指示Ix平均标准误差。图2 没有细菌处理可以减轻重量损失，除了菌株DSM 21062，其中注意到减少体 重损失的正趋势(12. 4% +/-1. 6,p = 0. 09)。防护的阳性对照(泼尼松龙)在减轻重量损失 方面非常显著。(4. 75% +/-1. 25,ρ ^ 0. 001)。_表明防护显著不同于假治疗，ρ彡0. 001。
图3 =MPO测定证实在发炎组织中，特别是对于TNBS对照组，嗜中性白细胞的大量 渗入(12. 56+/-3. 75)，与“健康小鼠”不同，其中仅测到非常微弱的活性(1.75+/-0. 07)。通 过类皮质激素调节进行防护显著降低了该参数G.21+/-0.96)。发现所有细菌处理组的平 均值均远在阳性对照值之下，然而没有观察到显著降低。表现出最佳的降低的菌株为菌株 DSM 21062 (p = 0. 07)。误差棒指示Ix平均标准误差。图4 通过当等量的细菌生物质沉淀时形成的球团粒度所表明的长双歧杆菌DSM 21062、瘤胃乳杆菌菌株CHCC8818和干酪乳杆菌菌株CHCC8773的蓬松性。图5 测量穿过Caco-2细胞汇合层的跨上皮电阻。“无处理”为既未用ClO亦未用 益生菌剂处理的Caco-2细胞层，“C10”为仅用ClO处理的细胞层。益生菌剂处理(恥_12， CRL-431，La-5和DSM 21062)细胞层，然后以ClO挑战，示于四个右侧的柱)。误差棒指示 Ix平均标准误差。"表示P <0.01的统计显著性水平，_ < 0.001的统计显著性水平(t 检验)。
实施例实施例1 体内分析长双歧杆菌DSM 21062的抗炎潜能培养条件和所用菌株在本研究中使用以下菌株长双歧杆菌菌株DSM 21062 (CHCC8879)。菌株瘤胃乳 杆菌菌株CHCC8818、干酪乳杆菌菌株CHCC8773、两歧双歧杆菌菌株CHCC9555和两歧双歧杆 菌菌株CHCC9553用作对照菌株。菌株CHCC8818、CHCC8773、CHCC9555和CHCC9553为在产 生本发明的筛选过程中鉴定和研究的Chr. Hansen培养物收集的4个推定的益生菌株。乳杆菌属于37°C培养于 MRS 肉汤(Difco，BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) 使 用 Anaerocult A 培养袋(Merck，Darmstadt，Germany)于 37°C MRS 肉汤+0.05%半胱氨酸 氢氯化物中培养双歧杆菌。对于每一菌株，在生长曲线以及琼脂培养基上细菌计数的基础上建立了 0D600nm/ CFU (集落形成单位)对应关系。关于动物实验，每日将500μ 1各菌株从不同的储瓶接种到50ml相应的生长培养 基中，以确保最后的细菌计数> 101(ICFU。离心培养物，在PBS中洗涤，并在将所述细菌施用于动物前再悬浮于足够体积的 缓冲液中。TNBS诱导的结肠炎和炎症记分描述用于炎性标记的模型和测定的方案对应于标准方法，先前描述于(33)。简言 之，通过胃内途径每日给予10只小鼠的组别或者碳酸盐缓冲液(“TNBS阳性对照”)或者 新鲜培养的IxlO9活细菌(“处理”)，连续进行5日。此外，以10mg/kg的泼尼松的商业制 备物(Cortancyl，Sanofi Aventis,France)处理10只小鼠的组，在施用TNBS前口服5日， 并在TNBS处理后口服连续2日(“阳性防护对照”)。通过直肠内施用50%乙醇中50μ 1 TNBS溶液(Sigma-Aldrich Chemical)诱发 急性结肠炎。施用100mg/kg TNBS在所用的BALB/c小鼠中引起中度严重的肠炎。10只小 鼠的组也被给予碳酸盐缓冲液，但是仅接受50 μ 1的50%乙醇溶液(无TNBS ；“阴性”(健 康)对照")。接下来每日监测动物的体重减轻。诱导结肠炎2日后，处死小鼠。研究设计
12示于表I。在小鼠解剖后，两位独立的观察者在不知情的情况下以Wallace尺度对结肠的宏 观炎症进行计分(34)。如前所述，％相对防护计算为100x(平均Wallace分数“TNBS-阳 性对照”组-平均Wallace分数“处理”组)/平均Wallace分数“TNBS阳性对照组”。公布时缺失表I 体内TNBS诱导的结肠炎的研究设计(i.r.=直肠内施用，i.g.=胃内施用)
权利要求
1.一种长双歧杆菌细菌细胞的菌株，其用作益生菌剂，耐受胆汁盐，产生高量的胞外 多糖(EPS)，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎模型中具有抗炎效应，其特征在 于所述菌株为登记号DSM 21062的长双歧杆菌菌株或其突变株，其中所述突变株通过使用 该保藏菌株作为起始材料获得，并且其中所述突变株具有保留的或进一步改善的表征DSM 21062的抗炎效应、胆汁耐受性和/或EPS表达。
2.权利要求1的菌株，其中共培养Caco-2细胞(ATCCHTB-37)的体外培养层与所 述菌株引起所述Caco-2细胞层的紧密联结统计上显著的加强，所述紧密联结测量为所述 Caco-2细胞层在暴露于紧密联结破坏剂癸酸钠后所述Caco-2细胞层的跨上皮电阻。
3.根据前述权利要求任一项的菌株，其中所述菌株还能够抑制致病菌株的生长。
4.根据权利要求1至3任一项的菌株，其中所述菌株产生相对富含甘露糖残基的EPS， 测得Glu-N 甘露糖比为40或更高。
5.根据权利要求1至4任一项的菌株，其中所述菌株产生相对富含葡萄糖残基的EPS， 测得Glu-N 葡糖糖比为50或更高。
6.包含根据前述权利要求任一项的细菌细胞的菌株或所述细胞的部分的组合物用于 制备药物的用途。
7.包含根据权利要求1至5任一项的细菌细胞的菌株或所述细胞的部分的组合物用于 制备治疗哺乳动物胃肠道炎症的药物的用途。
8.人类或宠物食物组合物，其包含至少一种权利要求1至5任一项的细菌细胞的菌株。
9.一种起子培养物组合物，其包含权利要求1至5任一项的细菌细胞，优选其中所述 起子培养物组合物具有一定浓度的活细胞，该浓度在每克所述组合物IO4至IO12CFU的范围 内。
10.一种制备食品或饲料产品的方法，该方法包括将根据权利要求9的起子培养物添 加到食品或饲料产品起始材料中并将由此接种的起始材料保持在所述乳酸菌代谢活跃的 条件下。
11.从权利要求1至5任一项的长双歧杆菌菌株分离的多糖。
全文摘要
本发明涉及新的长双歧杆菌益生抗炎菌株，其用于预防、减轻或治疗疾病以及用于制备人类或宠物食品的用途，或药物组合物。所述菌株产生大量具有高含量的甘露糖和葡萄糖残基的胞外多糖。因此，本发明还涉及由所述菌株获得的细菌多糖组合物，其用于治疗疾病的用途，以及包含此类多糖的药物组合物。
文档编号C12R1/01GK102089422SQ200980127197
公开日2011年6月8日 申请日期2009年7月6日 优先权日2008年7月11日
发明者延斯·基尔德斯加德, 托马斯·冈纳森, 托马斯·简森, 托马斯·达尔曼·莱泽, 梅特·魏泽, 班奈迪特·佛林巴尔德, 玛丽·福克恩伯格 迪特 申请人:科.汉森有限公司
技术领域：
本发明涉及新的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)益生抗炎菌株，其用于预 防、减轻或治疗疾病以及用于制备人类或宠物食品的用途，或药物组合物。此外，本发明涉 及由所述菌株获得的细菌多糖、其用于治疗疾病的用途、以及包含该多糖的药物组合物。
背景技术：
乳酸菌已经长时间知晓发酵糖产生酸尤其是主要的新陈代谢组分乳酸的细菌。此类细菌 可以在牛奶或乳品、活着的或腐败植物中发现，也可以在人类和动物肠道中发现。传统上， 这类细菌被称为“乳酸菌”。乳酸菌指发酵糖产生酸(包括乳酸)的革兰氏阳性、无运动微 需氧或厌氧细菌的相当异种的一类，乳酸菌包括，例如，双歧杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属、 乳球菌属、明串珠菌属和片球菌属。几个世纪以来，乳酸菌已用于制备食品和饲料产品，包括大部分乳制品，现在，乳 酸菌在制备所有发酵乳品例如酸奶、发酵全脂牛奶、乳冻食品(junket)、乳酪和黄油中是必 不可少的。大量记载各种乳酸菌有益影响人类和/或动物健康的报道的发表吸引了对这类 细菌进一步的兴趣。尤其是，发现乳杆菌属或双歧杆菌属的特定菌株能够在肠粘膜集群，并 辅助维持宿主健康。这类细菌通常被称为益生菌或益生菌剂。益生菌益生微生物已经被定义为“在足量施用时赋予宿主健康益处的活的微生物”(FAO/ WHO 2002)。尽管已经鉴别很多益生菌(尤其是乳杆菌属或双歧杆菌属菌株)，然而大量的研 究也表明参考其系统分类并不能准确地预测益生菌。而相反地，每一菌株应当分别评价。研 究也表明即使是密切相关的益生菌也可能对健康产生相当不同的影响。然而，清楚的是，大部分鉴别的益生菌除了其健康有益效果之外，具有一些额外的 特征。抗胆汁酸通常认为，益生菌剂发挥其对肠道上皮的有益效果的先决条件是足量的活益生菌 存在。进入肠上部后，益生菌接触高水平的胆汁盐。因此，最重要的是益生菌抗胆汁酸。肠屏障功能肠屏障功能在粘膜与外界的交界处调节运输和宿主防御机制。细胞间和旁细胞流 受到膜泵、离子通道和紧密联结的严密调控，调节渗透性至生理需求。任何水平的干扰、特 别是由于增加渗透性引起的细菌易位和由于受损上皮细胞和T细胞相互作用引起的口腔 耐受性破坏，可以导致炎症和组织损伤。上皮屏障抑制诸如LPS及其他炎性化合物的高分子量物质从肠腔侧进入循环系统。
紧密联结引起该上皮屏障的功能之一。紧密联结或闭合带是膜连接在一起形成对 液体实质上的非渗透屏障的两个上皮细胞的紧密结合区域，其将血管系统与消化道腔相分 离。因此，已经证明，降低所述紧密联结屏障功能导致不需要的物质诸如LPS由肠腔进入循 环系统的侵入增加。相反地，预期诱导紧密联结屏障功能引起不需要的物质诸如LPS的侵 入减少。胞外多糖和生物膜形成尽管存活对于粘附和集群能力(即生物膜形成)是重要的，但是它也被认为是益 生菌发挥它的有益效果所需的一个重要的促成因素，无论它是通过免疫调节、病原体排除 或与粘膜的接触增强(1)。很多细菌在生物膜发生中的重要特征是粘液样物质，已知为胞外多糖(EPQ或胞 外基质。胞外多糖是包括乳杆菌属和双歧杆菌的很多细菌表面上存在的胞外聚合物O)。 EPS形成粘液层，其松弛地附着于细胞表面或分泌到环境中(3)。通过比较非EPS产生菌和EPS产生菌等基因变体研究了这些分子的生理功能。表 明细胞结合EPS保护细菌抵御噬菌体和细胞壁降解酶⑷。最近，Mao等人发现，由大肠杆 菌菌株产生的胞外多糖增强该菌在模拟胃肠流体中的存活(5)。这些发现表明，某些细菌产 生的胞外多糖事实上可能对于它们在肠中生存是必不可少的。可用于乳业制备诸如酸奶的发酵乳品的菌株很重要的技术特征是其在发酵乳品 的流变学和质地改善中的用途(30)。在很大程度上菌株的结构特征与EPS的产生相关 (30)。尽管这是重要的技术特征，EPS很可能由于其特定的化学结构对接受者产生有益的 健康效果。已经显示，乳酸菌所产生的一些种类的EPS对于人类健康具有有益效果，例如降 低胆固醇的能力(6)、免疫调节活性(7 ;8)、对胃肠粘液的微生物粘附(9;10)、抗氧化剂和 自由基清除活性(11)以及益生(双歧(bifidogenic))作用(12)。近来，已经表明，产生高水平EPS的德氏乳杆菌(LactcAacillus delbrueckii)显 著降低结肠炎的鼠模型中炎症的严重性(1 。因此，看起来清楚的是高产量特定EPS可能 与益生菌的免疫调节作用有关。涉及肠微生物群的胃肠并发症炎症是先天免疫系统的复杂反应，涉及在侵染、毒素暴露或细胞伤害位点处的白 细胞和血浆蛋白质的累积和活化。尽管炎症在控制感染和促进组织修复中起到防护功能， 其也会引起组织损伤和疾病。胃肠机能紊乱诸如炎症性肠病(克罗恩病)、溃疡性结肠炎和 过敏性肠综合征是自发性炎症。涉及胃肠炎症的其它疾病为隐窝炎、食物过敏、和食物过敏 引起的异位性皮炎(14-16)。克罗恩病和溃疡性结肠炎在北欧、英国和北美洲最为流行，其中每100，000达500 人受影响。虽然这些疾病具有不同的病因学，但均涉及机能紊乱的粘膜免疫系统对土著菌 群及其他腔抗原的不当响应(6)。这些紊乱的急性治疗依赖于抗生素和抗炎药，而在严重病 例中，手术则是必要的。长期的治疗包括生活方式改变、饮食调整和停止吸烟(7)。已经表 明益生菌通过对胃肠上皮和粘膜免疫系统发挥正效应而延长免于这些病症(8)。过敏性肠综合征(IBS)影响7-31%的已经克服由于沙门氏菌属、弯曲杆菌属或志 贺氏菌属感染导致的感染性胃肠炎患者。具有腹泻但不具有感染性起始的IBS可以在经历
4“不利”生活事件的个体中发生(17)。尽管临床试验表明在IBS中益生菌的效力变化大，但 是双盲安慰剂对照研究已经表明，某些益生菌的混合物可对IBS具有有益效果(18-20)，因 此突出了识别新的益生菌的重要性。益生菌剂的免疫调节效应已经表明，益生菌具有减轻具有胃肠炎性并发症如克罗恩病和溃疡性结肠炎的患 者症状的能力01;22)。具体地说，双歧杆菌已经被描述为在胃肠疾病的预防和治疗中具 有潜力的益生菌，如 EP 1 688481、EP 0 199535、EP 0 768 375、WO 97/00078、EP 0 577 903 和 WO 00/53200 所述。EP 0 768 375 (Nestle SA)描述了双歧杆菌属的具体菌株，其能够埋入肠内菌丛 并能够竞争性地排除病原菌粘着至肠细胞。据报道，这些双歧杆菌帮助免疫调节并因此帮 助个体健康的维持。双歧杆菌的免疫调节效应甚至可赋予未出生的儿童。WO 01/97822例 如描述了通过母亲摄入动物双歧杆菌属(Bifidobacterium animal is)菌株BB-12 ,减少 了儿童中特应性疾病的发生。此外，WO 03/099037 (Nestec SA)描述了动物双歧杆菌属菌 株BB-12 能够有利地调节免疫反应。尽管已经描述了相当多的具有抗炎性质的双歧杆菌属菌株，但只有少数菌株已经 被报道在体内有效治疗实验诱导的肠炎。W004052462A1 (B. Pot, Danisco A/S)描述了某些两歧双歧杆菌和乳双歧杆菌 (Bifidobacterium lactis)菌株能够在结肠炎的实验鼠模型中减少炎症的严重性。W02007/09369A1 (Nestec SA)描述了长双歧杆菌菌株 BL999 (ATCCBAA-999)在结 肠炎的实验鼠模型中减少炎症的严重性。EP 1688481 和EP 1141235B(University College of Cork)描述了婴儿长双歧杆 菌菌株UCC356M在结肠炎的鼠模型中减少炎症的严重性。Foligne等Q007)描述了在结肠炎的实验鼠模型中减少炎症严重性的三种双歧 杆菌。然而，这些文件对于EPS产生、菌株的EPS组成、紧密联结的强度都并未描述，并 且，除了 EP1688481之外，对于双歧杆菌属菌株的胆汁酸抗性也没有描述。由于即使是密切相关的益生菌也对健康产生颇为不同而特定的效应，因此对新的 益生菌存在持续的需求，包括能够调理炎性肠疾病、抗胆汁酸和由于高水平的EPS而能够 集群于肠的新的抗炎双歧杆菌属菌株。发明概述本发明出乎意料地发现特定长双歧杆菌菌株综合了胆汁抗性、改善肠屏障功能 和体内大量产生具有优异抗炎性的胞外多糖这些重要的益生特征。特别地，本发明人出乎意料地鉴别了长双歧杆菌的一个特定益生菌株，即长双歧 杆菌DSM 21062，其综合了所有上述重要的益生特征。预期直接来源于该益生菌的菌株很可能保持其益生特征。因此，在第一方面，本发明涉及长双歧杆菌细菌细胞的菌株，其可用于益生菌剂， 耐受胆汁盐，产生高量的胞外多糖(EPS)，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎模 型中具有抗炎效应，其特征在于所述菌株为登记号DSM 21062的长双歧杆菌菌株或其突变 株，其中所述突变株通过使用保藏菌株作为起始材料获得，并且其中所述突变株具有保留的或进一步改善的表征DSM 21062的抗炎效应、胆汁耐受性和/或EPS表达。如在实施例中表明，长双歧杆菌DSM 21062菌株在体内具有一些非凡的免疫调节 性能，表明其可以有效防御多种疾病。因此，在第二方面，本发明涉及包含长双歧杆菌DSM 21062细菌细胞或其突变株的组合物用于制备药物的用途。特别地，所述菌株可用于制备治疗哺乳动物胃肠道炎性病症的药物。许多益生菌剂用于制备食品或饲料产品；因此，本发明的另一重要方面是提供包 含长双歧杆菌DSM 21062或其突变株的人类或宠物食物组合物。当制备所述食品或饲料产品时，制造商通常使用用于加工食品和饲料产品的所谓 的起子培养物。起子培养物广泛用于乳品业。一般地，起子培养物给予各种食品或饲料产 品特定的特征。沿用已久的事实是稠度、质地、主体和口感与用于制备所述食品或饲料的起 子培养物的EPS产生强烈地相关。因此，本发明的另一方面是包含长双歧杆菌DSM 21062 或其突变株的起子培养物组合物，优选地其中所述起子培养物组合物具有以下浓度的活细 胞，所述浓度的范围为每克所述组合物IO4至1012CFU。本发明也设计一种制备食品或饲料产品的方法，所述方法包括向食品或饲料产 品起始材料添加包含长双歧杆菌DSM 21062或其突变株的起子培养物组合物，并将由此接 种的起始材料保持在所述乳酸菌代谢活跃的条件下。由实施例可见，长双歧杆菌DSM 21062不仅产生高量的胞外多糖，也产生相当不 常见类型的EPS，该EPS通常富含甘露糖和葡萄糖残基。众所周知，一些类型的EPS涉及对人类健康的特定效应(6)、(9 ； 10)、(11)、(12)。 因此，本申请考虑，长双歧杆菌DSM 21062EPS异常结构可能参与甚至负责由该菌株产生的 独特免疫调节效果。因此，另一个方面，本发明涉及由长双歧杆菌DSM 21062或其突变株分 离的多糖。包含所述长双歧杆菌DSM 21062或其突变株的多糖的药物组合物也是本发明的
一方面。进一步考虑，长双歧杆菌DSM 21062的EPS的独特结构可能通常涉及炎性疾病。先 前表明，当施用于哺乳动物时，含有甘露糖的复杂聚合物(甘露聚糖)具有显著的生物学活 性。因此，在本发明的一方面，长双歧杆菌DSM 21062细胞或所述细胞的部分通常用于治疗 炎性疾病。特别地，本发明涉及一种治疗炎性疾病的方法，其特征在于向需要治疗的人施用 有效量的包含多糖的组合物，所述组合物包含获得自DSM 21062或DSM 21062的突变株的 EPS。定义在讨论本发明的详细实施方案之前，提供与本发明的主要方面相关的特定术语的定义。本文中所用的术语“胞外多糖”指高分子量聚合物，其由通过微生物分泌到周围环 境中的糖残基组成。表达“益生菌剂(probiotics或probioticum)指的是包含益生微生物的组合物。 益生菌定义为对宿主的卫生和健康具有有益效果的微生物细胞。益生微生物已经被定义为 “在足量施用时赋予宿主健康益处的活的微生物”(FA0/WH0 2002)。表达“益生元”指增加肠内益生菌的数量的组合物或组合物的组分。因此，益生元 指任何由土著菌在结肠中特别发酵的任何非活的食品组分，认为其具有积极价值，例如，双
6歧杆菌属，乳杆菌属。联合施用益生菌与一种或多种益生化合物可以提高施用的益生菌剂 在体内的生长，产生更加显著的健康益处，称为协同益生(symbiotic)。表达“相对富含甘露糖残基的EPS”指其中甘露糖是存在的至少第二最丰富种类的 单糖的EPS。表达““Glu-N 甘露糖比”指葡糖胺(Glu-N)和甘露糖的量之间的比。表达“相对富含葡萄糖残基的EPS”指其中葡萄糖是存在的最丰富种类的单糖的 EPS。表达““Glu-N 葡萄糖比”指葡糖胺(Glu-N)和葡萄糖的量之间的比。仅通过例举的方式，如下描述本发明的实施方案发明详述本发明旨在鉴别一种新的益生菌株，其可用于预防、减轻或治疗与炎症、尤其是肠 炎相关的紊乱、病症或疾病。这里，我们第一次描述了益生长双歧杆菌菌株，其特征在于耐受胆汁盐，产生大 量胞外多糖(EPS)，加强体外上皮细胞的紧密联结，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBQ诱导的 结肠炎模型中具有抗炎效应。在本发明的优选实施方案中，所述长双歧杆菌菌株是长双歧杆菌菌株(DSM 21062)。根据国际承认用于专利程序的布达佩斯条约，所述益生长双歧杆菌菌株DSM 21062 于 2008 年 1 月 23 日保藏于德国 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)Inhoffenstra β e 7B,38124 Braunschweig。实施例1表明长双歧杆菌菌株(DSM 21062)能够在实验结肠炎小鼠模型中预防 炎症。从
图1可见，长双歧杆菌菌株(DSM 21062)对TNBS诱导的结肠炎的防护效应明 显好于其它测试菌株的效应。用DSM 21062处理的小鼠的宏观炎症分数(macroscopic inflammation score) (Wallace分数)为2. 85+/-0. 52，而该分数高于其它菌株(菌株9555 3. 5+/-0. 53 ；菌株 9553 :3. 55+/-0. 58，菌株8773 :4. 75+/-0. 77，菌株 8818 :4. 0+/-0. 58)。 TNBS参照的平均Wallace分数为5. 15+/-0. 62，而防护的阳性对照(泼尼松龙)为高度防 护性的，平均Wallace分数为2. 35+/-0. 31。在健康小鼠中没有检测到炎症迹象(Wallace 分数0. 5赋予所有乙醇-处理的小鼠)。Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TEER)使得能够测量与紧密联结破坏相关的旁细 胞离子流变化(Velarde et al. (1999) Toxicology in Vitro 13，723-727)，因此该测定可 用于定量益生菌对紧密联结的保护效应。在实施例6中，表明长双歧杆菌菌株(DSM 21062) 在其响应于紧密联结破坏性癸酸钠(ClO)时减少Caco-2细胞层跨上皮电阻(TEER)降低的 能力优于其它益生菌。不囿于理论，我们预期紧密联结强度与肠屏障功能和肠上皮的紧致 度正相关，因此可能当采用小鼠(TNBS)诱导的结肠炎模型时与上皮的响应相关。所述长双歧杆菌菌株(DSM 21062)在所述研究中进一步产生与其它菌株相比大 量的EPS。DSM 21062在实施例2所描述获得的并通过HPLC在PAlO柱(高pH阴离子交换 色谱法)测量的EPS提取物中产生至少3mg/ml，诸如超过5mg/ml，或者甚至7mg/ml或更多。然而，EPS的量和实际组成对于其功能皆是重要的。先前表明，当施用于哺乳动物 时，含有甘露糖的复杂聚合物(甘露聚糖)具有显著的生物学活性。这包括活化免疫系统，然后将甘露糖结合于识别分子例如在巨噬细胞和树突细胞上表达的甘露糖受体(CD206) (23-25)。近来已经表明甘露糖受体为新疫苗的靶标，不仅用于使免疫防御针对癌症和传染 病，也用于在自身免疫性疾病的治疗中特异性诱导耐受性06)。肠树突细胞(DC)被认为取 样并呈递共生菌至肠相关免疫系统07)并表明具有高含量甘露糖的EPS能够调节对肠微 生物群落的免疫反应。已经表明来自真菌的EPS具有免疫刺激和抗肿瘤效应，并且来自这 些真菌的EPS含有甘露糖08 ；29)。就我们所知，尚未教导真菌EPS选择其免疫刺激效应 的机制是通过与甘露糖结合受体的相互作用，我们考虑，情况正是如此。因此，认为本发明 长双歧杆菌菌株(DSM 21062)的重要特征在于其产生相对富含甘露糖残基的EPS，例如测 得Glu-N 甘露糖比为40或更高，例如超过50甚至60或更高。如表II所表明的，甘露糖 残基的绝对量也显著高于其它研究的细菌。而且，分析DSM 21062产生的EPS显示其还出 乎意料地富含葡萄糖残基。所述菌株产生相对富含葡萄糖残基的EPS，例如，测得Glu-N 葡萄糖比为50以上，例如超过100，或者甚至180以上。葡萄糖残基的绝对量也出乎意料地 尚ο这显示所述长双歧杆菌菌株(DSM2106》产生具有独特的化学组成的EPS。预 期这些独特的EPS至少部分负责所述菌株的有益效果，因此从所述长双歧杆菌菌株(DSM 21062)或其突变分离的多糖可用于配制包含所述多糖的益生元或药物组合物，其可用于预 防、减轻或治疗各种炎性疾病或病症。正如所述，所述菌株EPS的甘露糖残基的高量和葡萄 糖残基的量被认为是显著的。我们相信，特别是分离自菌株DSM 21062(或其突变体)并相 对富含甘露糖和葡萄糖残基的多糖制备物将证明特别地有效。然而，任何这里提及的包含 任一所述多糖的益生元或药物组合物为本发明的一种实施方案。如实施例4表明，所述长双歧杆菌菌株(DSM 2106 进一步能够抑制致病菌株的 生长。该实施例表明该菌株能够抑制选自以下的菌株单核细胞增多性利斯特菌、沙门氏菌 SSP、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。值得注意的是，长双歧杆菌菌株(DSM2106》能够抑制致病菌株的生长，因为产生 除了有机酸之外的抗微生物物质对于双歧杆菌属菌株而言是罕有的。只分离了少数能够产 生过氧化氢和热稳定蛋白质抗菌化合物的菌株(30)。EP1688481 (Univ. College of Cork) 描述了一种具有抗微生物活性的婴儿长双歧杆菌。该菌株的抗微生物活性可能是由于产生 了乙酸和乳酸，因为进行的测定不涉及PH调节。我们已经开发了评价来自益生菌株长双歧 杆菌 DSM 21062、CHCC9555、CHCC9553、CHCC8773 和 CHCC8818 的 pH 调节条件培养基的抗微 生物活性的测定。在该测定中，长双歧杆菌DSM 21062在抑制病原体生长上明显优异，该效 应与EP 168848中描述的婴儿长双歧杆菌菌株相反，不是由于产生乙酸或乳酸，该测定表 明长双歧杆菌DSM 21062通过独特的机制发挥其抗微生物效应。TNBS诱导的结肠炎导致小鼠重量显著损失，这可以通过DSM 21062抵消至一定程 度，但不能通过其它细菌处理实现。因此，在一实施方案中，本发明的菌株特征在于，接受所述菌株的动物经历的由于 TNBS诱导的结肠炎引起的重量损失显著小于(在ρ = 0. 1水平)接受对照菌株的动物的重
量损失。由上清楚的是DSM 21062可以用于制备药物。实施例1表明，DSM 21062可用于 制备治疗哺乳动物胃肠道炎性病症的药物。人体胃肠道炎症的实例包括过敏性肠综合征(IBS)、炎症性肠病(IBD)、脂泻病(乳糖不耐受)、克罗恩病、间质性膀胱炎、酸性肠综合征、 胃炎、溃疡性结肠炎、痢疾、斑疹伤寒症和与食物过敏相关的肠炎。在本发明的一实施方案 中，DSM 21062用于制备预防、减轻或治疗任何这些病症的药物。在另一方面，本发明涉及包含DSM 21062或其突变株的人类或宠物食物组合物。 优选，所述细菌可以作为添加剂施用至正常的饮食或者作为营养完全人类或宠物食物的组 分。剂型可以是液体或固体。在后一情况下，所述产品可以粉末化并形成片剂、颗粒或胶囊， 或者简单与其它食物组分混合，形成功能性食品。本发明的食品组合物可以是使用DSM 21062或其突变株产生的任何可摄取的材 料，选自乳、凝乳、乳基发酵产品、酸化乳、酸奶、冷冻酸奶、奶粉、乳基粉末、乳浓缩物、乳酪、 涂抹干酪、调味品、饮料、冰淇淋、发酵的基于谷物的产品、婴儿配方、片剂、液体细菌悬液、 干口服添加剂、湿口服添加剂、干管道饲喂或湿管道饲喂。在进一步的实施方案中，所述组合物进一步包含药学可接受载体。本文中所用的 术语“药学可接受载体”是指适于施用于人类或动物并且与所述益生活性有机体相容的一 种或多种固体或液体填充稀释剂或囊化物质。术语“相容的”涉及能够与DSM 21062或其 突变株混合的药物组合物组分，混合的方式使得在正常使用条件下没有会实质上降低选择 用于本发明的有机体的益生效能的相互作用。药学可接受载体必须具有足够高的纯度，并 且足够低的毒性，使得其适于施用于被处理的人类和动物。本文中所述的固体组合物优选为片剂、胶囊或颗粒(包括许多颗粒)。优选所述 固体组合物为口服剂型。常规配制技术的综述可以在例如“!"he Theory and Practice of Industrial Wiarmacy”中找到(31)或(32)。因此，所述片剂可以通过本领域已知的方法 制备，并且可以是压缩的、肠包衣的、糖包衣的、膜包衣的、或多次压缩的，含有适宜的粘合 剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂、着色剂、粉末化剂、流动-产生剂和熔化剂。具有液体或固体内 含物的胶囊(软胶囊和硬胶囊)可以根据制药工业公知的常规技术进行制备。作为一个实 例，可以使用适宜的填充机将益生活性有机体填充至明胶胶囊中。本文中所述的固体组合 物也可以是丸。所述人类或宠物食物组合物或剂型应当如上所述至少包含DSM 21062或其突变 株，从而每一个体可获得的两种菌株之一的量为约IO3-IO14CFU/天，诸如IO6-IO13CFU/天， 包括IO8-IO12CFU/天，或甚至IO9-IOiiCFU/天。该量取决于个体重量，优选对于人类为约 IO9-IO12CFU/天，对于宠物为IO7-IOiciCFU/天。然而，会理解，对于任何特定患者的具体剂量 水平将取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性、年龄、体重、健康概况、性别、饮食、 施用时间、施用途径、排泄速度、药物联合以及进行治疗的特定疾病的严重程度。在进一步的实施方案中，所述人类或宠物食物组合物或营养增补剂剂型进一步包 含一种或多种益生物质。适宜的益生物质的实例为低聚果糖(F0Q和菊糖。然而，也考虑 从DSM 21062的细菌细胞获得的其它益生物质，诸如低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)、 甚至多糖组合物。微生物参与包括大部分乳品的食品和饲料产品的制备。细菌培养物，尤其是通常 分类为乳酸菌的细菌培养物在制备所有发酵乳品、乳酪和黄油中必不可少。这些微生物的 培养物经常被经常称为起子培养物，并通过行使多种功能赋予各种乳制品特定特征。为了 使所述起子培养物发挥其功能，必不可少的是它包含足量的活细胞。因此，本发明的一个实施方案是包含活长双歧杆菌DSM21062或其突变株的起子培养物，并且优选其中所述起子 培养物组合物具有一定浓度的活细胞，该浓度在每克所述组合物IO4至IO12CFU的范围内。起子培养物通常用于通过根据食品或饲料产品起始材料添加起子培养物组合物 并将由此接种的起始材料保持在所述乳酸菌代谢活跃的条件下来制备食品或饲料产品。在 优选的实施方案中，所述食品为乳基产品，诸如乳酪、酸奶、黄油，或者液体发酵乳产品，诸 如例如酪乳或饮用酸奶。特别优选本发明用于制备牛乳产品的用途。尽管益生效应与活细胞相关，很多报道已经显示死的或失活的细菌也可以具有 独特的有益健康性能。因此，在本发明的一个实施方案中，死的或灭活的长双歧杆菌DSM 21062或其突变株或所述细胞的部分用于治疗炎性疾病。尤其是，此类细胞或者此类细胞的 部分被考虑用于制备治疗哺乳动物胃肠道炎症的药物，诸如过敏性肠综合征(IBS)、炎症性 肠病(IBD)、脂泻病(乳糖不耐受)、与食物过敏相关的肠炎、克罗恩病、间质性膀胱炎、酸性 肠综合征、胃炎、溃疡性结肠炎、痢疾或斑疹伤寒症。以权利要求的形式呈现本发明本发明的优选方面和实施方案可以所谓的权利要求的形式呈现。这些如下给出。1、长双歧杆菌细菌细胞的菌株，其可用作益生菌剂，耐受胆汁盐，产生大量胞外多 糖(EPS)，加强体外紧密联结，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎模型中具有抗 炎效应。2、权利要求1的菌株，其中计算为(IOOx(平均Wallace分数“TNBS-阳性对照 组-平均Wallace分数“处理”组)/平均Wallace分数“TNBS-阳性对照组”)的“ ％相对 防护”为35 %或更高，诸如40 %，或者甚至43 %或更高。3、前述权利要求任一项的菌株，其中当EPS根据实施例2的方法分离时，所述菌株 产生至少3mg/ml，诸如超过5mg/ml，或者甚至7mg/ml或更高。4、根据前述权利要求任一项的菌株，其中所述菌株产生相对富含甘露糖残基的 EPS，测得Glu-N 甘露糖比为40或更高，例如超过50，或者甚至60或更高。5、根据前述权利要求任一项的菌株，其中所述菌株产生相对富含葡萄糖残基的 EPS，测得Glu-N 葡萄糖比为50或更高，例如超过100，或者甚至180或更高。6、根据前述权利要求任一项的菌株，其中共培养Caco-2细胞(ATCC HTB-37)的体 外培养层与所述细菌菌株引起Caco-2细胞层的紧密联结统计上显著的加强，所述紧密联 结测量为所述Caco-2细胞层在暴露于紧密联结破坏剂癸酸钠后所述Caco-2细胞层的跨上 皮电阻。7、根据前述权利要求任一项的菌株，其中所述菌株还能够抑制致病菌株的生长。8、根据权利要求7的菌株，其中所述致病菌株选自单核细胞增多性利斯特菌、沙 门氏菌ssp、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。9、根据前述权利要求任一项的菌株，其中接受所述菌株的动物由于TNBS-诱导的 结肠炎经历重量损失，该重量损失小于接受对照菌株的动物的重量损失。10、根据前述权利要求任一项的菌株，其为登记号DSM 21062的长双歧杆菌菌株 或其突变株，其中所述突变株通过使用该保藏菌株作为起始材料获得，并且其中所述突变 株具有保留的或进一步改善的表征DSM 21062的抗炎效应、胆汁耐受性和/或EPS表达。11、包含根据前述权利要求任一项的细菌细胞的菌株或所述细胞的部分的组合物
10用于制备药物的用途。12、包含根据权利要求1至10任一项的细菌细胞的菌株或所述细胞的部分的组合 物用于制备治疗哺乳动物胃肠道炎症的药物的用途。13、权利要求12的用途，其中所述炎症选自以下病症组成的组过敏性肠综合征 (IBS)、炎症性肠病(IBD)、脂泻病(乳糖不耐受)、克罗恩病、间质性膀胱炎、酸性肠综合征、 胃炎、溃疡性结肠炎、痢疾、斑疹伤寒症和与食物过敏相关的肠炎。14、人类或宠物食物组合物，其包含至少一种权利要求1-10任一项的细菌细胞的 菌株。15、一种起子培养物组合物，其包含权利要求1至10任一项的细菌细胞，优选其中 所述起子培养物组合物具有一定浓度的活细胞，该浓度在每克所述组合物IO4至IO12CFU的 范围内。16、一种制备食品或饲料产品的方法，该方法包括将根据权利要求15的起子培养 物添加到食品或饲料产品起始材料中并将由此接种的起始材料保持在所述乳酸菌代谢活 跃的条件下。17、权利要求16的方法，其中所述食品是乳，优选牛乳。18、从权利要求1至10任一项的长双歧杆菌菌株分离的多糖。19、权利要求18的多糖，其相对富含甘露糖残基，测得Glu-N 甘露糖比为40或 更高，例如超过50，或者甚至60或更高。20、权利要求18的多糖，其相对富含葡萄糖残基，测得Glu-N 葡萄糖比为50或 更高，例如超过100，或者甚至180或更高。21、权利要求18的多糖，其根据权利要求17和18相对富含甘露糖和葡萄糖残基两者。22、药物组合物，其包含权利要求18至21任一项的多糖。23、权利要求1-10任一项的细菌细胞或所述细胞的部分用于治疗炎性疾病的用途。24、前述权利要求23的用途，其中所述疾病为过敏性肠综合征(IBS)、炎症性肠病 (IBD)、脂泻病(乳糖不耐受)、与食物过敏相关的肠炎、克罗恩病、间质性膀胱炎、酸性肠综 合征、胃炎、溃疡性结肠炎、痢疾或斑疹伤寒症。25、治疗炎性疾病的方法，其特征在于向需要治疗的人施用有效量的前述权利要 求任一项的包含多糖的组合物。在以下非限制性实施例和附图中进一步阐明本发明，其中图1 =(A)TNBS诱导的结肠炎的宏观炎症评价，表示为Wallace分数。以细菌处理 的小鼠与单独接受TNBS或假治疗的小鼠相比较。(B)TNBS诱导的结肠炎的宏观炎症评价， 表示为％防护，与单独接受TNBS或假治疗的小鼠相比较。*表明防护显著不同于假治疗， P ^ 0.05广ρ ^0.01的统计显著性水平( 0. 002的统计显著性水平；O不显著(t检 验)。误差棒指示Ix平均标准误差。图2 没有细菌处理可以减轻重量损失，除了菌株DSM 21062，其中注意到减少体 重损失的正趋势(12. 4% +/-1. 6,p = 0. 09)。防护的阳性对照(泼尼松龙)在减轻重量损失 方面非常显著。(4. 75% +/-1. 25,ρ ^ 0. 001)。_表明防护显著不同于假治疗，ρ彡0. 001。
图3 =MPO测定证实在发炎组织中，特别是对于TNBS对照组，嗜中性白细胞的大量 渗入(12. 56+/-3. 75)，与“健康小鼠”不同，其中仅测到非常微弱的活性(1.75+/-0. 07)。通 过类皮质激素调节进行防护显著降低了该参数G.21+/-0.96)。发现所有细菌处理组的平 均值均远在阳性对照值之下，然而没有观察到显著降低。表现出最佳的降低的菌株为菌株 DSM 21062 (p = 0. 07)。误差棒指示Ix平均标准误差。图4 通过当等量的细菌生物质沉淀时形成的球团粒度所表明的长双歧杆菌DSM 21062、瘤胃乳杆菌菌株CHCC8818和干酪乳杆菌菌株CHCC8773的蓬松性。图5 测量穿过Caco-2细胞汇合层的跨上皮电阻。“无处理”为既未用ClO亦未用 益生菌剂处理的Caco-2细胞层，“C10”为仅用ClO处理的细胞层。益生菌剂处理(恥_12， CRL-431，La-5和DSM 21062)细胞层，然后以ClO挑战，示于四个右侧的柱)。误差棒指示 Ix平均标准误差。"表示P <0.01的统计显著性水平，_ < 0.001的统计显著性水平(t 检验)。
实施例实施例1 体内分析长双歧杆菌DSM 21062的抗炎潜能培养条件和所用菌株在本研究中使用以下菌株长双歧杆菌菌株DSM 21062 (CHCC8879)。菌株瘤胃乳 杆菌菌株CHCC8818、干酪乳杆菌菌株CHCC8773、两歧双歧杆菌菌株CHCC9555和两歧双歧杆 菌菌株CHCC9553用作对照菌株。菌株CHCC8818、CHCC8773、CHCC9555和CHCC9553为在产 生本发明的筛选过程中鉴定和研究的Chr. Hansen培养物收集的4个推定的益生菌株。乳杆菌属于37°C培养于 MRS 肉汤(Difco，BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) 使 用 Anaerocult A 培养袋(Merck，Darmstadt，Germany)于 37°C MRS 肉汤+0.05%半胱氨酸 氢氯化物中培养双歧杆菌。对于每一菌株，在生长曲线以及琼脂培养基上细菌计数的基础上建立了 0D600nm/ CFU (集落形成单位)对应关系。关于动物实验，每日将500μ 1各菌株从不同的储瓶接种到50ml相应的生长培养 基中，以确保最后的细菌计数> 101(ICFU。离心培养物，在PBS中洗涤，并在将所述细菌施用于动物前再悬浮于足够体积的 缓冲液中。TNBS诱导的结肠炎和炎症记分描述用于炎性标记的模型和测定的方案对应于标准方法，先前描述于(33)。简言 之，通过胃内途径每日给予10只小鼠的组别或者碳酸盐缓冲液(“TNBS阳性对照”)或者 新鲜培养的IxlO9活细菌(“处理”)，连续进行5日。此外，以10mg/kg的泼尼松的商业制 备物(Cortancyl，Sanofi Aventis,France)处理10只小鼠的组，在施用TNBS前口服5日， 并在TNBS处理后口服连续2日(“阳性防护对照”)。通过直肠内施用50%乙醇中50μ 1 TNBS溶液(Sigma-Aldrich Chemical)诱发 急性结肠炎。施用100mg/kg TNBS在所用的BALB/c小鼠中引起中度严重的肠炎。10只小 鼠的组也被给予碳酸盐缓冲液，但是仅接受50 μ 1的50%乙醇溶液(无TNBS ；“阴性”(健 康)对照")。接下来每日监测动物的体重减轻。诱导结肠炎2日后，处死小鼠。研究设计
12示于表I。在小鼠解剖后，两位独立的观察者在不知情的情况下以Wallace尺度对结肠的宏 观炎症进行计分(34)。如前所述，％相对防护计算为100x(平均Wallace分数“TNBS-阳 性对照”组-平均Wallace分数“处理”组)/平均Wallace分数“TNBS阳性对照组”。公布时缺失表I 体内TNBS诱导的结肠炎的研究设计(i.r.=直肠内施用，i.g.=胃内施用)
权利要求
1.一种长双歧杆菌细菌细胞的菌株，其用作益生菌剂，耐受胆汁盐，产生高量的胞外 多糖(EPS)，并在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎模型中具有抗炎效应，其特征在 于所述菌株为登记号DSM 21062的长双歧杆菌菌株或其突变株，其中所述突变株通过使用 该保藏菌株作为起始材料获得，并且其中所述突变株具有保留的或进一步改善的表征DSM 21062的抗炎效应、胆汁耐受性和/或EPS表达。
2.权利要求1的菌株，其中共培养Caco-2细胞(ATCCHTB-37)的体外培养层与所 述菌株引起所述Caco-2细胞层的紧密联结统计上显著的加强，所述紧密联结测量为所述 Caco-2细胞层在暴露于紧密联结破坏剂癸酸钠后所述Caco-2细胞层的跨上皮电阻。
3.根据前述权利要求任一项的菌株，其中所述菌株还能够抑制致病菌株的生长。
4.根据权利要求1至3任一项的菌株，其中所述菌株产生相对富含甘露糖残基的EPS， 测得Glu-N 甘露糖比为40或更高。
5.根据权利要求1至4任一项的菌株，其中所述菌株产生相对富含葡萄糖残基的EPS， 测得Glu-N 葡糖糖比为50或更高。
6.包含根据前述权利要求任一项的细菌细胞的菌株或所述细胞的部分的组合物用于 制备药物的用途。
7.包含根据权利要求1至5任一项的细菌细胞的菌株或所述细胞的部分的组合物用于 制备治疗哺乳动物胃肠道炎症的药物的用途。
8.人类或宠物食物组合物，其包含至少一种权利要求1至5任一项的细菌细胞的菌株。
9.一种起子培养物组合物，其包含权利要求1至5任一项的细菌细胞，优选其中所述 起子培养物组合物具有一定浓度的活细胞，该浓度在每克所述组合物IO4至IO12CFU的范围 内。
10.一种制备食品或饲料产品的方法，该方法包括将根据权利要求9的起子培养物添 加到食品或饲料产品起始材料中并将由此接种的起始材料保持在所述乳酸菌代谢活跃的 条件下。
11.从权利要求1至5任一项的长双歧杆菌菌株分离的多糖。
全文摘要
本发明涉及新的长双歧杆菌益生抗炎菌株，其用于预防、减轻或治疗疾病以及用于制备人类或宠物食品的用途，或药物组合物。所述菌株产生大量具有高含量的甘露糖和葡萄糖残基的胞外多糖。因此，本发明还涉及由所述菌株获得的细菌多糖组合物，其用于治疗疾病的用途，以及包含此类多糖的药物组合物。
文档编号C12R1/01GK102089422SQ200980127197
公开日2011年6月8日 申请日期2009年7月6日 优先权日2008年7月11日
发明者延斯·基尔德斯加德, 托马斯·冈纳森, 托马斯·简森, 托马斯·达尔曼·莱泽, 梅特·魏泽, 班奈迪特·佛林巴尔德, 玛丽·福克恩伯格 迪特 申请人:科.汉森有限公司
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0185063... 来自[中国] 2021年05月20日 16:51双岐杆菌的制作能提供成套设备吗？
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